Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 10
1.1. Роль железа в жизнедеятельности растений 10
1.2 Содержание и формы Fe в почвах и механизмы поступления в растения 10
1.3. Возможные последствия излишнего накопления Fe в растениях и механизмы поддержания его гомеостаза 15
1.4. Ферритин: ультраструктурные особенности и функции в живых организмах 16
1.4.1. Ферритины прокариот 17
1.4.2. Ферритины животных 18
1.4.3. Ферритины растений 21
1.4.3.1. Особенности строения ферритина у растений по данным молекулярных исследований 23
1.4.3.2. Биосинтез ферритина у растений 24
1.4.3.3. Компартментация ферритина в клетках и тканях растений и регуляция образования ферритина по данным электронной микроскопии 26
1.4.3.4. Молекулярные механизмы регуляции биосинтеза ферритина...27
1.4.3.5. Влияние избытка и дефицита железа на биосинтез ферритина..31
1.4.3.6. Исследование биосинтеза и деградации ферритина в связи с развитием окислительного стресса 35
ГЛАВА 2. Объект и методы исследований 42
2.1. Объект и условия выращивания растений в водной культуре 42
2.2. Методы биохимических анализов 45
2.2.1. Определение содержания МДА 45
2.2.2. Определение содержания перекиси водорода 46
2.2.3. Определение активности СОД 46
2.2.4. Определение активности пероксидазы 47
2.2.5. Определение активности каталазы 48
2.2.6. Определение содержания пролина 49
2.2.7. Определение содержания белка в ферментных препаратах 50
2.2.8. Приготовление проб для определения содержания общего железа.51
2.2.9. Содержание хлорофилла (а + Ь) 51
2.2.10. Фиксация проб для электронно-микроскопических исследований52
2.2.11. Проведение молекулярных анализов 53
2.2.11.1. Выделение тотальной РНК фенол-хлороформным методом...53
2.2.11.2. Очистка тотальной РНК от примесей ДНК 54
2.2.11.3. Обратная транскрипция 55
2.2.11.4. Подбор праймеров для проведения обратной полимеразной цепной реакции (ПЦР) 55
2.2.11.5. Условия проведения ПЦР-анализа 56
2.2.11.6. Подготовка проб для секвенирования нуклеотидных последовательностей генов ферритина 58
2.2.12. Проведение Вестерн-блоттинга для иммунодетекции ферритина. 59
2.2.12.1. Экстракция белков из тканей растения 59
2.2.12.2. Проведение электрофореза в полиакриламидном геле 60
2.2.13. Математическая обработка данных 63
ГЛАВА 3. Развитие окислительного стресса и образование отложений ферритина в листьях хрустальной травки при действии засоления и различных доз железа 64
3.1. Ответная реакция молодых растений на изменение содержания Fe в питательной среде 64
3.2. Ответная реакция взрослых растений на изменение содержания Fe3+ в среде выращивания в контрольных условиях и при засолении NaCl 65
3.3. Дозовая зависимость изменения в листьях содержания железа и состояния окислительного стресса в пресных условиях и в присутствии NaCl 70
3.4. Влияние дефицита и "избытка" Fe на состояние мембран, запасные включения и образование ферритина в пластидах в присутствии и в отсутствии в среде NaCl 75
ГЛАВА 4. Влияние окислительного стресса на экспрессию генов и содержание белка Ферритина 80
4.1 Идентификация генов ферритина, экспрессирующихся в листьях Mesembrianthemum crystalliniim L 80
4.2. Состояние экспрессии генов в листьях при дефиците железа и его избытке 83
4.3. Влияние про-оксиданта параквата на экспрессию генов ферритина 86
4.4. Влияние обработки листьев спермидином на экспрессию генов 92
Заключение 96
Выводы 101
Список литературы 103
- Исследование биосинтеза и деградации ферритина в связи с развитием окислительного стресса
- Подготовка проб для секвенирования нуклеотидных последовательностей генов ферритина
- Ответная реакция взрослых растений на изменение содержания Fe3+ в среде выращивания в контрольных условиях и при засолении NaCl
- Состояние экспрессии генов в листьях при дефиците железа и его избытке
Введение к работе
Актуальность проблемы. Fe - эссенциальный элемент для растений. Fe необходимо растениям для функционирования фотосинтеза и дыхания, в которых в качестве переносчиков электронов участвуют железосодержащие и железосерные белки такие как, ферредоксин, цитохромы и другие. Как кофактор Fe входит в состав многих антиоксидантных ферментов (Fe-супероксиддисмутаза, пероксидазы, каталаза) и участвует в образовании предшественника хлорофилла.
Однако, ярко выраженная способность этого металла в восстановленной форме
9-І-
(Fe ) вступать в реакции с кислородом с образованием гидроксил радикала (ОН) -самого токсичного из АФК, создает необходимость у всех аэробных организмов, в том числе и у растений, поддерживать в клетках гомеостаз железа, не допускающий
9-І-
накопления его "каталитической" формы (Fe ). Такое нарушение гомеостаза железа у растений может возникать в стрессорных условиях, индуцирующих окислительный стресс (Hernandes et al., 2001).
Одним из уникальных механизмов, препятствующих проявлению токсичности
9+
Fe при его избыточном образовании в клетках, может являться функционирование у всех живых организмов, за исключением дрожжей, железосодержащего белка негеминовой природы ферритина, запасающего Fe в окисленной нетоксичной форме (Fe ). К настоящему времени гены, ответственные за биосинтез ферритина, клонированы и охарактеризованы у ряда видов растений: кукурузы, гороха, сои, люпина, риса и арабидопсиса. У растений ферритин локализован в хлоропластах (Perrin, 1970; Парамонова и др., 2004; 2007), реже в митохондриях (Zancani et al., 2004) и отсутствует в цитоплазме. Структура ферритина в пластидах растений отличается от ферритина животных и бактерий наличием в минеральном ядре не только железа, но и фосфора в соотношении P:Fe (1:3) (Waldo et al., 1995). Главное отличие ферритинов растений от животных состоит в том, что синтез ферритина у животных регулируется на трансляционном уровне в ответ на избыток железа, а у растений - на транскрипционном уровне (Briat et al., 2009). В поддержании гомеостаза Fe у растений участвует множество генов (42 гена у риса), включая гены
_i_Q
транспорта ZIP (транспотер Fe и Zn) и гены FRO, кодирующие Fe -хелат редуктазы оксидазы (Vert et al., 2002).
Долгое время образование отложений ферритина в пластидах растений рассматривали как запасную форму железа (Hyde et al., 1963). В последнее время изучение функций ферритина рассматривается в связи с защитой от окислительного стресса, как у растений, так и у животных (Андреев, 2004; Theil and Briat, 2004).
Однако до сих пор отсутствуют исследования по изучению взаимосвязи образования ферритина у растений, испытывающих окислительный стресс при действии абиотических факторов.
Цель исследования. Цель настоящей работы - исследовать зависимость накопления ферритина в листьях факультативного галофита Mesembryanthemum crystallinum L. от содержания железа в питательном растворе и интенсивности окислительного стресса.
Задачи исследования:
Определить дозовую зависимость поглощения железа растениями М. crystallinum L. в контрольных условиях культивирования и в присутствии 300 мМ NaCl.
Исследовать основные биохимические параметры: активность антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутаза, пероксидаза), содержание пролина, хлорофилла и интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ), характеризующие взаимосвязь между состоянием окислительного стресса и гомеостазом железа у галофита М. crystallinum, в зависимости от статуса железа, засоления и их совместного действия.
Изучить зависимость отложения ферритина и его ультраструктурные особенности в пластидах мезофилла листьев от статуса железа в контрольных условиях и при засолении с помощью электронной микроскопии.
Идентифицировать мРНК генов ферритина у хрустальной травки с помощью метода ОТ-ПЦР и секвенировать продукты ПЦР.
Оценить уровень экспрессии генов ферритина в листьях методом ОТ-ПЦР и Вестерн-блоттингом в зависимости от статуса железа и развития окислительного стресса.
Исследовать влияние про-оксиданта метилвиологена (параквата - PQ) - индуктора окислительного стресса в пластидах, и антиоксиданта полиамина спермидина (Спд) на экспрессию генов ферритина и содержание белка в листьях.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное изучение образования ферритина у факультативного галофита Mesembryanthemum crystallinum L. (хрустальная травка) в зависимости от уровня железа в питательной среде и интенсивности окислительного стресса.
Показано, что внесение NaCl (300 мМ) в питательную среду резко снижало
Q_i_
поступление железа (Fe -ЭДТА) в растения и предотвращало появление симптомов токсичности при его избытке (750-1000 мкМ). Впервые установлено, что адаптация растений М. crystallinum к засолению сопровождала повышение устойчивости к
избытку железа, что свидетельствует о проявлении кросс-адаптации к двум стресс-
факторам. Впервые с помощью электронно-микроскопического анализа
продемонстрирована прямая зависимость уровня отложений ферритина в мезофилле
листьев от содержания в них железа и интенсивности окислительного стресса. В
листьях М. crystallinum впервые установлена экспрессия не менее двух генов
ферритина (McFer), один из которых является ортологом Ten&AfFerl арабидопсиса и
проявляет сходство по уровню экспрессии на окислительный стресс и избыток Fe.
Показано, что индукция паракватом (PQ) образования супероксид-радикала и перекиси водорода в листьях хрустальной травки повышала уровень мРНК генов ферритина и содержание белка. Напротив, спермидин, обладающий антиоксидантным свойством, тормозил экспрессию генов ферритина. Впервые экспериментально показано, что окислительный стресс индуцировал образование отложений ферритина в листьях хрустальной травки. Это указывает на антиокидантную роль ферритина, связывающего восстановленную форму железа (Fe ) - катализатора образования ОН.
Теоретическая и практическая значимость. Детекция ферритина в листьях галофита М. Crystallinum, способы регуляции его содержания могут использоваться при создании трансгенных растений со сверхэкспрессией ферритина. Теоретические обобщения и совокупность экспериментальных данных работы могут использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов ВУЗов страны.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на годичном собрании общества физиологов растений России, Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений», Екатеринбург (2008 г); годичном собрании общества физиологов растений России, Международной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего Севера», Апатиты, Мурманская область (2009 г); Всероссийской конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск (2009 г).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из которых 1 - статья в журнале «Физиология растений».
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 121 страницах машинописного текста и содержит 2 таблицы, и 30
Исследование биосинтеза и деградации ферритина в связи с развитием окислительного стресса
У гороха и A. thaliana, ферритин накапливался в семядолях и зародышах семян, в то время как количество ферритина в вегетативных органах было небольшое (Lobreaux and Briat, 1991; Petit et al., 2001a). Наблюдался посттранскрипционный контроль в стабильности уровня белка, в регуляции количества ферритина в семенах. Исчезновение белка ферритина у зародыша семян гороха в течение первых дней после прорастания сопровождалось появлением полипептидов с более низкой мол.м., чем основная субъединица ферритина (Lobreaux et al., 1991). На основе экспериментов in vitro был предложен механизм, ответственный за этот специфический процесс (Laulhere et al., 1989; 1990).
Другой пример контроля синтеза ферритина, связанного со стадиями развития растений относится к листьям. Так, в исследованиях Ragland с соавторами было обнаружено, что концентрация мРНК во взрослых листьях сои была выше, чем в молодых (Ragland et al., 1990). В то же время у кукурузы высокий уровень ферритина был обнаружен в самых молодых частях листа, тогда как в средней части этого органа концентрация ферритина была минимальной (Theil and Hase, 1993). Некоординированное изменение в концентрациях мРНК и белка также были обнаружены в клетках листа на различных стадиях его развития, что подтверждает гипотезу, что посттранскрипционный контроль, вероятно, является также важным уровнем регуляции синтеза ферритина в процессе развития растений (Theil and Hase, 1993).
У представителя двудольных растений A. thaliana, ферритины закодированы четырьмя генами небольшого семейства. Анализ тканеспецифичной экспрессии каждого из этих генов на транскрипционном уровне и кинетика этого процесса во время жизненного цикла растений увеличивалась прямо пропорционально (Petit et al., 2001а). Транскрипты мРНК генов AtFerl и AtFerS присутствовали в розетках листьев, их количество увеличивалось на более поздних стадиях развития. В корнях, концентрация мРНК гена AtFerl была высокой на всех трех стадиях развития растения в отличие от гена AtFerS. В то же время мРНК генов AtFerl и AtFer3 присутствовала в тканях только во время ранних стадий прорастания. Уровень экспрессии гена AtFer2 заметно отличался от экспрессии генов AtFerl и AtFerS, а самый высокий уровень их транскриптов был обнаружен в стручках и зрелых семенах, где отсутствовали транскрипты других генов AtFer. Напротив, мРНК AtFerl не была обнаружена в корнях, розетках листьев, боковых побегах стебля, стебле, цветках, незрелых или прорастающих семенах. Было также найдено, что экспрессия гена AtFer2 активировалась в ответ на действие АБК также как и у его ортолога кукурузы ZmFer2 (Lobreaux et al., 1993). Регуляция экспрессии AtFer4 имеет тканеспецифичную направленность на этапе формирования репродуктивных органов растений и этим отличается от описанной выше особенности транскрипции других трех генов. Его высокая экспрессия ограничивается цветоножками и цветками, и достигает максимума после опыления, в остальных частях наличие транскриптов отмечалось в «следовых» количествах (Petit et al., 2001а).
На уровне белка, иммунодетекция субъединиц ферритина проводили с помощью Вестерн-блоттинга, белки выделяли из листьев и семян различных мутантов этих генов (Ravet et al., 2009). Эти исследования позволили авторам заключить, что только AtFerl существует, главным образом, как зрелая субъединица с молекулярной массой 28-кДа и что присутствие этого белка наиболее характерно для листьев. Также авторам удалось обнаружить белки с молекулярной массой в 26.5-кДа (зрелый белок) генов AtFer3 и AtFer4 только в листьях. Наконец, только одна субъединица ферритина (26,5 кДа) представлена в семенах, которая закодирована геном AtFerl. Интенсивность био синтеза белка ферритина была в соответствии с данными по экспрессии гена AtFer2 (Petit et al., 2001a). Необходимо отметить, что у арабидопсиса субъединичный состав белков ферритина был идентичен ферритину гороха (Laulhere et al., 1989; Lobreaux et al., 1991) и сои (Masuda et al., 2001). Субъединицы ферритина синтезировались из общего предшественника (32-кДа), который содержит уникальную N-терминальную последовательность, состоящую из двух областей, отсутствующих у ферритинов животных. Первая область состоит приблизительно из 40-50 остатков, это так называемый транзитный пептид, вовлеченный в транспорт предшественника ферритина в хлоропласт. Вторая область - часть зрелого белка, и называется "extension" пептид. Как было сказано выше, его функции могут быть связаны со стабильностью белка, и "extension" пептид может быть разрезан во время процесса прорастания гороха под действием свободно-радикальных взаимодействий (Lobreaux et al., 1991; Van Wuytswinkel et al., 1995).
Были предложены также другие механизмы процессинга субъединиц ферритина. Так секвенирование чистого ферритина семян сои позволило обнаружить две субъединицы, Н-1 и Н-2 (Masuda et al., 2001). Н-2, субъединица с мол.м. 28-кДа, не подвергалась процессингу, тогда как у Н-1 был усечен С-конец из 17 аминокислотных остатков, что, по всей видимости, приводило к образованию полипептида с мол.м. 26.5-кДа. Разрезание происходило после остатка аргинина, который отсутствовал в Н-2 (Рис. 5). У A. thaliana субъединица белка 28-кДа, кодируется геном AtFerJ, тогда как субъединицы, закодированные генами AtFer2, AtFer3 и AtFer4 представлены только как полипептиды в 26.5-кДа мол.м (Ravet et al., 2009). Выравнивание части С-конца четырех ферритинов арабидопсиса с субъединицами Н-1 и Н-2 сои показали, что остаток аргинина у полипептида Н-1 присутствует в FER2, FER3 и FER4, но отсутствует в FER1 (Рис. 5). Этот результат был совместим с наблюдением, полученным с ферритином сои (Н-1), что указывало на то, что расщепление С-конца могло произойти именно в месте остатка аргинина.
Подготовка проб для секвенирования нуклеотидных последовательностей генов ферритина
Для экстракции белков брали навеску листьев (200-300 мг), растирали в жидком азоте. Добавляли экстракционный буфер (600-650 мл) (Tris-HCl рН8, 50mM; Saccharose 10%; SDS 5%; р-МеЕЮН 5%; EDTA 25mM; Orthophenanroline 0,1%; PMSF ІтМ (добавляли в экстракционный буфер непосредственно при экстрагировании). Сток ЮОтМ PMSF: 87 мг растворяли в 5 мл абсолютного спирта. Хранили аликвоты при -20 С. Далее центрифугировали при 13000 g. Белковый экстракт аликвотировали и хранили на- 20С.
Для определения концентрации белков брали 100 мкл этого белкового экстракта. Добавляли 500 мкл 30% ТХУ и 400 мкл Н20. Оставляли на осаждение в течение 15 мин на льду. Центрифугировали 10 мин при 13000 g. Удаляли супернатант и добавляли 1 мл 80% охлажденного ацетона, перемешивали на вортексе. Центрифугировали 10 мин 13000 g. Процедуру повторяли еще раз. Далее осадок растворяли в 100 мкл 1Н NaOH, добавляли 900 мкл Н20. Концентрацию белков определяли по методу Бредфорд (Bradford М.М., 1976). На 50 мкл ферментного препарата смешивали с 500 мкл реактива Брэдфорда (10 мг Кумасси R-250, 5 мл 95% этанола, 10 мл 85% Н3РО4 довести дистиллированной водой до 100 мл) и 450 мкл H2OmjiHQ- Измерение оптической плотности проводили при 595 нм. В контрольный образец вместо ферментного препарата добавляли такой же объем воды. Концентрацию белка рассчитывали, используя калибровочную кривую, построенную по БСА.
Проведение электрофореза в полиакриламидном геле Электрофорез белковой фракции в денатурирующих условиях проводили в полиакриламидном геле по стандартной методике (Laemmli U.K., 1970) на приборе Bio-Rad «Mini protein 3», США.
После полимеризации геля (таблица 2) четыре объемные фракции белкового экстракта 20-25 мкг (использовали из аликвотированных образцов) смешивали с одной частью загрузочного буфера (0,25М Трис-HCl рН=6,8; 5% SDS, 50% глицерин, 0,05% бромфенолового синего) и денатурированного при 96С в течение 5 мин. Параллельно электрофорез проводили на двух пластинках, один использовался для дальнейшего блоттирования и гибридизации с антителами, второй гель окрашивали для контроля. Электрофорез проводили при +4С при силе тока равной 0,01 А в концентрирующем геле и 0,03 А в разделяющем геле. Средняя продолжительность электрофореза составляла 2,5-3 часа (до тех пор, пока бромфеноловый синий не выйдет из геля в буфер). Для проведения электрофореза использовали электродный буфер по Laemmli (0,1М Трис-HCl; 0,384М глицин).
После завершения электрофореза гели снимали со стекол, одну гелевую пластинку переносили на мембрану и использовали для дальнейшего блотти-рования, вторую гелевую пластинку заливали окрашивающим раствором Staining solution в течение 30 мин (0,025% Coomassie Brilliant blue R250, 45% метанол, 10% уксусную кислоту, 45% Н20) для контроля загрузки (оценка того, что во всех образцах было взято одинаковое количество белка). Далее гель промывали, использовали два разных отмывочных раствора: Destaining solution 1 (40% метанол, 7% уксуная кислота, 53% Н20), Destaining solution 2 (5% метанола, 7% уксуная кислота, 88% Н20). После отмывки гелевую пластинку фотографировали. Вестерн-блоттинг проводили по То win (Towin, 1979). Для этого гелевую пластинку вымачивали 10 мин в блоттинговом буфере (25мМ Трис-НС1, 192 мМ глицин, 0,01% SDS, 20% метанол). Нитроцеллюлозную мембрану (Nitrocellulose Membrane, BIO-RAD) вымачивали в воде в течение 10 секунд, затем инкубировали в блоттинговом буфере в течение 10 мин. Электроблот-тинг осуществляли в течение 2 ч при напряжении 15 В. Эффективность переноса оценивали, окрашивая нитроцеллюлозную мембрану 0,1%-ым раствором (вес/объем) Понсо С в 5% уксусной кислоте в течение 5 мин. Избыток краски удаляли под проточной дистиллированной водой. Затем мембрану отмывали трижды по 5 мин в 0,05% (вес/объем) растворе Твин-20, приготовленном на PBS-буфере (PBST), и блокировали в растворе, содержащем PBS-буфер, 0,05% (вес/объем) и 2% (вес/объем) БСА в течение 1 ч при постоянном перемешивании при комнатной температуре и после этого отмывали дважды по 10 мин в PBST буфере и 10 мин в PBS. Затем мембрану инкубировали с первичными кроличьими поликлональными антителами на ферри-тин любезно предоставленными Dr. J-F Briat (Laboratoire de Biochimie et Physiologie Molecullaire des Plantes, Montpellier, France). После инкубации мембрану оставляли на ночь при +4С. На следующий день мембрану отмывали аналогично описанному выше процессу. После этого проводили реакцию с вторичными антителами, коньюгированными пероксидазой хрена при комнатной температуре в PBST буфере в течение 1 ч. Далее следовала аналогичная отмывка, но третью проводили уже в детекционном буфере (100 мМ Трис-НС1, рН 7,5). Затем мембрану переносили в 10 мл детекционного буфера со 100 мкл 40% ДАБ в растворителе ДМСО, 15 мкл 3% Н202- В ходе инкубации происходило окрашивание тех мест на мембране, где произошла гибридизация с вторичными антителами, благодаря тому, что к ним пришита пе-роксидаза (Goat Anti-Rabbit IgGrHRP, «Stressgen», Канада). Далее блокировали в дистиллированной воде и фотографировали.
Все опыты проводили в трехкратной биологической повторности. Результаты обрабатывали статистически и выражали как среднюю арифметическую и ошибку репрезентативности среднего квадратичного отклонения (Зайцев, 1984).
Ответная реакция взрослых растений на изменение содержания Fe3+ в среде выращивания в контрольных условиях и при засолении NaCl
Обнаруженные различия в ростовой активности растений и содержании в листьях хлорофилла (рис. 126) были обусловлены изменением содержания Fe3+ в последние 15 дн их культивирования. До этого растения в течение 21 дня произрастали на среде с достаточно высокой дозой железа (6 мкМ Fe -ЭДТА). По этой причине у взрослых растений дефицит Fe не проявился в полной мере при культивировании на среде без железа в последние 15 дн, поскольку запасный пул Fe у них не успевал израсходоваться (рис. 12а). Тем не менее, самое яркое проявление хлороза наблюдалось у вторичных листьев взрослых растений, также произраставших предварительно на среде с 6 мкМ Ре3+-ЭДТА, а затем в течение 15 дн на среде без Fe, но в условиях засоления (рис. 11д, 12а), что положительно коррелировало с резким падением в них содержания хлорофилла (рис. 12а). Вместе с тем, низкое содержание хлорофилла в листьях в условиях дефицита и даже "избытка" Fe могло иметь общую причину, связанную с развитием в условиях засоления окислительного стресса, поскольку наиболее интенсивно генерация АФК идет на сопрягающих мембранах хлоропластов. Одним из свидетельств развития повреждений в клеточных мембранах, вызванное накоплением АФК, является повышение интенсивности ПОЛ. В листьях растений, произраставших в течение 15 дн на фоне избыточного содержания Fe, интенсивность ПОЛ была выше контрольного уровня (рис. 126 (18 мкМ Fe -ЭДТА)), тогда как в присутствии NaCI как при дефиците Fe так и, особенно при его "избытке" уровень МДА снижался (рис. 126), т.е. засоление каким-то образом корректировало интенсивность ПОЛ.
Обращает на себя внимание тот факт, что уровень Fe в питательной среде, не содержавшей NaCl, практически не влиял на количество в листьях пролина — важного стресс - индуцируемого метаболита, в то время как в корнях ярко проявилась аккумуляция пролина при дефиците Fe в среде (рис. 12в). При дефиците Fe в присутствии NaCl на фоне стресс-индуцируемой аккумуляции пролина наиболее высокое его содержание отмечено в листьях (рис. 12в), что могло быть связано также с проявлением дефицита железа.
Что касается изменения окислительного метаболизма, то, как видно из рисунка 13а, бщая активность СОД в листьях в отсутствие NaCl в питательной среде повышалась как в варианте с дефицитом, так и с «избытком» Fe (Рис. 13а). В условиях засоления самая низкая активность этого фермента была в листьях в контроле (6 мкМ Fe -ЭДТА), а самая высокая активность обнаруживалась в отсутстствие в среде Fe (рис. 13а). В полном соответствии с уровнем СОД в листьях изменялась активность свободной ПО при дефиците и в присутствии железа в среде без засоления (рис. 136). В то же самое время содержание перекиси водорода - продукта реакции дисмутации, катализируемой СОД, не коррелировало с изменениями активностей СОД и ПО (рис. 13а, 136). При дефиците Fe содержание Н202 снижалось почти в 2 раза по сравнению с контролем, что нельзя объяснить нейтрализацией пероксида ПО и каталазой. В этом случае активность свободной ПО в листьях при дефиците Fe незначительно отличалась от контроля, а активность каталазы была значительно ниже (данные по каталазе не приведены). Можно предположить, что при дефиците Fe пероксид, образовавшийся в пластидах как продукт функционирования СОД, транспортировался в корневую систему, на что указывает его повышенное содержание в корнях (рис. 13в). Подобная же закономерность наблюдалась и в присутствии Fe (рис. 13в).
Варьирование уровня Fe в питательной среде на фоне засоления сопровождалось более выраженными изменениями активности СОД в листьях, но не в корнях (рис. 13а). Так в листьях при контрольном уровне Fe в среде NaCl ингибировал активность СОД, тогда как при дефиците Fe активность данного фермента в листьях, напротив, резко возрастала. При этом в условиях засоления в листьях при изменении снабжения растений Fe полное соответствие в колебаниях активностей наблюдалось у СОД и ПО (рис. 13а, 136). Содержание в них же пероксида было самым высоким в листьях контрольных растений, где засоление ингибировало активность СОД, и самым низким в листьях растений, выращенных на среде с "избытком" Fe (рис. 13в). При всех режимах обеспечения растений Fe (дефицит или избыток) корни содержали практически всегда повышенный уровень Н2О2, что не коррелировало с активностью в них всех форм ПО, которая конститутивно почти в 10 раз была выше в корнях, чем в листьях (рис.ІЗг). Возможно, в корни пероксид поступал из листьев. В целом можно заключить, что самый высокий эндогенный уровень пероксида в листьях наблюдался при дозе железа 6 мкМ Fe -ЭДТА в усло-вих засоления.
Состояние экспрессии генов в листьях при дефиците железа и его избытке
Проведенные исследования показали, что у растений хрустальной травки различный статус доступной формы железа в питательной среде (комплекс Ре3+-ЭДТА) резко изменял интенсивность ПОЛ и активность антиоксидантних ферментов. В листьях онтогенетически взрослых растений, находящихся в фазе перехода на САМ-тип фотосинтеза, судя по активностям СОД, свободной формы гваяколовой ПО и содержанию пролина как "ловушки" АФК, окислительный стресс был наиболее интенсивным при совместном действии засоления и дефицита Fe. Об активации окислительного стресса свидетельствует также нарушение биосинтеза хлорофилла.
Гораздо менее выраженные изменения окислительного метаболизма в листьях хрустальной травки наблюдались при совместном действии засоле-ния и Fe (18 мкМ Fe -ЭДТА). Однако в присутствии в среде NaCl в этих условиях снижение содержания хлорофилла в листьях было более выражено, чем при дефиците Fe, что можно объяснить торможением поступления железа в растения в условиях засоления и более активной тратой глутамата в биосинтезе пролина. Активность СОД - индикатора образования супероксид аниона, также понизилась в листьях в присутствии Fe по сравнению с условиями дефицита Fe.
Изменение содержания в листьях Н2О2 — продукта дисмутации супероксида, катализируемого СОД, и возможного регуляторного сигнала для экспрессии одного из генов ферритина, в значительной степени зависит от его транспорта на уровне организма.
Найденные с помощью электронной микроскопии скопления ферритина, контактирующие с крупными пластоглобулами в пластидах в варианте с 18 мкмоль Ре3+-ЭДТА в питательной среде свидетельствуют о стимулирующем действии этого металла на образование ферритина в условиях активного проявления окислительного стресса. Наряду с этим скопление крупных пластог-лобул, служащих резервом липидов и белков и контактирующих с феррити-новыми глобулами, может указывать на необходимость повышенного уровня Fe в листьях для поддержания синтеза липидов в пластидах. О том, что экзогенная Н2О2 способна повышать экспрессию гена ферритина на уровне мРНК у растений, имеются данные литературы (Petit et al., 2001а). Следует подчеркнуть, что уровень накопления Н202у хрустальной травки (0.13 мкмоль/г сырой массы) в варианте 6 мкмоль Fe на фоне засоления отвечает гипотезе о ее сигнальной роли. Как недавно показано в нашей лаборатории (Kuznetsov et al., 2009) в корнях взрослых растений хрустальной травки в экстремальных условиях, вызвавших окислительный взрыв при введении экзогенного кадаверина, ингибирующее действие Н2О2 достигалось при содержании 40-80 мкмоль/г сырой массы.
Одной из NaCl-индуцируемых ответных реакций хрустальной травки является аккумуляция пролина, что долгое время связывалось с действием пролина в основном как осморегулятора. Однако высокое содержание пролина в корнях этого растения, обнаруженное нами при дефиците железа в отсутствие засоления, нельзя объяснить осморегуляторным действием этого защитного метаболита. Высокое содержание пролина в листьях и корнях при развитии окислительного стресса в варианте "контроль + NaCl", а также в листьях в варианте "дефицит Fe+NaCl" могла свидетельствовать в пользу выполнения им антиоксидантной функции, которая проявляется в стрессовых условиях у галофитов (Шевякова и др., 2009).
Слабо выраженные повреждения в пластидах, вызванные АФК, были также обнаружены у растений, произраставших в условиях дефицита Fe и в отсутствии засоления. При этом в обоих отмеченных выше случаях в пластидах не были обнаружены какие-либо скопления отложений ферритина. На этом основании можно высказать предположение, что при дефиците Fe, сопровождаемом окислительным стрессом, ферритин, образовавшийся при культивировании растений в течение 16 дней в присутствии Fe (6 мкМ Fe -ЭДТА), мог деградировать с освобождением каталитически активной "сво-бодной" формы Fe . Тем более ранее (Парамонова и др., 2007) была обнаружена частичная деградация ферритина даже при нормальном содержании Fe в среде и превращение его в фитосидерин в хлоропластах клеток обкладки, в сопровождающих клетках флоэмы и других паренхимных клетках тонких окончаний листьев хрустальной травки в условиях засоления, индуцирующего окислительный стресс. В этих исследованиях ферритин и фитосидерин обнаруживались также в ситовидных трубках, что могло свидетельствовать о способности Fe транспортироваться по растению в составе белкового комплекса. Из литературы по механизмам деградации ферритина в патологических случаях у человека следует, что ферритин в условиях повышенного образования супероксид аниона освобождал до 70% "свободного" Fe и становился источником "каталитического" Fe (Theil and Hase, 1993). В этом случае Fe усиливал супероксид-зависимую пероксидацию липидов, фосфо-липидов и окисление белков, что характерно при склерозе сосудов у человека (Cormoly and Guerinot, 2002). То, что дефицит Fe ведет к повышению окислительного стресса в клетках, в результате снижения активности Fe-содержащих форм ПО и значительному увеличению в них содержания H2C 2, показано на примере растений подсолнечника (Ranieri et al., 2001).
В этой связи образование в пластидах ферритина при повышенном поступлении в растения железа может указывать на проявление им функции "скавенджера" образующегося в пластидах излишка железа. Роль ферритина в запасании Fe и поддержании его гомеостаза в растениях, не допускающих аккумуляции в клетках его токсической формы, рассматривается во многих работах (Gross et al.,2003).
При исследовании дозовой зависимости действия железа в диапазоне 6- lOOOMKMFe -ЭДТА в составе хелатного комплекса было показано, что резкое неконтролируемое повышение эндогенного уровня железа происходило в листьях в контрольных условиях, начиная со 150 мкМ Fe, что повлекло нарушение проницаемости мембран из-за повышения интенсивности ПОЛ и появление признаков токсикоза железа. В то же время в условиях засоления (300 мМ NaCl) поступление Fe в растения ингибировалось во всем диапазоне его концентраций в питательной среде, что создавало более оптимальные условия для жизнедеятельности растений.
Совокупность полученных данных показала, что избыток железа, даже если оно интенсивно поступает в растения в доступной форме, может привести к сильным повреждениям. Впервые показано, что внесение NaCl (300 мМ) в питательную среду резко снижало поступление железа (Fe -ЭДТА) в растения и предотвращало появление симптомов токсичности при его избытке (750-1000 мкмоль). Этот эффект можно квалифицировать как проявление механизма кросс-адаптации, обнаруженного ранее (Кузнецов, 1990; Волков и др., 20066).
Вместе с тем, для получения более полной информации о взаимосвязи между накоплением ферритина и развитием окислительного стресса в стрес-сорных условиях необходимо было провести исследования по идентификации генов, отвечающих за синтез ферритина, и изучить изменения, происходящие на уровне мРНК и содержании белка в зависимости от окислительного стресса и содержания железа.
