Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Теоретическую основу абсолютна всей методологии культуры клеток и тканей, в том числе и клоналыюго мнкроразм-ножения. составляют морфогенез и регенерация растении. Однако, несмотря на имеющиеся экспериментальные работы, посвященные изучению процессов морфогенеза и регенерации в культуре in vitro, клональное микроразгаюжениа представляет немало сложностей, состоящих в отсутствии четких хорошо восп-производимых методик, их трудоемкости и сложности, а также в недостаточных знаниях морфогенетических потенций растений и способов управления ими в культуре клеток и тканей. К таким растениям принадлежат интродуцированные сорта голубііки високой и брусники обыкновенной, для которых процессы морфогенеза и регенерации а культуре in vitro практически не изучены.
Исследование процессов морфогенеза и регенерации сортов этих растений а культуре клеток и тканей, а также структурно-функциональных особенностей регенерантоз и адаптации их при переходе из условий культуральных сосудов в условия оранжереи и открытого грунта, позволит внести существенный вклад в разработку теоретических основ и путей практического использозания тонального микроразмножения растений в целом, а также таких ценных плодово-ягодных культур, какими являются иптродуцкрованиые сорта голубики высокой и брусники обыкновешюй, в частности.
Традиционно клональное мтфоразмножение принято рассматривать как метод, состоящий из соответствующих процедур: введение экспланта в стерильную культуру, собственно микроразмножениз, укоренение регенерантов на питательной среде, перенос их в нестерильные условия. В большинстве случаев клональное микроразмножение сводится к "инструменту1,' с помощью которого можно получить материал в неограниченном количестве.
Новизна постановки вопроса, связанного с клональным микроразмножением растений, состоит в рассмотрении его не только как метода, а как единого сложного многофакторного физиологического процесса, состоящего из двух принципиально разных этапов: in vitro (в условиях стерильной культуры) и in vivo (в условиях оранжереи и открытого грунта), базирующегося на единой теоретической основе, с одной стороны, на морфогенезе и регенерации в условиях in vitro, с другой, на сгруктурно-фупкциоихчъи'оЯ адаптации регенерантов а условиях in vivo, что позволит создать теоретические предпосылки и разработать совершенную технологию кленальнсго микроразмножения для любого вида растеїшя в целом, а также для интродуцированных сортов голубики высокой ч брусники обыкновенной в частности.
Связь работы с крушікш научными программами, темами. Проведенные исследования входили в плановые теми Центрального ботанического сада Академии наук Беларуси, координируемые Научныл советом по проблеме "Продуктивность растений" (Я" госрегистрации 0190010215)і
"Разработка научаах основ промышленного выращивания интродуцированных плодово-ягодных растений сем.Брусничные в условиях Беларуси" (№ госрегистрации О190ОО21954)»
"Разработка технологии клонального пнкроразмножения интродуцированных плодово-ягодных и декоративных растений" (Р госрегистрации 1994149).
Кроме того, исследования выполнялись в соответствии с республиканской комплексной программой фундаментальных исследований "Биотехнология".
Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в том, чтобы дать научно обоснованное представление о клональном микроразмножении растении как едином многофакторном физиологическом процессе, состоящем из двух принципиально разных этапов! in vitro и in vivo, базирующемся на единой теоретической основе.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачі
изучить влияние многочисленных факторов (стерилизующие соединения, тип акспланта, время года,в которое он был вычленен, генотип, компоненты, содержащиеся в питательной среде) на процесс клонального микроразмнохения интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной в культуре in vitro)
исследовать морфогенез и регенерацию, протекающие у эксплантов на клеточном и субклеточном уровнях на различшос модификациях питательных' сред)
провести анатомо-физиолотаческие исследования реакции регенератов на условия культивирования in vitro и in vivo*
изучить развитие и адаптацій) китродуцировашшх сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, регенерированных в асептической культуре, в условиях оранжереи и открытого грунта;
исследовать влияние осмотических ингибиторов и ретардантов на сохранение хизнеспособнссти регенерантоа, длительно но пересаживаемых на свежие питательные среды.
Научная новизна. Впервые експериментально показано, что клональное кикрорвзмножемие - это не только метод, используемый для ускоренного размножения растений, а вместе с тем, сложный, шогофактсрішй физиологический процесс, контролируемый генетически, состоящий из двух принципиально разных этапов: in vitro и in vivo, базирующийся на единой теоретической основе, С одной стороны—па морфогенезе и регенерации в условиях in vitro, с другой -
на структурно-функциональной адаптации регенерантов в условиях in vivo.
Пересмотрен устоявшийся взгляд о влиянии генотипа на морфогенез и регенерацию растений в культуре in vitro. Выявлена неоднозначная роль генотипа в процессах морфогенеза и регенерации интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной. Отношение генотипа к норфогенезу не является прямым, а комплексный, то есть оказывает свое влияние в совокупности с другими факторами (физиологическим состоянием экспланта, многочисленными компонентами питательной среды, условиями культивирования и др.). Генотип не только служит индикатором способности экспланта к микроразмножению, но и контролирует его потенциальную способность к данному процессу.
Установлено, что морфогенез интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной протекает на фоне сбалансированной питательной среда двух модификаций (WPM и Андерсона), содержащей 4 мг/л ИУК и 15 мг/л 2-иП. Степень регенерационной способности исследованных растений определяется возрастом и типом экспланта, составом питательной среды, соотношением компонентов, содержащихся в ней, а также сортовой и видовой принадлежностью материала. У голубики высоким регенерационным потенциалом обладают ювенильные экспланты, у брусники - зрелые.
На основании результатов экспериментальных исследований, полученных при изучении регенерации интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной на разных уровнях оргамизации-от клетки до целого органа, показана принципиальная возможность регенерировать растения через активацию пазушных меристем, пролиферацию каллуса и образование адвентивных побегов непосредственно из ткани листа.
Получены оригинальные сведения, на основании сравнительного анализа структурно-функциональных особенностей регенерантов в условиях in vitro и in vivo, позволившие показать, что условия культивирования накладывают отпечаток на структуру и функцию регенерантов.
Обнаружены структурно-функциональные различия листьев, выраженных в асептической культуре, в условиях оранжереи и в открытом грунте, свидетельствующие о пластичности листа - органа, способного' перестраивать свою структуру и функцию адекватно условиям культизирования, что теоретически является гарантом успешной адаптации растений в результате переноса их из условий куль-туральных сосудов в условия оранжереи и открытого грунта.
Показана принципиальная возможность предотвращения процессов старения регенерантов интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной в культуре in vitro с помощью осмотических ингибиторов и ретардантов. Установлено оптимальное содержание осмотиков и ретардантов в питательной среде,
" * ~
необходимое для длительного гульгивирования регаїсрагао на протяжении 12 месяцев без пересадок их на сзеше питательные среда.
, Выявлены преимущества интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, регенерировакшж в асептической культуре, по сравнению со своими двойниками, размноженными традиционным черенкованием, заключающиеся в повышенной морозоустойчивое..* н усиленном образовании базальних побегов.
Впервые проведенное комплексное исследование клонального микроразмножения іштродуцировавних сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, включающее морфогенез ь регенерацию, а также структурно-функциональную адаптацию, дало возможность получить научно обоснованное представление о клоналыюм микроразм-ножекии растений, как сложном, многофакторном физиологическом процессе, контролируемом генетически, что явилось вкладом в развитие научной основы клонального микроразмножения растений и путей его практического использования.
Практическая значимость полученных результатов. На основании результатов экспериментальных исследований, полученных по изучении процессов морфогенеза її регенерации растений в условиях in vitro, а также структурно-функциональной адаптации регенерангов в условиях in vivo,разработана технология клонального микроразмнохения интродуцированных: сортов голубики высокой и брусники обыкновенной, создан банк генотипов, представленный коллекцией стерильных культур 14 интродуцированных сортов голубики высокой и 4 сортов брусники обыкновенной, разработаны три метода регенерации этих сортов: і) через активацию пазушных меристем, 2) пролиферацию каллуса, 3) непосредственно из ткани листа. Регенерация интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной непосредственно из ткани листа может быть использована в системе генетической трансформации,с целью получения трансгенных растений с новыми ценными свойствами для селекционной работы, а также для клонального иикроразмножения. Нами получены трансгенные растения непосредственно из клеток листовой ткани у двух сортов голубики высокой: Concord и Atlantic.
Разработанная технология клонального никроразмножеиия китродуцированкых сортов голубики высокоО и брусники обыкновенной обладаех рядом преимуществ, заключающихся во-первых, в сокращения технологического цикла в культуре in vitro с трех стадий до двух (за счет исключения стадии укоренения на питательной, среде); во-вторых, в экономии дорогостоящих компонентов питательной среды (гормональных добавок и др.^необходимых для ризогенеза; в-третьих, в устране' нии потерь, связанных с повреждением корневой системы при отмывании ее от агара; в-четвертых, в сокращении сроков получения товарной продукции.
Материалы диссертации легли в основу опубликованной монографии, будут использованы при написании учебника для вузов по клонаяьнопу макроразиножеыию
растений, при чтении лекций по морфогенезу и регенерации в культуре клеток и тканей, а также структурно-функциональной адаптации регенерантов.
Экономическая значимость полученных результатов. Технология клонального микроразмножения интродуцировашшх сортов голубики высокой и брусники обыкновенное позволит поставить на проныолекнуо основу производство здорового, экологически чистого посадочного материала таких ценных интродуцированных сортоз растений,как голубика и брусника, и удозлетворить потребности народного хозяйства Беларуси и других районов СНГ в этой продукции, а также может быть реализована как коммерческий продукт. Предложения о покупке технологии поступили с регионов средней полосы России и Украины.
Осносныо положения диссертац:;;;, выносимые на заідиту:
клональное кнкроразмноленме иитродуцированных сортов голубики высокой и брусники обикноеешюЯ находится в тесной зависимости от типа экспланта, его физиологического состояния, времени года в которое он был вычленен, генотипа, компонентов, содержащихся в питательной среде;
степень проявления и направленность процессов морфогенеза и регеньрации у зкеплантев голубики и брусники контролируется соотношением ауксинов и цито-кшшнов, характер воздействия которых обусловлен возрастом растения и связан
с его сортовой и видовой принадлетаостыо;
- процесс адаптации регенерантов интродуцировенных сортов голубики высо
кой и брусники обикновенноЯ обеспечивается за счет перестройки их струхтурно-
функционалыюй организации, вызванной как изменившийся факторами среди оби
тания (при переходе из условий in vitro в условия in vivo), так и адекват
ной реакцией на них, проявившейся в изменении количественных и улчгствешгах
показателей анатомической структуры листа растгнля-регенеранта.
Личный вклад соискателя. Результаты исследований, представленные в диссертации, получены автором лично при выполнении плановых тем научной тематики Центрального ботанического сада Академии наук Беларуси в соответствии с утвержденными программами.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты работы были представлены в форме тезисов и устных докладов и обсуждены на Всесоюзной конференции по теоретической и прикладной карпологии (Кишинев, 1989), Республиканской научной конференции, посвященной 150-летия ботанического сада им.акад. А.В.Фомина (Киев, 1989), Межреспубликанском научном семинаре по эколого-биологическому изучению ягодных растений сем.Брусничные и спиту освоения их промышленной культуры в СССР (Га»1цеви>ш, 1991), Научной конференции по генетической инженерии и биотехнологии (Минсх, 1994), Международном симпозиуме по' биотехнологии растений и генетической инженерии (Киев, 1994), Втором сге.~,де
белорусского общества физиологов растений (Минск, 1995), Межгосударственной научной конференции по биологическому разнообразии и интродукции растений (Санкт-Петербург, 199Ь), Втором меадународнои синпозиуие по клепальному микро-размножению растений (Салгспилс, 1996), Научной конференции по сохранению биологического разнообразия Белорусского Поозерья (Витебск, 1996).
Опубликованность резул. .'атор. Материалы диссертации опубликованы в 3 монографиях, 18 научных статьях, 11 тезисах, авторском свидетельстве и патенте.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 273 страницах машинописного текста, состоит иэ введения, общей характеристики работы, 9 глав, выводов, списка литературы из 201 наименования отечественных и 493 зарубежных авторов, иллюстрирована 42 таблицами, 12 рисунками.
