Введение к работе
Актуальность проблемы
Вакцинация является одним из наиболее эффективных методов борьбы с инфекционными заболеваниями человека и животных. Современная система вакцинации является решающим фактором снижения детской смертности, увеличения продолжительности и улучшения качества жизни всех возрастных групп населения. По данным ВОЗ, вакцины ежегодно спасают жизнь 3 млн. детей. Количество созданных вакцин против инфекций постоянно растет. За последние 30 лет оно увеличилось в два раза. В настоящее время на разных стадиях экспериментальной разработки и клинических испытаний находятся вакцины, направленные на профилактику более 60-ти видов заболеваний.
В 1798 г. Эдвард Дженнер впервые опубликовал сведения о применении про-тивооспенной вакцины. Он обнаружил, что люди, получившие прививку вирусом коровьей оспы, приобрели невосприимчивость к оспе натуральной. Э. Дженнер назвал данную процедуру вакцинацией. Это был первый случай применения вакцины для предотвращения развития заболевания. Применение вакцинации началось спустя столетие, благодаря блестящим работам Пастера. Успех иммунизации основывается на одной главной идее: у человека имеются специфические иммунологические механизмы, которые могут быть запрограммированы на защиту организма от возбудителей инфекционных заболеваний. Стимуляция иммунных механизмов осуществляется посредством прямого введения инфекционных агентов или их частей в форме вакцины. Несмотря на несомненную пользу используемых вакцин, они могут вызывать сенсибилизацию организма, содержат большой набор антигенов, среди которых могут встречаться и перекрестно реагирующие с антигенами человека, вызывают большую нагрузку на иммунную систему, реактогенны, токсичны и т. п.
Поскольку все без исключения используемые вакцины (отечественные и зарубежные) не лишены недостатков и нуждаются в дальнейшем совершенствовании [Медуницын, 2004], современная вакцинология стремится к созданию более совершенных вакцин, которые должны быть эффективны, безопасны и не иметь побочных свойств. Повышение требований к безвредности и чистоте препаратов стимулировало не только совершенствование традиционной вакцинологии, но и создание нового поколения искусственных вакцин: субъединичных, рекомби-нантных, антиидиотипических, ДНК-вакцин, съедобных вакцин и др. Необходимость разработки новых вакцин связана также с решением проблемы борьбы с еще не побежденными инфекциями. Среди них особую тревогу вызывают вирусные гепатиты и СПИД, они относятся к числу наиболее социально значимых инфекций.
По данным ВОЗ вирусным гепатитом В больны, инфицированы или переболели более 2 миллиардов человек (30% населения мира). Ежегодно в мире от этой инфекции умирает около 750 тыс. человек. Широкая распространенность гепатита В связана и с тем, что из общего числа первично инфицированных до 10% заболевших становятся хроническими носителями вируса. Всего в мире насчитывается более 350 миллионов хронически инфицированных. Применение дрожжевой рекомбинантной вакцины на основе HBsAg позволило снизить заболеваемость гепатитом В в несколько раз [Ni et al., 2001; Da Villa et al., 1998]. Однако, эта вакцина, широко применяемая в настоящее время, не лишена ряда недостатков. Основной из них - низкая иммуногенность вакцины. Так, для достижения длительного протективного ответа требуется трехкратная вакцинация. Кроме того, у
10% людей вообще не развивается сероконверсия после стандартной схемы вакцинации [Carman et al, 2000; Не et al, 2001]. Существенным недостатком существующей инъекционной формы вакцины на основе HBsAg является также то, что она не стимулирует мукозальный иммунный ответ и не обеспечивает резистентность у входных ворот инфекции, и это при том, что в последние годы быстро растет доля непарентерального пути передачи вируса [Arima et al, 2003; Mikhailov et al, 2002]. Наконец, вакцина на основе HBsAg не обеспечивает формирования полноценного клеточного иммунного ответа, который необходим для обеспечения более эффективной защиты организма от вируса. Клеточное звено иммунитета особенно важно для предотвращения хронизации вирусной инфекции. Было установлено, что при вирусной инфекции клеточный ответ иммунной системы возникает не на HBsAg, а на коровый белок вируса (HBcAg), причем величина ответа имеет существенное значение для исхода заболевания [Lohr et al, 1993; Missale et al., 1993; Chisari, 2000]. Применение активной иммунизации HBcAg в терапевтических целях может уменьшить риск развития хронической инфекции и будет полезно при лечении хронических больных.
Первые случаи СПИДа были описаны в 1981 г. С тех пор, несмотря на сани-тарно-просветительские меры и появление лекарственных препаратов, эпидемия ВИЧ/СПИДа продолжает распространяться. Сейчас ее скорость составляет 15 000 новых случаев инфекции ежедневно. Со времени регистрации первых случаев болезни более 67 млн. человек были инфицированы и более 25 млн. уже умерло. Особенность СПИДа состоит в том, что в процессе ВИЧ-инфекции не образуется протекгивного иммунитета, способного привести к выздоровлению, и поэтому в данном случае для создания вакцин невозможно использовать живой аттенуиро-ванный вирус.
В таких случаях становится все более очевидно, что пастеровские принципы исчерпали себя и необходимы новые подходы, основанные на последних достижениях современной биологии.
Один из наиболее перспективных подходов связан к созданием вакцин на основе специально отобранных В- и Т-клеточных эпитопов, которые содержат только необходимые для формирования специфического иммунитета фрагменты вирусных белков. Основной недостаток таких искусственных вакцин - их низкая иммуногенность. Поэтому очень важно правильно выбрать средства доставки антигенного материала, которые обеспечат запуск нужных механизмов гуморального, клеточного и мукозального звеньев иммунитета.
В нашей работе мы использовали подход, в основу которого заложен принцип объединения в одной конструкции оптимально подобранных вирусных эпитопов для создания искусственных иммуногенов ВИЧ-1 и гепатита В. В качестве средств доставки для разработанных иммуногенов использовали вирусоподобные частицы и аттенуированные штаммы сальмонелл.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы была разработка экспериментальных вакцин против вируса гепатита В и ВИЧ-1, способов представления их иммунной системе и оценка специфической активности созданных препаратов.
В связи с целью исследования необходимо было решить следующие задачи: 1. Исследовать потенциал корового белка вируса гепатита В (HBcAg) в качестве носителя эпитопов чужеродных белков. Выбрать оптимальное место
встройки чужеродных эпитопов, решить проблему самосборки химерных молекул корового белка.
Получить экспериментальную вакцину против гепатита В на основе химерного HBcAg, несущего основные иммуногенные области HBsAg: основной иммуногенный эпитоп "а", районы preSl и preS2. Исследовать специфическую активность созданных конструкций.
Оценить иммунный ответ при мукозальной иммунизации экспериментальных животных аттенуированными штаммами сальмонелл, продуцирующими HBcAg и штаммами, несущими ДНК-вакцину против гепатита В.
Исследовать возможности доставки полиэпитопного белка TBI с помощью вирусоподобных частиц (ВПЧ) и рекомбинантных штаммов сальмонелл.
Исследовать возможности доставки ДНК-вакцины, кодирующей ген TCI с помощью ВПЧ и аттенуированных штаммов сальмонелл.
Исследовать специфическую активность экспериментальной вакцины Ком-биВИЧвак (инъекционная форма).
Исследовать специфическую активность экспериментальной вакцины против ВИЧ-1 Сал-ВИЧ "Д" (суппозиторная форма).
Научная новизна и практическая значимость работы
Продемонстрированы новые возможности HBcAg как носителя чужеродных антигенных детерминант.
Впервые получен набор химерных частиц HBcAg, несущих эпитопы preSl, preS2 и основной эпитоп "а" поверхностного белка вируса гепатита В, и исследованы иммуногенные свойства полученных конструкций
Впервые предложен и разработан метод получения мозаичных вирусоподобных частиц на основе HBcAg с использованием системы векторов, обеспечивающих одновременный синтез химерного и нативного корового белка вируса гепатита В в одной бактериальной клетке.
Впервые показано, что при ректальной иммунизации рекомбинантный штамм сальмонеллы, несущий вирусный антиген в формате ДНК-вакцины, эффективно стимулирует вирусспецифический иммунный ответ. Это продемонстрировано на примере химерных антигенов ВГВ и ВИЧ-1 с использованием аттенуированных штаммов Salmonella enteritidis Е-23 и Salmonella typhimurium SL 7207.
Впервые предложена суппозиторная форма для перректальной иммунизации, обеспечивающая сохранность живых бактериальных клеток, и на ее основе создана экспериментальная вакцина против ВИЧ-1 - Сал-ВИЧ "Д". Доклинические испытания экспериментальных серий вакцины показали, что Сал-ВИЧ "Д" индуцирует ВИЧ-специфический гуморальный и клеточный. Вакцина не вызывает негативных длительно сохраняющихся изменений в организме животных.
Впервые продемонстрирована эффективность доставки полиэпитопного антигена TBI в виде вирусоподобных частиц, сконструированных на основе реопо-лиглюкина. Показано, что представление иммунной системе белка TBI в составе ВПЧ способствует пролонгации иммунного ответа на белок TBI и вызывает адъювантный эффект, сравнимый с эффектом, вызываемым введением полного адъюванта Фрейнда.
Предложен новый подход конструирования вакцин против вирусов, основанный на объединении в одной конструкции двух иммуногенов: один в виде
белка, другой в виде ДНК вакцины. На основе данного подхода создана экспериментальная вакцина против ВИЧ-1 - КомбиВИЧвак (инъекционная форма). Доклинические испытания экспериментальных серий вакцины показали, что КомбиВИЧвак индуцирует ВИЧ-специфический гуморальный и клеточный ответ. Вакцина не вызывает негативных длительно сохраняющихся изменений в организме животных.
Вакцины Сал-ВИЧ "Д" и КомбиВИЧвак и их компоненты защищены патентами РФ. Оформлена НТД на вышеуказанные вакцины, проведена предварительная регистрация в Министерстве здравоохранения и социального развития РФ. В настоящее время вышеперечисленные вакцины находятся на экспертизе в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
Положения, выносимые на защиту:
Область основной антигенной детерминанты сі корового белка вируса гепатита В (HBcAg) является перспективной для встроек чужеродных эпитопов.
Определенные физико-химические свойства пептидов (гидрофобность, объем и склонность к образованию Р-структур), встраиваемых в область сі, оказывают влияние на способность химерного HBcAg к самосборке.
Техника получения мозаичных структур или введение фланкирующих цис-теинов во встраиваемый пептид позволяет нивелировать отрицательное влияние встроек на самосборку химерных белков, получаемых на основе HBcAg.
HBcAg может выступать носителем имитаторов чужеродных вирусных эпитопов.
Химерные коровые белки HBcAg-HBs, HBc-preSl и HBc-preS2 собираются в вирусоподобные частицы, обладают антигенностью ВГВ, индуцируют синтез антител к встроенным эпитопам и формируют в организме животных клеточный иммунный ответ, сравнимый с ответом на HBcAg.
Рекомбинантный аттенуированный штамм Salmonella enteritidis Е-23/рКНВс, продуцирующий HBcAg при ректальной иммунизации мышей линии Balb/c стимулирует как системный, так и мукозальный иммунный ответ к HBcAg.
ДНК-вакцина, содержащая ген HBcAg, индуцирует гуморальный иммунный ответ и клеточное звено иммунитета.
Искусственные вирусоподобные частицы (ВПЧ), полученные на основе рео-полиглюкина и экспонирующие на своей поверхности полиэпитопный белок GST-TBI, обладают высокой иммуногенностью.
Рекомбинантные штаммы S.typhimurium 7207/pGEX-TBI и S. enteritidis E23/pGEX-TBI, продуцирующие белок TBI, индуцируют системный и мукозальный иммунный ответ против ВИЧ-1 при перректальной иммунизации лабораторных животных
Интенсивность клеточного и гуморального ответов возрастает в ряду: "голая" ДНК вакцина, ДНК вакцина в составе ВПЧ (ВПЧ-pcDNA-TCI), рекомбинантная сальмонелла S.typhimurium 7207/pcDNA-TCI.
Экспериментальные вакцины КомбиВИЧвак и Сал-ВИЧ "Д" индуцируют ВИЧ-специфический гуморальный и клеточный ответ. Вакцины не вызывают негативных длительно сохраняющихся изменений в организме животных.
Апробация работы и публикации
Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: Международные конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", 1999-2002г., Санкт-Петербург, Россия; "John Humphrey advanced summer programme in immunology", 1998, 2000, 2002, 2004, Pushino, Russia; "DNA vaccines", 2002, Edinburg, UK; "International Congress of Virology" 1996, 2002; "Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов", 2004г., Томск, Россия; "International symposium on HIV and emerging infectious diseases", 2004, France; "Russian-German workshop on infection and immunity - tools and strategies for novel vaccines", 2005, Germany; "New approaches to vaccine development, 2005, Germany; "Вакцинология 2006", Москва и на других конференциях.
Работа выполнена в 1993-2006 годах в ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзо-ра в рамках научных тем организации и по грантам государственных научно-технических программ "Новейшие методы биоинженерии", "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, подраздел: Защита от патогенов", по Федеральной Государственной программе "Вакцины нового поколения и диагностические системы будущего". На разных этапах ее выполнения в ней приняли участие Т. А. Веремейко и Н. А. Некрасова, у которых автор являлся научным руководителем диссертационных работ. По материалам диссертации опубликовано 43 статьи, получено 10 патентов Российской Федерации.
Структура и объем работы
