Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Физико-химические основы камнеобразующих свойств мочи 8
1.1.1. Химический состав мочи 8
1.1.2. Химический состав мочевых камней 10
1.1.3. Образование кристаллов из пересыщенных растворов 13
1.1.4. Основные концепции камнеобразования 15
1.1.5. Состав и структура белковой матрицы мочевых камней 17
1.1.6. Научные основы методов диагностики мочекаменной болезни 18
1.2. Микроволновая диэлектрометрия 23
1.2.1. Диэлектрические свойства водных систем в области миллиметровых электромагнитных волн 23
1.2.2. Изучение состояния воды в растворах 27
1.2.3. Использование миллиметровых волн для определения типа гидратации 30
1.2.4. Использование миллиметровых волн в биологии и медицине 34
1.2.5. Диэлектрические измерения в области миллиметровых электромагнитных волн 39
1.3. Электрокинетические свойства и агрегативная устойчивость биоминеральных коллоидов 45
Глава 2. Объекты и методы исследования 55
2.1. Выбор объектов изучения литогенных свойств мочи 55
2.2. Биохимический анализ мочи 56
2.3. Диэлектрический метод исследования мочи 57
2.3.1.Экспериментальная техника измерения параметров комплексного коэффициента отражения КВЧ-излучения 57
2.4. Определение электрокинетических свойств и агрегативной устойчивости коллоидов мочи 68
2.4.1. Аппаратурное обеспечение и методика изучения агрегации коллоидных частиц 68
2.4.2. Аппаратурное обеспечение и методика определения электрокинетического потенциала коллоидных частиц 72
2.4.3. Расчет энергии парного взаимодействия коллоидов мочи 75
2.5. Применение метода оптического смешения для определения размеров взвешенных компонентов мочи 76
Глава 3. Диэлектрические свойства мочи здоровых и больных мочекаменной болезнью 78
3.1. Биохимические показатели проб мочи здоровых людей и больных мочекаменной болезнью 78
3.2. Результаты КВЧ-диэлектрометрии модельных растворов солей 81
3.3. Электродинамические параметры мочи здоровых людей и больных мочекаменной болезнью 82
3.4. Значения компонент комплексной диэлектрической проницаемости мочи здоровых людей и больных мочекаменной болезнью 94
3.5. Диэлектрические параметры концентрированной мочи 101
Глава 4. Сравнение электрокинетических свойств и агрегативной устойчивости коллоидов мочи здоровых людей и больных мочекаменной болезнью 107
4.1. Обоснование методики экспериментов, подготовка проб мочи 107
4.2. Электрокинетические свойства коллоидов мочи здоровых людей и больных мочекаменной болезнью 110
4.3. Агрегативная устойчивость дисперсных систем мочи 120
4.4. Определение размеров взвешенных частиц мочи методом спектроскопии оптического смешения 143
Основные результаты и выводы работы 146
Библиографический список использованной литературы 147
Приложения 159
- Микроволновая диэлектрометрия
- Электрокинетические свойства и агрегативная устойчивость биоминеральных коллоидов
- Определение электрокинетических свойств и агрегативной устойчивости коллоидов мочи
- Электродинамические параметры мочи здоровых людей и больных мочекаменной болезнью
Введение к работе
Мочекаменная болезнь (уролитиаз) человека - распространенное заболевание. Диагноз мочекаменной болезни (МКБ) устанавливают в основном путем ультразвукового, рентгенологического, а также биохимического обследования, направленного на выявление метаболических нарушений. Вместе с тем актуальной является во многом нерешенная задача своевременной диагностики начальных изменений свойств мочи при уролитиазе и оценка степени активности камнеобразования в период заболевания. Также открытым остается вопрос о причине камнеобразования.
В настоящее время существует два альтернативных подхода к объяснению процесса образования мочевых камней, причем в обоих рассматривается специфическая взаимосвязь присутствующих в моче солей и белков. В одном подходе белки считают коллоидными стабилизаторами кристаллических образований, за счет адсорбции которых на поверхности кристаллов повышается растворимость солей. В другом белкам отводится роль матрицы (посторонних зародышей), на которой происходит кристаллизация солей.
Несмотря на ключевую роль в агрегативной устойчивости системы мочи процесса взаимодействия ее компонентов с растворителем (водой), до сих пор не проводилось сравнения мочи здоровых и больных МКБ с этих позиций. А именно, не определялось состояние (структурирование) воды в многокомпонентной системе нативной мочи, не изучалось и сродство к воде отдельных компонентов, в частности, камнеобразующих кристаллоидов и коллоидов.
Вместе с тем, такой метод исследования как микроволновая диэлектрометрия, позволяет решать подобные задачи. Крайневысокочастотный (КВЧ) диапазон электромагнитного излучения представляет особый интерес для водных систем биообъектов, поскольку он соответствует области максимальной дисперсии диэлектрической проницаемости свободной воды. Методом КВЧ-диэлектрометрии изучают эффекты гидратации (положительной,
5 отрицательной, гидрофобной и гидрофильной); процессы комплексо-образования, конформационные переходы биополимеров, межмолекулярные взаимодействия, состояние воды в коллоидных системах. Для простых и сложных модельных систем, а также для крови, желчи, кожи больных и здоровых пациентов на основании диэлектрометрических характеристик рассчитывают действительную и мнимую части комплексной диэлектрической проницаемости, тангенс диэлектрических потерь, по которым судят о структуре воды, взаимодействующей с растворенными и коллоидными компонентами на разных уровнях организации системы. Поэтому метод КВЧ-диэлектрометрии принципиально может быть использован для характеристики дисперсной системы мочи, включающей ионные, молекулярно растворенные и коллоидные компоненты.
Цель работы заключалась в сравнении взаимодействия (степени структурирования) воды с компонентами мочи здоровых людей и больных мочекаменной болезнью (МКБ) с применением КВЧ-диэлектрометрии.
Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:
Провести химический и биохимический анализ изучаемых образцов мочи больных уролитиазом и здоровых людей.
Разработать методику КВЧ-исследования мочи, включающую предварительную подготовку препарата.
В миллиметровом диапазоне электромагнитных волн (ЭМВ) изучить диэлектрические характеристики мочи здоровых людей и больных МКБ, обеспечив условия потери агрегативной устойчивости систем.
4. В широком диапазоне рН при сохранении естественного белкового
фона сравнить коллоиды мочи здоровых людей и больных МКБ по степени их
сродства к воде.
5. Оценить возможность лабораторной диагностики литогенных свойств
мочи человека на основе регистрации электродинамических параметров мочи.
Научная новизна работы:
Впервые КВЧ-диэлектрометрия применена для исследования литогенных свойств мочи.
Впервые определены комплексные значения диэлектрической проницаемости мочи здоровых людей и больных МКБ, по которым выявлены различия в степени структурирования воды в этих системах.
Установлена однозначная связь между степенью литогенности мочи и характером ее взаимодействия со сверхслабым электромагнитным излучением (ЭМИ) миллиметрового диапазона.
Впервые получены зависимости электрокинетического потенциала коллоидов мочи от рН среды и показано их отличие для систем мочи здоровых людей и больных МКБ.
Проведена оценка значений константы Гамакера для коллоидов мочи здоровых людей и больных МКБ.
Практическая значимость работы. Разработанная методика изучения здоровой и литогеннои мочи в миллиметровом диапазоне низкоинтенсивного ЭМИ, включая предварительную подготовку препарата, выявленные различия их диэлектрических свойств могут быть использованы для создания технических средств ранней клинической диагностики МКБ на стадиях до образования почечных камней; предложенный критерий литогенности позволит использовать параметры комплексного коэффициента отражения (ККО) миллиметрового излучения в условиях вакуумного концентрирования мочи для градации ее камнеобразующих свойств.
На защиту выносятся следующие основные положения:
Моча здоровых людей и моча больных МКБ характеризуются различными значениями компонент комплексной диэлектрической проницаемости в миллиметровом диапазоне сверхслабого электромагнитного излучения; моче здоровых пациентов соответствует более высокая степень структурирования воды.
Вакуумное концентрирование образцов мочи в 1,5-3 раза способствует
7
'ш развитию процесса агрегации диспергированных компонентов в течение
эксперимента, в результате чего существенно возрастают различия диэлектрических свойств мочи здоровых людей и больных МКБ.
Взвешенные частицы (коллоиды) мочи здоровых людей характеризуются одинаковой зависимостью электрокинетического (-) потенциала от рН среды, но высокой степенью неоднородности систем по электрокинетическим свойствам; для коллоидов мочи разных больных МКБ характерны различные зависимости «^ - рН», но меньшая неоднородность электрокинетических свойств коллоидов каждого образца мочи.
Взвешенным частицам мочи здоровых людей свойственны в целом меньшие значения константы Гамакера, чем частицам мочи больных МКБ, что может свидетельствовать об их большем сродстве к воде.
»
Микроволновая диэлектрометрия
Электромагнитные поля (ЭМП) от низких частот до у-диапазона успешно используются в биологии и медицине. В последней четверти XX века спектр медицинского и биологического применения электромагнитного излучения (ЭМИ) расширился за счет освоения крайне высокочастотного (КВЧ) диапазона ЭМВ (или миллиметровые волны), которому соответствуют частоты от 30 до 300 ГГц или длины волн (Я) от 1 до 10 мм [38]. Миллиметровые волны - неионизирующее излучение, которое не может влиять на химические связи в атомно-молекулярных комплексах. Многие особенности миллиметрового излучения обусловлены тем, что величина кванта энергии в этом диапазоне намного ниже теплового уровня: hv«kT. ЭМВ с Л«1 мм имеет /zv=l,87-10" Дж, в то время как для комнатной температуры &7«4,05-10" Дж. Т. о. поглощение одного кванта миллиметрового излучения любой молекулой вещества не может вызвать ее тепловую активацию.
Величина кванта энергии миллиметрового излучения существенно меньше энергии электронных переходов (1,6-10"19...3,2-10"18 Дж), энергии химической активации (3,2-10" Дж), а также колебательной энергии молекул (1,6-10 21...1,6-10"20Дж) и энергии водородных связей (3,2-10"21...1,6-10"20Дж). Таким образом, все перечисленные здесь атомарные и молекулярные эффекты также не могут быть стимулированы поглощением электромагнитного кванта в диапазоне частот, соответствующих миллиметровым длинам волн. Ниже энергии КВЧ-кванта оказывается энергия вращения свободных молекул воды (1,6-10" ...1,6-10" Дж). Следовательно, миллиметровые волны могут воздействовать на вращательные степени свободы молекул воды. В биологических экспериментах показано, что существует пороговые значения плотности потока КВЧ-излучения, при превышении которых начинают "у проявляться биологические эффекты: Р„ор 10 мкВт-см . При такой плотности потока энергии даже локальное (в зоне поглощения энергии) повышение температуры облучаемого объекта не достигает 0,2 С, а повышение температуры объекта в целом, если его размеры больше зоны поглощения ЭМВ, не фиксируется совсем. В таких случаях говорят о „нетепловых" эффектах воздействия ЭМИ миллиметровых волн [39]. Поскольку чистая вода по электрическим свойствам является диэлектриком с полярными молекулами, поэтому поглощение ЭМВ миллиметрового диапазона водой и любыми водными системами объясняется общими механизмами ослабления ЭМВ диэлектриками.
Процесс распространения ЭМИ в диэлектрике вызывает поляризацию вещества. В результате теплового движения и взаимодействия соседних молекул появляется сдвиг фазы поляризации среды P(t) относительно поля E(f), что и определяет диэлектрические потери, приводящие к сильному поглощению энергии излучения в водосодержащих средах [40]. Эффект поляризации в радиодиапазоне отображается в такой макроскопической величине, как комплексная диэлектрическая проницаемость є (со), ее действительная и мнимая части существенно зависят от частоты поля: є (о))=є (со) - іє"(со), (1.3) где є (со) - действительная составляющая диэлектрической проницаемости вещества, пропорциональная изменению свободной энергии, накопленной диэлектриком за период изменения поля, е"(со) — мнимая часть, пропорциональная поглощаемой за период колебаний поля энергии, называется диэлектрическими потерями [41]. Составляющие комплексной диэлектрической проницаемости в области ш релаксационных диэлектрических потерь связаны тангенсом диэлектрических потерь (tg 5): tgS = . (1.4) Дебай определил связь между дипольными моментами и временами релаксации, что позволило установить связь диэлектрической проницаемости и диэлектрических потерь с молекулярной структурой. Разделяя вещественную и мнимую части в (1.3) Дебай получил: где Єсо - предельная высокочастотная диэлектрическая проницаемость, є — предельная низкочастотная диэлектрическая проницаемость, т -макроскопическое время релаксации, со - круговая частота электромагнитного поля. Используя формулу трения Стокса, Дебай показал, что время релаксации (время, в течение которого ориентационная поляризация, возникающая под действием некоторого статического поля, уменьшается в е раз после отключения статического поля): где а - радиус сферы молекулы, к - постоянная Больцмана, Т - абсолютная температура, ц — вязкость жидкости. При увеличении частоты поля мнимая часть проходит через максимум в диапазоне сантиметровых или миллиметровых волн, а действительная уменьшается вплоть до частот дальней инфракрасной области (рис. 1.1) [41]. Молекулы воды, как известно, обладают полярными свойствами, обусловленными характером распределения электронной плотности. В результате этого каждая молекула воды имеет два нескомпенсированных положительных заряда у атомов водорода и два отрицательных заряда из-за неподеленной / -электронной пары кислорода, расположенных практически по углам тетраэдра. Линии связи, соединяющие два водородных иона с кислородом, образуют угол 109. Таким образом, молекула воды, имеющая несколько степеней свободы - ориентационную, вращательную и колебательную, представляет собой электрический диполь (1,84 Д) [42, 43]. Представления об особенностях структуры чистой воды (в смысле ближней упорядоченности), отвечающих ее свойствам (высокая теплоемкость, высокая диэлектрическая проницаемость и др.) согласуются с моделью, имеющей фракцию льдоподобной (ажурной) структурированной воды и фракцию неупорядоченной свободной воды с частично разорванными водородными связями в пустотах льдоподобных структур [43, 44]. Т. е. структура льда и воды обусловлена образованием водородных связей, энергия которых равна 4,5 ккал-моль"1. По О. Я. Самойлову при температуре 25С в чистой воде процент разорванных водородных связей (р) равен 11,3, а молекулы воды находятся в пяти различных состояниях, доля которых (и,-, %) составляет: щ= 0,2; nj = 2,0; щ- 7,6; щ= 23,2; п4= 67,0, где индекс / обозначает количество водородных связей [44]. Релаксационные свойства воды хорошо описываются функциями Дебая. Область дисперсии свободной воды расположена в диапазоне (3-1010-9-1010) Гц (у-дисперсия), что соответствует частотам вращательных степеней свободы воды (вращательная поляризация) [45]. Время релаксации молекул свободной воды составляет 10" с [46]. Плотность потока ЭМИ ослабляется по закону: У/ = 10 -10 а, где 7/ -плотность потока излучения, прошедшего в веществе слой ТОЛЩИНОЙ , 1о -плотность потока падающего излучения, а - коэффициент поглощения, зависящий от поглощающей среды.
Экспериментально установленные значения коэффициента поглощения излучения (а) для воды в области миллиметровых длин волн составляют 20-30 дБ-мм 1, что соответствует ослаблению волны в слое 1 мм в 100-1000 раз. При этом глубина проникновения ЭМП в воде составляет 0,3 мм при 20С [47, 48]. В водных растворах различных органических и неорганических соединений часть молекул воды замещена другими компонентами, которые по-разному влияют на структуру воды, вследствие этого характер поглощения миллиметрового излучения качественно и количественно меняется. Появляется новая фракция связанных молекул воды, имеющих ограниченное (меньшее) число вращательных степеней свободы вследствие их взаимодействия с молекулами растворенных веществ [39]. Если область дисперсии свободной воды, как отмечалось выше, расположена в диапазоне (1010-10п) Гц, то максимум дисперсии связанной воды - на частоте 109 Гц вследствие ориентационной поляризации, а биополимеров - при частотах менее 108 Гц [49]. При 20 С на длине волны ЭМИ Х,=8 мм для свободной воды є -20, є" 30, в то время как для связанной воды є 5, є" 0, а для биополимеров є 2, є" О [50]. В зависимости от вида растворенного вещества различают следующие типы гидратации: положительную и отрицательную, гидрофильную и гидрофобную. В работах [44, 51] изучали взаимодействие ионов с молекулами воды раствора (гидратацию ионов) с позиций представлений о кинетической устойчивости агрегата ион - молекулы растворителя. Для водных растворов количественными характеристиками гидратации ионов являются величины, определяющие частоту обмена молекул воды вблизи ионов: где т,- и г- среднее время пребывания молекул воды в положении, ближайшем к і-му иону и в чистой воде, соответственно; А/ — изменение величины потенциального барьера, преодолеваемого молекулой воды при выходе из ближайшего окружения /-го иона. В таблице 1.5 приведены значения энергии АЕ некоторых ионов при температуре 21,5 С. Такие ионы как Li , Na , Mg , Ca , уменьшают подвижность ближайших молекул воды (ЛЕ 0), структурируя растворитель. Значение АЕ уменьшается с увеличением радиуса ионов. Действие таких ионов можно уподобить температурному охлаждению растворителя, что соответствует увеличению вязкости воды. Такую гидратацию назвали положительной. Ионы fC, Cs+, СГ, Br, J, (ОН) усиливают трансляционное движение ближайших молекул воды {АЕ 0), т.е. обладают отрицательной гидратацией. Растворенное вещество, разрушая структуру растворителя, уменьшает вязкость подобно повышению температуры раствора. Ионы с отрицательной гидратацией при повышении температуры становятся ионами с положительной гидратацией. Выше предельной температуры (Гпред.) наблюдается только положительная гидратация [52]:
Электрокинетические свойства и агрегативная устойчивость биоминеральных коллоидов
Как отмечалось в подразделе 1.1, моча представляет собой кристаллоидно-коллоидную систему, находящуюся в норме в устойчивом состоянии, несмотря на то, что количество растворенных в ней солей в среднем в 3-4 раза выше предельного насыщения in vitro. Нарушение равновесия приводит к росту кристаллов, к получению аморфных частиц, впоследствии приобретающих кристаллическое строение. Также отмечалось, что как устойчивость коллоидной системы мочи, так и явление камнеобразования связывают с содержанием в моче белка [79]. Рассмотрим систему нативной мочи с позиции теории устойчивости дисперсных систем Дерягина-Ландау-Фервея-Овербека (ДЛФО). В классическом варианте теория коагуляции гидрофобных коллоидов ДЛФО рассматривает процесс коагуляции как результат совместного действия электростатических сил отталкивания и Ван-дер-ваальсовых сил притяжения между частицами [80-82]: где VjQi) — полная потенциальная энергия взаимодействия частиц, VR(JI) — ионно-электростатическая составляющая, связанная с перекрытием диффузных ионных атмосфер, VAQI) — молекулярная составляющая, обусловленная силами Ван-дер-Ваальса (см. рис. 1.2). Рис. 1.2 демонстрирует не только характерные участки на полной (суммарной) кривой энергии взаимодействия (такие как первичный и вторичный минимумы, потенциальный барьер), но и отражает характер агрегатов, получаемых при коагуляции в первичном и во вторичном минимумах. г где: rj0 - плотность поверхностного заряда; z - зарядное число; С концентрация электролита; F — число Фарадея; є — диэлектрическая проницаемость среды, є0 — диэлектрическая проницаемость вакуума; цг\ — Штерновский потенциал (потенциал плоскости наибольшего приближения ионов) [83]. Поскольку концентрация 1-зарядных ионов (см. табл. 1.1) в моче примерно равна 0,2 моль л"1, то можно считать, что величина штерновского потенциала, а, следовательно, ионно-электростатическая энергия отталкивания одноименно заряженных коллоидов, близка к нулю.
Поэтому в такой системе гидрофобные коллоиды должны коагулировать за счет действия сил молекулярного притяжения. Если учесть то, что кристаллоиды мочи содержат в поверхностной оболочке белковые компоненты (по одной из концепций в моче здоровых людей кристаллоиды стабилизированы белковыми соединениями - см. подраздел 1.1.4), то взаимодействие таких частиц следует описывать теорией ДЛФО для гидрофильных коллоидов [84, 85], согласно которой: где Vs(h) - структурная составляющая, возникающая при перекрытии граничных слоев, в которых структура воды отличается от объемной, Vad(h) -адсорбционная составляющая, связанная с перекрытием диффузных адсорбционных слоев нейтральных молекул, Vst(h) - составляющая, обусловленная стерическим отталкиванием при сближении двух поверхностей, покрытых адсорбционными слоями ПАВ или полимеров. Что касается свойств белков в концентрированных солевых растворах, то известно, что их растворимость повышается с ростом концентрации электролита вплоть до значений, соответствующих высаливанию белка [86]. В данной работе изучены электрокинетические свойства и устойчивость к агрегации взвешенных частиц не нативной, а разбавленной мочи, поэтому далее будут рассмотрены примеры поведения биологических и биоминеральных коллоидов не только в концентрированных, но и в разбавленных растворах электролитов. Если рассматривать образование золя из кристаллообразующих ионов, то в зависимости от условий (концентрации компонентов, температуры и др.) образуются микрокристаллики большей или меньшей степени дисперсности. Знак заряда поверхности (и строение ДЭС) будет зависеть от химических потенциалов ионов. Условие (1.27) определяет положение изоэлектрической точки (ИЭТ), переходя через которую будет меняться знак заряда внутренней обкладки ДЭС: где &ИКа, — разность химических потенциалов потенциалопределяющих катионов в твердой и жидкой фазе; &иАп. - разность химических потенциалов потенциалопределяющих анионов в твердой и жидкой фазе. Для описания строения ДЭС на границе между поверхностью кристаллических коллоидных частиц и раствором электролитов применяют представления, развитые в теории Гуи-Чепмена-Штерна. Ряд минеральных частиц является непроницаемым для молекул растворителя, но заряд может простираться на значительные расстояния внутрь фазы. Многие биоколлоиды проницаемы для молекул растворителя (воды) и содержат в своем составе функциональные группы (торф, гуминовые кислоты, синтетические иониты) [87]. К последним системам применяют модель полиэлектролитов [88]. Применение этой модели к белкам показало, что зависимость электрофоретической подвижности белков от рН прямо пропорциональна числу связанных водородных ионов. Такие результаты получены для яичного альбумина [89], псевдоглобулина, желатины, дезаминированной желатины и др. [90]. Была установлена линейная связь между константой диссоциации белков и их -потенциалом.
Примером биоколлоидов с относительно жесткой структурой являются вирусные частицы. У достаточно несложно организованных вирусов (например, полиовируса и реовируса) нуклеиновая кислота (РНК) покрыта капсидом (образованным из белковых нитей), имеющим кубическую симметрию. Липиды и углеводы отсутствуют. У других вирусов, например, у вируса гриппа, нуклеопротеидная сердцевина, покрыта плотной белковой оболочкой и двойным липидным слоем, в который инкорпорированы гликопротеидные субъединицы [91]. Исследования, проведенные для отдельных вирусов, показали, что положение ИЭТ может зависеть от ионной силы и от типа растворенной соли. В целом при увеличении ионной силы раствора положение ИЭТ несколько смещается в кислую сторону [92, 93]. Для четырех штаммов вируса табачной мозаики показано, что введение в ацетатный буфер ионов СГ (от 0 до 0,08 моль-л 1) смещает изоэлектрическую точку от рН 6,03; 5,57; 5,00; 4,03 до рН 3,85; 4,27; 4,20 и 3,67, соответственно [94]. В то же время изоэлектрическая точка реовируса типа 3 (штамм Dearing), определенная методом микроэлектрофореза (р/ 3,8), не зависела от концентрации NaCl [95]. Показано, что в области рН, соответствующей изоэлектрической точке, вирусные частицы агрегируют, и при достаточно высокой исходной концентрации образуют медленно оседающие осадки [92]. В вирусологической литературе обычно отождествляют значения рН, соответствующие изоэлектрической точке и минимуму растворимости. При щелочных значениях рН сродство большей части вирусов к водной фазе существенно увеличивается. В общем растворимость вирусов увеличивается с ростом ионизации [92]. В обзорных работах [96, 97] отмечается, что увеличение концентрации соли до определенного предела, когда еще не проявляется эффект высаливания, приводит к увеличению
Определение электрокинетических свойств и агрегативной устойчивости коллоидов мочи
Анализ полидисперсных многокомпонентных биоминеральных коллоидных систем (с размером частиц 200 нм), содержащих растворенные, ассоциированные и адсорбированные белки, связан со значительными трудностями. Требуется комплекс взаимодополняющих методов, в том числе высокочувствительных и неразрушающих, позволяющих определять не только средние характеристики, но и степень неоднородности системы по разным показателям. В качестве такого комплекса были выбраны методы микроэлектрофореза и поточной ультрамикроскопии повышенной чувствительности (за счет высокой интенсивности падающего света) с предварительной подготовкой проб, направленной на ограничение пределов размеров (молекулярной массы) компонентов мочи, попадающих в дисперсную систему.
При подготовке проб использовали методы диализа и эксклюзионной хроматофафии. Размеры пор диализной мембраны и хроматофафичекого носителя обеспечивали удаление из пробы компонентов с молекулярной массой менее 6000 Да.Метод поточной ультрамикроскопии основан на непосредственном счёте числа коллоидных (взвешенных) частиц в исследуемой системе. На кафедре биофизики СПбГТУ была создана (на базе промышленного прибора ВДК-4) специальная ультрамикроскопическая установка, позволившая сделать видимыми вспышки рассеянного света от частиц с малыми размерами (не менее 70 нм) при относительном показателе преломления (потн) 1,17. Схема прибора представлена на рис. 2.5.
Источником света в установке служит гелий-неоновый лазер (1) (Л=0,6328 мкм, мощность 2 мВт, диаметр луча на выходе из трубки 2,5 мм). На пути луча помещен фотометрический клин (2), фокусирующие линзы (3), позволяющие получить в зоне наблюдения пучок света диаметром 30 мкм.Исследуемая проба жидкости (8) снизу вверх подается по силиконовым шлангам в кварцевую кювету (4) (объемом 0,3 см3), имеющую две пары плоскопараллельных полированных граней. Крепление кюветодержателя позволяет поворачивать кювету вокруг оси, передвигать ее в вертикальном и горизонтальном направлении перпендикулярно направлению пучка света. Это обеспечивает фокусировку луча в центре кюветы. Скорость потока регулируется выбором капилляра (9) и разностью уровней жидкости в емкости и замыкающем тефлоновом микрошланге, закрепленном на горизонтальной поверхности. Она задается равной 0,003-0,020 см3-мин"1 в зависимости от численной концентрации частиц. Измеряется с помощью тефлоновой микропипетки (10) и секундомера.
Наблюдение за проходящими частицами ведется под углом 90 к направлению луча с помощью системы, состоящей из объектива (5) 10x0,24, револьверной диафрагмы (6) и окуляра (7) 20х. Диаметр минимального отверстия диафрагмы составляет 0,1 мм. Регистрация вспышек рассеянного света на темном фоне проводится визуально. Время фиксируется секундомером или хронографом печатающим 21-372 П.Рабочий (счетный) объем формируется сфокусированным лучом лазера (dj = 30 мкм), глубиной резкости оптической системы (а = 30 мкм) и диаметром отверстия счетной диафрагмы. Для визуального подсчета числа частиц при их концентрации, превышающей 10 см , выбираются диафрагмы, «вырезающие» в поле зрения круг диаметром 30 мкм и менее. Линейная скорость движения частиц в счетном поле обычно не превышает 20 мкм-с 1 (при больших концентрациях частиц обеспечивается ее уменьшение до 3-5 мкм-с"1). В эксперименте многократно (обычно 10 раз) производится подсчет числа частиц, проходящих через освещенную зону (поле зрения) за некоторое время. Временной интервал определяется концентрацией частиц и выбранной диафрагмой и составляет в большинстве случаев от 15 до 60 секунд.
Калибровка установки проведена монодисперсными полистирольными латексами (показатель преломления 1,19-1,20) с размерами частиц 73, 99 и 160 нм, полученными из Института синтетического каучука (ВНИИСК).Согласно паспортным данным на фотометрический клин, коэффициент светопропускания при введении клина в крайнее положение равен 0,6%. Это соответствует отношению минимально регистрируемых размеров частиц без введения клина и при полном введении, равному 2,4.
В данной работе для ускорения дисперсного анализа проводили грубую оценку относительных размеров частиц (в предположении равенства их показателей преломления). Для этого визуально различали и запоминали четыре-пять характерных образов яркости частиц, например, очень мелкие, , средние, крупные и очень крупные. Затем находили положение фотометрического клина, при котором частицы каждой степени яркости перестают быть видимыми. По положению клина определяли процент пропускания света и, наконец, относительный размер частиц. При серийном подсчете числа частиц отмечали количество вспышек, принадлежащих к каждой группе яркости.
Методика определения концентрации частиц с помощью поточного ультрамикроскопа состояла в следующем. Тщательно вымытые емкости объемом 500 мл снабжали резиновыми пробками с двумя вставленными тефлоновыми шлангами - длинным, погруженным в жидкость, и коротким — для сообщения с воздухом атмосферы. Емкости со шлангами тщательно промывали обеспыленной дистиллированной водой. К шлангу, соединенному со входом в кювету, подсоединяли емкость с дистиллированной обеспыленной водой. Со стороны выхода из кюветы отсоединяли капилляр, подсоединяли шприц (в точке 11 на рис.2.5) и промывали всю систему (объем шлангов и кюветы составляет 1,5 мл), отсасывая не менее 10 мл воды. Затем вместо емкости с водой подключали емкость с фоновым раствором, подсоединяли капилляр, через 1-2 минуты после установления стационарного режима измеряли скорость течения жидкости и затем проводили ряд замеров для определения фоновой концентрации. Емкость с фоновым раствором отсоединяли, в нее вводили пробу подготовленного образца мочи в заданной пропорции, осторожно перемешивали, подсоединяли ко входному шлангу и повторяли всю последовательность вышеназванных операций. Если следующее определение концентрации частиц планировалось через 10-15 минут, то емкость не отсоединяли, но через намеченное время отсоединяли капилляр, прокачивали через систему новую порцию исследуемой дисперсной системы и проводили измерение. При более длительном перерыве отсоединяли емкость с пробой, подсоединяли емкость с дистиллированной водой, промывали систему и оставляли ее заполненной водой. Емкости с исследуемыми дисперсными системами хранили при температуре 12-15С.
Электродинамические параметры мочи здоровых людей и больных мочекаменной болезнью
Из данных, приведенных в первой главе (см. 1.1, 1.2.2, 1.2.3) и в предыдущем подразделе, видно, что в моче здоровых людей и больных МКБ при комнатной температуре и при температуре тела содержится сравнительно большое количество ионов с положительной и отрицательной гидратацией. Следовательно, при воздействии ЭМИ миллиметрового диапазона на сложную дисперсную систему мочи данные ионы могут внести определенный вклад в значение диэлектрических характеристик. Необходимо было экспериментально с помощью используемой аппаратуры (см. подраздел 2.3.1) выявить такой вклад со стороны основных ионов мочи в диапазоне концентраций, свойственных для нативной и концентрированной (см. 2.3.1) системы. Модельные растворы солей были приготовлены с двукратным превышением средних значений концентраций минеральных компонентов в анализированных пробах мочи (см. табл.3.2): NaCl - 270 ммоль-л 1, КС1 — 53 ммоль-л" , и СаСІ2 — 6 ммоль-л" (в 100 мл бидистиллированной воды растворено 0,4 г хлорида калия; 1,6 г хлорида натрия; 0,07 г хлорида кальция). Сравнительные результаты исследований амплитуды (А) и фазы (ф) комплексного коэффициента отражения ЭМИ частотой 30 ГГц от бидистиллированной воды и модельных солевых растворов при разной степени концентрирования представлены в табл.3.3. Видно, что амплитуда и фаза отраженного сигнала от бидистиллированной воды и модельного солевого раствора совпадают; при концентрировании раствора в 2 раза незначительно меняется амплитуда сигнала, а в 3 раза - фаза. Таким образом, действие ионов с положительной и отрицательной гидратацией оказывается практически скомпенсированным, и почти не проявляется диэлектрометрически при увеличении их концентрации до 0,5 моль-л 1 и выше.
Полученные результаты согласуются с литературными данными - авторы работы [56] также только при концентрации растворённого вещества свыше 0,5-1М наблюдали изменение коэффициента поглощения раствора по сравнению с чистой водой. Таким образом, присутствие в моче растворенных солей в концентрациях, свойственных для нативной и концентрированной (до трех раз) мочи, слабо влияет (на уровне погрешности измерения) на диэлектрические параметры исследуемых систем. Диэлектрические измерения в миллиметровом диапазоне ЭМИ выполнены на 109 образцах мочи. Донорами 29 проб были здоровые люди, проб - больные с диагнозом мочекаменной болезни, 15 проб - урологические больные, не имеющие камней. Возраст доноров обеих групп составлял от 17 до 73 лет. Пол доноров не учитывали. Кроме радиофизического метода в данной серии исследований для контроля постановки диагноза применяли клинические методы обследования больных: рентгенологическое и ультразвуковое исследование мочевой системы; клинические биохимические анализы мочи и крови; микроскопию осадка мочи. Поскольку степень структурирования воды уменьшается с ростом температуры и, в результате, изменяются ее диэлектрические характеристики (см. подраздел 1.2), то необходимо было проводить диэлектрическое исследование мочи при строго фиксированных температурах. Температурный интервал целесообразно было ограничить значениями температуры тела человека и окружающей среды. Первые измерения проводили в таком диапазоне температур: от 25 до 38С. Однако в массовых экспериментах по определению амплитуды и фазы ККО миллиметрового ЭМИ от образцов мочи (для сокращения трудоемкости исследований) температурный интервал был ограничен. Для выбора значений температуры, при которых следовало проводить измерения, были изучены температурные зависимости для всего диапазона 25-38С. Исследования проведены на моче как здоровых людей, так и больных МКБ. Пример полученных результатов для бидистиллированной воды и мочи здорового человека представлен на рис.2.2 (в подразделе 2.3.1). Из приведенного рисунка видно, что параметры ККО (амплитуда и фаза) монотонно увеличиваются с ростом температуры. Кривые, соответствующие образцам мочи разной степени концентрирования, располагаются почти параллельно друг другу, опускаясь вдоль осей ординат по мере увеличения объема удаленной из образцов воды. Зависимости, полученные для литогенной мочи (у больного регистрировали выход песка с мочой) имели аналогичный характер и не обнаруживали никаких особенностей в исследованном интервале температур. Увеличение с ростом температуры амплитуды и фазы сигнала, отраженного от воды и образцов мочи, полностью соответствует теоретическим представлениям о взаимодействии миллиметрового ЭМИ с водосодержащими средами. В частности, тем, согласно которым увеличение температуры среды приводит к ослаблению связей в структуре воды, возрастанию вращательной подвижности молекул и уменьшению времени дебаевской релаксации (rD) [113].
Поскольку не было выявлено никаких особенностей, требующих проводить измерения в широком диапазоне температур для нативных и концентрированных (при вакуумном испарении) образцов мочи здоровых людей и больных МКБ, то было принято решение ограничиться двумя температурами (наиболее близкими к физиологическим значениям) - 30 и 35 С, поддерживаемыми с точностью до 0,2 С Типичный пример результатов исследования образца мочи больного МКБ при двух температурах представлен на рис.3.1. В данном случае материалом для исследования послужила моча, взятая у больного с мочевым камнем, расположенным в верхней трети правого мочеточника. Больной поступил в клинику с диагнозом: острая колика. Ультразвуковое обследование показало наличие камня. Плотность мочи составляла 1,010 гсм 3,рН6,2. Биохимический анализ мочи выявил повышенное количество уратов - 1,88 ммоль-л"1 (при норме до 0,7 ммоль-л"1). Данные общего анализа мочи и анализа по Нечипоренко были в пределах нормы. Общий и биохимический анализы крови также не обнаружили никакой патологии. Как видно из рисунка, амплитуда и фаза отраженного сигнала мало отличаются от аналогичных характеристик бидистиллированной воды. Кроме того, концентрирование мочи больного МКБ даже в 3,3 раза не сильно влияет на величину амплитуды и фазы отраженного сигнала.
