Содержание к диссертации
I. Введение.
-
Актуальность проблемы.
-
Цели и задачи исследования. 1.3.Основные задачи исследования.
-
Научная новизна работы.
-
Научно-практическая ценность.
-
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Апробация работы.
И. Обзор литературы.
-
Общие сведения о вирусе гепатита С (ВГС).
-
Структура и организация генома. Краткая характеристика некоторых продуктов его экспрессии:
5'-нетранслируемый участок (5'-UTR)
З'-нвтранслируемый участок (З'-UTR)
вирусные протеины. Структурные белки. Белок Core
зликопротеины оболочки
неструктурные белки. NS2
-
Тканевой тропизм ВГС.
-
Роль ВГС в канцерогенезе.
-
Метод ОТ-ПЦР in situ.
-
Морфогенез ВГС.
III. Материалы и методы.
-
Клинический материал для детекции РНК ВГС.
-
Метод ПЦР. З.З.ОГ-ПЦР in situ.
3.4. Электронная микроскопия.
IV. Результаты и обсуждение.
-
Метод ОТ-ПЦР in situ.
-
Обнаружение РНК ВГС in situ.
-
Локализация in situ.
-
Ультраструктурные исследования.
-
Общее заключение по обсуждению.
-
Выводы.
-
Слисок цитируемой литературы.
Глава I.
Введение к работе
1.1.Актуальность проблемы.
Вирус гепатита С (ВГС), как предполагается, проник в человеческую популяцию довольно давно и в настоящее время получил широкое распространение, в том числе из-за парентеральных манипуляций. Число инфицированных вирусом - около 500 млн. человек, большинство из которых является скрытыми носителями. У 50-85% заболевших острым гепатитом С развивается хроническая (персистирующая) ВГС-инфекция, при которой вирус сохраняется и размножается в организме в течение десятков лет [125].
Данные о частоте встречаемости гепатита С неоднородны и колеблются от 0,1% от общей численности населения в таких странах, как Исландия, или Норвегия и до 18,1% - в Египте [44].
Кроме того, на фоне хронического вирусного гепатита может развиваться первичный рак печени (гепатоцеллюлярная карцинома). Как известно, гепатоцеллюлярная карцинома является одной из наиболее распространенных злокачественных опухолей человека. Среди злокачественных новообразований печени на её долю приходится 80-90%, а ВГС, наряду с ВГВ (вирусом гепатита В), являются важнейшими 4 этиологическими агентами. Причем в некоторых регионах мира, например в
Японии, доля ВГС-инфекции в этом отношении является ведущей, достигая 75% [20].
Несмотря на всё вышеперечисленное, до сих пор остаются неизученными молекулярно-биологические аспекты репродукции вируса. Также однозначно не выяснена его внутриклеточная локализация. Хотя факт участия ВГС в развитии гепатоцеллюлярной карциномы доказан, молекулярные механизмы ВГС-ассоциированного канцерогенеза не изучены до настоящего времени. [132]. В. В связи с этим возникает вопрос о методе, который позволил бы : выявить генетический материал (РНК) вируса непосредственно в инфицированной ткани (in situ). сохранить тканевые срезы достаточно цельными для того, чтобы можно было установить внутриклеточную локализацию вирусной РНК.
Таким методом, по сути, является гибридизация in situ. Однако, этот метод в применении к вирусу гепатита С имеет низкую чувствительность и дает не очень достоверные результаты из-за того, что во-первых, количество вирионов ВГС в ткани невелико, а во-вторых, в процессе выполнения процедур его РНК часто подвергается разрушению.
Метод ОТ-ГЩР in situ был разработан на основе двух методов - метода полимеразной цепной реакции и метода гибридизации in situ. Таким образом, он сочетает в себе их достоинства: высокую чувствительность с возможностью морфологического исследования. Однако, несмотря на преимущества, ОТ-ПЦР in situ обладает и некоторым недостатком. Более жесткая предварительная обработка срезов и резкие многократные температурные перепады, имеющие место на этапе амплификации, приводят к более сильному, чем при гибридизации in situ, разрушению срезов. Также к сложностям ОТ-ПЦР in situ можно отнести его многоэтапность, трудоёмкость и высокую стоимость реактивов. Всё это вместе и привело к тому, что в нашей стране этот метод практически не применяется, в то время как за рубежом появляются исследования с применением ОТ-ПЦР in situ для идентификации различных вирусов.
О первых результатах, полученных с использованием этого метода сообщалось в работе А.Т .Haase и др. в 1990 г. [39]. В дальнейшем, количество работ с применением метода обнаружения РНК ВГС в срезах тканей, фиксированных формалином и заключенных в парафин заметно возросло, но наибольший вклад в развитие и стандартизацию методики, ее усовершенствование и изучение с ее помощью ВГС внес G. Nuovo [81 - 90].
Применение метода детекции РНК ВГС in situ позволило обнаружить ВГС не только в гепатоцитах, но и в купферовских клетках [6]. Кроме того, было показано, что РНК вируса гепатита С обнаруживается не только в печени, но и, например, в лимфоцитах [54], и в эритротроцитах [73]. Предполагают, что эти клетки могут принимать участие в транспорте ВГС от места проникновения в организм до клеток печени, где, в основном, происходит его размножение.
До сих пор остаётся спорным вопрос о внутриклеточной локализации РНК ВГС. Некоторые исследователи сообщают о нахождении РНК ВГС только в цитоплазме гепатоцитов [15, 93, 103, 104], другие указывают на исключительно ядерную локализацию [7], третьи обнаруживают РНК ВГС как в цитоплазме, так и в ядрах клеток [6, 16, 41, 60, 89, 118].
1.2. Цели и задачи исследования.
Цель данной работы - модификация метода ОТ-ПЦР in situ для рутинного гистологического материала, выявление РНК ВГС в клетках печени больных с хроническим гепатитом Сиу больных с диагнозом гепатоцеллюлярный рак на биопсийном и операционном материале, также изучение тропизма вируса гепатита С в клетках и ткани печени методом ОТ-ПЦР in situ.
1.3. Основные задачи исследования.
Модификация и оптимизация и использование морфологического метода ОТ-ГЩР in situ для исследования РНК ВГС на парафиновых срезах.
Детекция и внутриклеточная локализация геномной РНК ВГС у больных с хроническим гепатитом С (ХГС).
Детекция и внутриклеточная локализация геномной РНК ВГС у больных с гепатоцеллюлярной карциномой (ГК).
Сравнение данных, полученных с помощью ОТ-ПЦР in situ, данных, полученных с использованием классического ОТ-ПЦР-анализа, а также с гистологической картиной и оценкой степени поражения печени по Knodelle и результатами ультраструктурного исследования.
1.4. Научная новизна работы.
В работе впервые в практике отечественных исследований применён и модифицирован метод ОТ-ПЦР in situ для вирусологических и патологоанатомических исследований и, в частности, для детекции ВГС.
В ходе работы с операционным материалом от больных с диагнозом: «гепатоцеллюлярный рак» впервые показана локализация РНК ВГС в перинуклеарном пространстве раковых клеток, что дополняет представление о внутриклеточной локализации компонентов вируса в опухолевых клетках. Учитывая трудности в получении такого материала для анализа, а также невысокую частоту встречаемости гепатоцеллюлярного рака в России, эти результаты имеют большое значение, т.к. они способствуют выявлению одного из главных факторов опухолевого роста в печени.
1.5. Научно-практическая ценность.
Показано, что ОТ-ПЦР in situ имеет ряд преимуществ перед уже известными диагностическими методами, такими как рутинное гистологическое исследование, гибридизация in situ, электронная микроскопия и классический метод ОТ-ПЦР.
Рутинное гистологическое исследование даёт представление о степени выраженности воспалительного или опухолевого процесса в печени, но не даёт представления о причине заболевания, а классический метод ОТ-ПЦР показывает наличие генетического материала ВГС в крови или тканевом лизате, но не показывает наличие вируса в отдельных клетках. В силу того, что обычно выявляемое количество вируса невелико, такие диагностические методы, как гибридизация in situ и электронная микроскопия — малоэффективны. ОТ-ПЦР in situ, являясь морфологическим методом, обладает более высокой чувствительностью, чем гибридизация in situ, за счёт многократной амплификациии молекул-мишеней, и, следовательно, более перспективна для детекции вируса.
В работе впервые показано наличие РНК ВГС в операционном материале от больных с гепатоцеллюлярным раком, что даёт возможность выбора адекватного метода лечения этих больных.
Успешное применение метода для анализа материала от больных с хроническим гепатитом С и гепатоцеллюлярнои карциномой позволяет научных исследований, но и для существующей медицинской практики.
1.6. Основные положения, выносимые на защиту.
Оптимизация и модификация метода ОТ-ПЦР in situ для исследований в вирусологии и патологической анатомии, и в частности, для детекции РНК ВГС в материале от больных хроническим гепатитом С и гепатоцеллюлярной карциномой.
Сравнение методов ОТ-ПЦР in situ и электронной микроскопии, как морфологических методов для практической идентификации ВГС в биоптатах печени от больных с хроническим гепатитом С.
1.7. Апробация работы.
Материалы диссертации доложены на: заседании отдела молекулярной вирусологии ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (октябрь 2004), 11 (октябрь 2003г), 12 (май 2004 г), конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург), на XX Российской Конференции по Электронной Микроскопии (РКЭМ - 2004, п. Черноголовка, май-июнь 2004),
Похожие диссертации на Детекция РНК вируса гепатита С (ВГС) у больных с хроническим гепатитом С и гепатоцеллюлярной карциномой с помощью метода ОТ-ПЦР in situ
