Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.Весенняя виремия карпа 8
1. Историческая справка 8
2. Предрасполагающие факторы, группы риска 10
3. Клиническая картина 1І
4. Возбудитель заболевания - вирус весенней виремии карпа 12
4.1. Структура вируса 13
4.2. Гликопротеин (G-белок) рабдовирусов 15
5. Существующие подходы к профилактике и лечению ВВК 18
2. Вакцинология в аквакультуре 19
1. Традиционные инактивированные и аттенуированные вакцины для рыб 20
2. Рекомбинантные технологии в аквакультуре 21
2.1. Субъединичные вакцины для рыб 23
2.2. ДНК-вакцины 25
2.2.1.Опыт применения ДНК-вакцин для рыб 27
2.2.2. Возможные системы доставки вакцины в организм рыбы 29
2.2.3. Исследование тканевого распределения плазмидной ДНК и продолжительности экспрессии рекомбинантног гена в организме рыб 33
2.2.4. Изучение механизмов представления АГ клеткам ИС после введения ДНК-вакцин 35
2.2.5. Иммунный ответ
2.2.6. Исследование безопасности ДНК-вакцин 43
2. Материалы и методы
2.1.Реактивы 47
2.2. Ферменты 47
2.3.0лигонулеотиды 47
2.4.Плазмиды 47
2.5. Бактерии 48
2.6. Культуральные среды 48
2.7. Вирусы и клетки 48
2.9. Растворы 49
2.9. Методы
2.9.1. Выделение вирусной РНК 49
2.9.2. Синтез ДНК, комплементарной вирусной РНК 49
2.9.3. Амплификация фрагментов ДНК 50
2.9.4. Элюция фрагментов ДНК 50
2.9.5. Коструирование рекомбинантных ДНК 51
2.9.6. Трансформация клетокІ?. Coli плазмидной ДНК 51
2.9.7. Выделение плазмидной ДНК 51
2.9.8. Ферментативный гидролиз ДНК 52
2.9.9. Электрофоретическое фракционирование ДНК 53
2.9.10.Анализ первичной структуры ДНК 53
2.9.11 ГЭлектрофоретический анализ белка 54
2.9.12.Получение иммунной сыворотки 55
2.9.13.Иммуноферментньій анализ 55
2.9.14.Иммуноблотинг белков с иммунными сыворотками 55
2.9.15.Приготовление препарата субъединичной ваіщиньї для иммунизации 55
2.9.16.Оценка протективности экспериментальных вакцин 56
2.9.17.Оценка иммуногенности экспериментальных вакцин 57
3. Результаты и обсуждение 58
3.1 .Генно-инженерные плазмидные ДНК - кандидатные вакцины, кодирующие гликопротеин вируса весенней виремии карпа американского изолята 59
3.1.1. Рекомбинантная конструкция pcDNA-G-a 5 9
3.1.2. Конструирование рекомбииаитной плазмидной ДНК pQE-G для экспрессии гена гликопротеина вируса в E.coli - субъединичная вакцина 59
3.1.3. Исследование продукции рекомбинантного вирусного гликопротеина в клетках Е. coli 60
3.1.4. Иммуногенность экспериментальных вакцин 64
3.1.5. Защитные свойства экспериментальных вакцин 68
3.1.5.1. Эффективность экспериментальной ДНК-вакцины 71
3.1.5.2. Эффективность субъединичной вакцины 73
3.1.6. Влияние изменения дозы вводимой плазмидной конструкции и неспецифических иммуностимуляторов на эффективность ДНК-вакцинации 76
3.2. Генно-инженерные плазмидные ДНК - кандидатные вакцины, кодирующие гликопротеин референтного для России изолята вируса весенней виремии карпа 84
3.2.1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pcDNA-G-3J14 - кандидатной ДНК-вакцины 84
3.2.2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pBACarpVax-G-3JI4 - кандидатная ДНК-вакцина 89
3.2.3. Продукция рекомбинантного вирусного гликопротеина в культуре клеток 90
3.2.4. Защитные свойства в акции-кандидатов, кодирующих гликопротеин референсного для России изолята вируса весенней виремии карпа 92
3.3. Генно-инженерные плазмидные ДНК - кандидатные вакцины, кодирующие нуклеопротеин россйского изолята вируса весенней виремии карпа 95
3.4. Влияние повышенной температуры воды и ридостина на эффективность ДНК-вакцинации 100
Заключение 106
- Предрасполагающие факторы, группы риска
- Ферменты
- Генно-инженерные плазмидные ДНК - кандидатные вакцины, кодирующие гликопротеин референтного для России изолята вируса весенней виремии карпа
- Генно-инженерные плазмидные ДНК - кандидатные вакцины, кодирующие нуклеопротеин россйского изолята вируса весенней виремии карпа
Введение к работе
В аквакультуре, как и в любой другой биоиндустрии, неизбежны проблемы, связанные с заболеваниями разводимых животных. Инфекционные болезни, которые в дикой природе возникают как спорадические случаи, могут вызвать высокую смертность в условиях рыбного хозяйства, поэтому для успешного развития отрасли необходимы эффективные средства их профилактики и лечения.
Весенняя виремия карпа (ВВК) - остро протекающее высококонтагиозное заболевание, вызываемое вирусом Rhabdovirus carpio (spring viremia of carp virus, SVCV), которое является нерешенной проблемой российских рыбоводческих хозяйств. По классификации Международного эпизоотического бюро весенняя виремия карпа относится к категории особо опасных (декларируемых) болезней рыб (Office, 2002). Кроме того, в последние годы стали появляться сообщения о вспышках этого заболевания и выделении вируса в Северной и Южной Америке, в Средней и Юго-Восточной Азии. В связи с этим, в 2002 году весенняя виремия карпа была внесена в список International Aquatic Animal Health Code of the OIE как заболевание, требующее контроля по причине его распространения.
Вакцинология рыб в настоящее время только начинает развиваться, тем не менее, уже имеются достижения, которые были примечательны и с научной, и с практической точки зрения. Одним из самых приоритетных направлений в современной экспериментальной ветеринарии является разработка рекомбинантных вакцин. Во многих странах ведется активная работа по созданию и изучению свойств рекомбинантных вакцинных препаратов против целого ряда важных вирусных патогенов рыб. Наилучшие результаты были получены с ДНК вакцинами против заболеваний лососевых рыб, вызываемых раб до вирусами.
Цель настоящей работы - разработка и создание экспериментальных плазмидных конструкций - кандидатных рекомбинантных вакцин против весенней виремии карпа, и исследование их иммуногенных и протективных свойств.
В соответствии поставленной целью решались следующие задачи:
Получить штамм-продуцент фрагмента вирусного гликопротеина, как вариант субъединичной вакцины против весенней виремии карпа.
Сконструировать ряд рекомбинаитных плазмидных ДНК - кандидатных ДНК-вакцин - со вставками последовательностей, кодирующих гликопротеин или нуклеопротеин вируса.
Определить вируснейтрализующую активность в сыворотках карпов, иммунизированных каидидатными вакцинами.
Оценить способность созданных кандидатных вакцин защищать карпов при заражении вирусом в эксперименте.
» Оптимизировать процедуру вакцинации, включая подбор дозы кандидатной вакцины, использование неспецифических иммуностимуляторов, повышение температуры воды в аквариумах.
Предрасполагающие факторы, группы риска
Сезонность ВВК была известна исходно. Как и для большинства заболеваний рыб, температура воды является детерминирующим фактором в возникновении и исходе SVC. В экспериментальных условиях высокая смертность наблюдается на 10-15 день при температуре 16-17С, и меньшая - при 11-15С. Постепенное повышение температуры от 11 до 16С ведет к более быстрому развитию симптоматики заболевания (Fijan N., 1999). Заболевание не развивается у инфицированных рыб, содержащихся при 20-22С или выше. Метаболическая активность при такой температуре обеспечивает продукцию интерферона (в первые сутки после заражения) и AT (начиная с первой недели после инфицирования) на достаточном для эффективной защиты уровне (AhneW., 1986). Вспышки ВВК в естественных условиях отмечают в основном ранней весной при температуре в водоемах 10- 14С , и в хозяйствах совпадают с пересадкой годовиков прудовых рыб из зимовальных прудов в нагульные. Болезнь продолжается 1-1,5 месяца, затем, с повышением температуры воды в прудах до 18 -20С, прекращается (Aline W., 1986 and Fijan N.. 1999). Результаты этих исследований согласуются с наблюдениями, свидетельствующими о преобладании количества вспышек ВВК в весенний период. Заболевание чаще всего регистрируют с марта по июнь, но также оно может развиться и осенью (Щелкунов И. и др.). Суммируя данные из разных регионов, вспышки ВВК можно ожидать с ноября по июнь, с пиком в апреле-мае. Тропический и субтропический климат являются неблагоприятными для развития ВВК. Однако весной 2003 года в рыбоводческих хозяйствах Ирака была зарегистрирована вспышка заболевания с высокой смертностью карпов, по клинической картине очень похожей на ВВК. К сожалению, не удалось выделить инфекционный агент, вероятно, по причине неправильного забора и хранения материала от инфицированных карпов персоналом хозяйств (И.С. Щелкунов, не опубликовано). Поражаются вирусом, как молодые, так и взрослые рыбы, однако возраст рыб значительно влияет на резистентность к ВВК. По причине сезонности, основными жертвами становятся особи в возрасте 9-12 и 21-24 месяцев. И.С. Щелкунов и Т.И. Щелкунова (1989) показали, что молодые карпы были чувствительны, а полуторагодовалые рыбы оказались устойчивы к заболеванию. Сомы моложе 25 дней - восприимчивы, однако, более взрослые рыбы приобретают резистентность к заболеванию.
В свою очередь, разводимые рыбы более чувствительны, чем дикие. Причины этих различий в чувствительности к ВВК между группами и отдельными особями внутри одного вида, разнообразие вариантов течения заболевания и возраста рыб к настоящему времени до конца неизвестны (Fijan N., 1999). Основной способ передачи вируса ВВК - горизонтальный, но вертикальный (через икру) - также не может быть исключен. Горизонтальная передача может быть прямой или векторной, вода является главным абиотическим вектором. Живые вектора, вероятно, также вовлечены в передачу вируса ВВК. К ним относятся такие беспозвоночные паразиты как карповая вошь Argulus foliaceus и пиявки Piscicola piscicola, которые способны передать вирус от больной рыбы к здоровой (FijanN., 1999, AhneW. et al., 1999). 3. Клиническая картина заболевания Размножение вируса в эндотелии капилляров, а также в гематопоэтической и экскреторной тканях почек приводит к нарушению водно-солевого баланса, угнетению ИС, что, в конечном счете, приводит к гибели рыбы. Описанные ниже симптомы имеют место в случае не осложненной или экспериментальной инфекции в лаборатории. В условиях прудовых хозяйств вспышки ВВК обычно осложняются присутствием других болезнетворных агентов, главным образом бактерий. Сопутствующие и вторичные инфекции могут добавлять свои клинические признаки и увеличивать смертность. Инкубационный период при естественной инфекции в условиях рыбоводческих прудов, в зависимости от температуры, колеблется от 7 до 30 дней. Характерные внешние макроскопические признаки SVC включают: потемнение кожных покровов, вздутое брюшко, экзофтальм, кровоизлияния на коже, жабрах и передней глазной камере. Жабры бледные, у некоторых особей отмечается фибрилляция скелетной мускулатуры. Весьма специфичным является очаговое, а чаще диффузное, ерошение чешуи. Иногда наблюдают появление кожных пузырей, заполненных эксудатом. Среди внутренних симптомов доминирует отек всех органах, множественные геморрагии, перитонит и катаральный энтерит. Патологические изменения, в конечном счете, приводят к очаговой дистрофии и некрозу (FijanN., 1999, Ahne W. et al., 1999). 4. Возбудитель заболевания - вирус весенней виремии карпа Семейство Rhabdoviridae морфологически объединяет вирусы растений, рыб, млекопитающих и насекомых. Вирус весенней виремии карпа является предстваителем рода Vesiculovirus, в который входят еще четыре патогена рыб: рабдовирус мальков щуки (pike fry rhabdovirus, PFRV), рабдовирус озерной форели, вирус язвенной болезни, американский и европейский вирус угря (Hoffmann В. et al, 2002, Betts A.M. et al., 2003).
Наиболее изученные и экономически важные рабдовирусы рыб серологически не связаны с вирусом ВВК, и недавно были выделены в отдельный род Novirhabdoviras. К ним относятся: вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани (вирус ИНГТ), вирус геморрагической септицемии (ВГС) и рабдовирус змееголова. Основное отличие генома представителей этого рода - дополнительный ген, кодирующий неструктурный NV белок, расположеный между G и L генами (Kurath G. et al.,1997, Ahne W. et al., 2002). Тогда как у вируса бешенства, принадлелсащего к роду Lyssaviriis, этот участок генома представлен только фрагментом нуклеотидной последовательности, кодирующей NV белок представителей Novirhabdoviruses, а в геноме вируса ВВК и его ближайшего «родственника» - вируса везикулярного стоматита (VSV) - вовсе отсутствует (рис. 1) (Bernand J. et al., 1995). Leader N M M G L SVSV, VSV Leader N M M G Rabies virus фрагмент NV гена Leadei N M M N IHNV, VHSV Рис. 1, Организация геномов представителей семейства Rhabdoviridae. (Bernand J, et al., 1995} Цитопатический эффект при заражении культуры характеризуется маргинацией ядерного хроматина и вакуолизацией цитоплазмы с последующим набуханием, слущиванием, лизисом инфицированных клеток и формированием четких бляшек на 3-ий день при 20С. В этом случае первое потомство вируса получают через 4-6 часов с максимальными значениями титра на 10-ый и 22-ый часы после инфицирования. Один цикл роста длится 8-10 часов (Ahne W. et al., 2002,FijanN., 1999). 4.1. Структура вируса Морфология является главным критерием классификации рабдовирусов: «рабдо» означает «палочковидный». Вирион вируса ВВК имеет типичную для всех представителей семейства Rhabdoviridae форму пули; диаметр частицы 60-90 нм и длину - 90-180 нм (рис.2). Нуклеиновая кислота вириона плотно упакована в протеиновый чехол, состоящий из нуклеопротеина N (38 КДа), фосфопротеина Р (24 КДа) и РНК-полимеразы (L-белок, 200 КДа), образуя рибонуклеокапсид с винтовой симметрией около 50 нм в диаметре и длиной 3,5 мкм (рис. 2) (Ball L. et al., 1999, Poinan A. et al, 1996, Hoffmann B. et al., 2002). Среди них, нуклеопротеин - самый высококопийный белок вируса. Около 1/3 N-белка связано с РНК. Помимо своего струїсгурного предназначения, N-белок, вместе с фосфопротеином, играет важную роль в регуляции транскрипции. Процесс репликации и транскрипции вирусной РНК осуществляется через эти белок-белковые взаимодействия с температурным оптимумом для ферментативной активности РНК-полимеразы -15-20С (AhneW. et al., 2002).
Ферменты
Эндонуклеазы рестрикции BamHI, Bgill, BstEII, EcoRI, НаеШ, HindlH, Kpnl, PstI, PvuII, Sad, Xhol, Xbal, Xhol, BstNI, Pcil, Sail, Rsal, Nral, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E.coli, ДНК-лигаза фага T4, ДНК-полимераза Thermits aquaticus, обратная транскриптаза M-MuLV были получены из ТОО "Сибэнзим", Новосибирск. 2.3. ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ Олигонуклеотиды, использованные в данной работе, были синтезированы фосфонатным методом (Froehler B.C., 1986) в ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор» Горбуновым Ю.В. 2.4. ПЛАЗМИДЫ pcDNA3(+)(Qiagen) pQE31(Qiagen) pBACarpVax pBluesk(-) pQpR (PetrovNA. et aL) pJB866 (Blatny J.M. et. al.) 2.5. БАКТЕРИИ штаммы Escherichia coli JM103 (lac-proAB), thi-1, strA, supE, endAl, hsdR, sbcBIS, (Fr, traD36, proAB, lad Z M15). DH5CE(F\ ( 80d/acZAM15, recAl, endAl, gyrA96, thiA, hsdRl7(rk , mk+), supEAA, relAl, deoR) A (lacZYA-argF)m69 S17.1 RP4 2c;:Mu-Km::Tn7proresmoct (Simon R. et. al., 1983). 2.6. КУЛЪТУРАЛЬНЫЕ СРЕДЫ Среда LB. На 1л: Триптон Bacto - Юг, дрожжевой экстракт - 5г, NaCl - Юг. рН 7.2. Среда 2 YT. На 1л: Триптон Bacto - 16г, дрояокевой экстракт - Юг, NaCl - 5г. рН 7.2. Плотная агаризоваиная среда LA. На 1л: Триптон - Юг, дрожжевой экстракт - 5г, NaCl - Юг, бакто-агар - 15г. рН 7.2. 2.7. Вирусы и клетки В работе были использованы 3 штамма вируса ВВК предоставленные Всероссийским НИИ пресноводного рыбного хозяйства (г. Дмитров Московской области): 1) ЗЛ4, выделенный в 1991 г. от карпов из рыбхоза Краснодарского края; 2) М2, выделенный в 1983 г. от белого толстолобика (Молдавия) (Щелкунов Й.С., 1984); 3) KU/0204, выделенный в 2004 г. от годовиков карпа из садкового хозяйства (г. Удомля Тверской обл.). Вирусы нарабатывали в культуре эпидермальных клеток карпа - ЕРС (Fijan N., 1983) при температуре 21,5С с использованием в качестве поддерживающей среды Игла MEM с 2 % сыворотки крови эмбриона коровы (Life Technologies).
Для заражения рыб использовали свежий культуральный вирус после полного разрушения клеточного монослоя (2-3 суток с момента инокуляции). Титр вируса определяли по методу Рида и Менча (Reed L., 1938). ТЕ - 10 мМ трис-HCl, рН 7.4, 1 мМ ЭДТА. ТБЕ - 0.089 М трис-борат рН 9.0, 0.089 М борная кислота. ТАЕ - 20 мМ ацетат натрия, 1 мМ ЭДТА, 40 мМ трис, рН 8.0 доводили ледяной уксусной кислотой. Трис-глициновый буфер - 25 мМтрис рН 8.3, 192 мМ глицин. 0.1 % SDS. Буфер (х 6) для нанесения проб ДНК па ПААГ: 0,25 % бромфеноловый синий, 0,25 % ксиленцианол, 30 % глицерин. PBS - 5,84г NaCI, 4,72г Na2HP04, 2,64 г NaH2P04 2Н20, рН 7,2 - на 1 л. 2.9. МЕТОДЫ 2.9.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСНОЙ РНК (Chomczynski P., Sacchi К, 1987) Для выделения суммарной РНК клетки лизировали в 400 мкл раствора, содержащего 4 М гуанидинизотиоцианат, 50 мМ трис-НС1 (рН 7,6), 2 % саркозил Na и 0,1 М 2-меркаптоэтанол, добавляли 40 мкл З М ацетата натрия рН 5,2 и 400 мкл смеси фенол/хлороформ/из оамиловый спирт (25:25:1). Содержимое встряхивали 30 сек и выдерживали на льду 15 мин, затем образец центрифугировали при 12000 об/мин на центрифуге Eppendorf Centrifuge 5415С в течение 5 мин. Водную фазу собирали и к полученному объёму добавляли равный объём охлаждённого изопропанола, перемешивали и выдерживали 30 мин при -70С, затем пробу центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин. Осадок растворяли в 50 мкл 4М ГИТЦ, добавляли 50 мкл охлаждённого изопропанола, перемешивали и выдерживали 30 мин при -70С. После этого образец центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 мин. Осадок растворяли в 20 мкл деионизованной воды, добавляли 2 місі ЗМ ацетата натрия рН 5,2 и 55 мкл ледяного этилового спирта, перемешивали и выдерживали при -70С 30 мин. Далее проводили центрифугирование при 13000 об/мин в течение 5 мин, осадок промывали этиловым спиртом, высушивали на воздухе и растворяли в 10 - 20 мкл деионизованной воды. 2, 9.2. СИНТЕЗ КОМПЛИМЕНТАРНЫХ ДНК Синтез первой цепи кДНК на мРНК проводили при 42СС в течение 2 часов в следующей реакционной смеси: 0.05 М Трис-HCI, рН 8.3, 0.15 М КС1, 5 мМ MgCl, 0.01 М 2-меркаптоэтанол, 0.5 мМ dNTP, 50 мкг/мл мРНК, 10 мкг/мл соответствующего олигонуклеотидного праймера, и 25 ед.акт. обратной транскриптазы AMV. Реакцию останавливали прогреванием при 95С в течение 5 мин. 2.9.3. АМПЛИФИКАЦИЯ ФРАГМЕНТОВ ДНК В качестве матрицы в полнмеразной цепной реакции с Taq- ДНК-пол им ераз ой использовали либо первую цепь кДНК, либо плазмидную ДНК. Реакцию проводили в буфере, рекомендованном фирмой-изготовителем, при этом один цикл состоял из: I стадия - денатурация матрицы - 94С. 1 мин; II стадия - отжиг праимеров на матрице - температура отжига, 1 мин; III стадия - реакция полимеризации - 72С, 1 мин. Обычно проводили 20-40 циклов реакции. В качестве праимеров были использованы олигонуклеотиды, комплементарные 5- и 3 - концам искомого фрагмента на матрице. Продукты реакции анализировали в 4 % полиакриламидном геле. 2.9.4. ЭЛЮЦИЯ ФРАГМЕНТОВ ДНК из ПААГ Выделение фрагментов ДНК из геля проводили модифицированным методом электроэлюции на бумагу ДЕ-81, предварительно обработанную 1.5 М NaCl, дистиллированной водой и 96 % этанолом, в ТБЕ буфере в аппарате для диск-электрофореза фирмы Reanal (ВНР) в течение 2 часов при напряжении 250 В. Десорбцию фрагментов ДШС с бумаги осуществляли инкубацией при 65С в 1.5 М NaCi в течение 10 мин. Элюат переносили в пробирку центрифугированием. Процедуру повторяли три раза. ДНК после элюции переосаждали этанолом. Выход ДНК составлял 70-80 %. Выделение фрагментов ДНК из ПААГ проводили методом пассивной элюции (Гаврилова И.В. и др., 2001).
Гель хорошо измельчали, заливали 400 мкл буфера для элюции, перенесосили на шейкер на 5 мин, далее инкубировали при комнатной температуре в течение 16 ч. К смеси добавляли 200 мкл ледяного 70 % этанола и 400 мкл фенола (рН 8,0), хорошо перемешивали и центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин. К супернатанту добавляли 1 объем смеси фенол/хлороформ, интенсивно перемешивали и центрифугировли 10 мин при 13000 об/мин. К верхней водной фазе добавляли 5 мкл осадителя (10 % раствор декстрана); 1/10 объема NaAc (рН 8,0) или 1/50 объема NaCl; 600 мкл изопропанола. Инкубировали 15 мии при -20С, ДНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 13000 об/мин. Осадок растворяли в воде и дважды переосаждали этиловым спиртом. 2.9.5. КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК Для клонирования одиночных фрагментов или сшивки нескольких фрагментов ДНК в лигазную смесь вносили 0.5 пкМ (до 100 нг) ДНК векторной плазмиды, расщепленной соответствующей рестриктазой и эквимолярные количества фрагментов. Лигирование вели в течение 10-12 часов при 11С или 2 часов при 16С в буфере, содержащем 66 мМ трис-НСІ, рН 7.6. 8 мМ MgCb, 5 мМ ДТТ и 1 мМ АТФ. На 1 мкг ДНК использовались 1-2 ед.акт. ДНК-лигазы фага Т4. 2.9.6. ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК Е.соїі ПЛАЗМИДНОЙ ДНК Трансформацию проводили по стандартному методу (Маниатис Т., 1984) с модификациями или методом электропорации с использованием прибора фирмы Bio-Rad согласно рекомендациям изготовителя. В первом случае 1 мл клеточной культуры, достигшей оптической плотности D600=0.4-0.6 о.е., центрифугировали 1 мин. при 4000 об/мин. Осадок ресуспендировали на холоду в 1мл буфераї: 10 мМ MOPS, 10 мМ RbCl, рН 7.0. Суспензию центрифугировали 1 мин. при 4000 об/мин, осадок ресуспендировали в буфере 100 мМ MOPS, 10 мМ RbCL, 50 мМ СаС12, рН 6.5, и оставляли во льду на 15 мин. После центрифугирования в течение 40 сек. при 3000 об/мин тщательно удаляли супернатант, ресуспендировали осадок в 0.2 мл буфера 2, добавляли 3 мкл ДМСО и не более 10 мкл раствора, содержащего Блазмидную ДНК. Смесь выдерживали во льду в течение 30 мин., затем прогревали 2 мин при 42С, добавляли 1 мл среды LB и выдерживали 60 мин при 37С. После чего бактерии высевали на агаризованную среду с соответствующим антибиотиком. Для трансформации клеток Е.соїі плазмидной ДНК методом электропорации 1 мл клеточной культуры, достигшей оптической плотности Вбоо=0-3 о.е., центрифугировали 1 мин при 6000 об/мин в охлажденном роторе. Осадок ресуспендировали в 1 мл деионизованиой воды.
Генно-инженерные плазмидные ДНК - кандидатные вакцины, кодирующие гликопротеин референтного для России изолята вируса весенней виремии карпа
Для получения максимального защитного эффекта от вакцинации, в первую очередь, необходимы подбор оптимальной дозы препарата, совпадение времени заражения с пиком развивающегося иммунного ответа у рыб, а также наибольшая гомология антигенспецифических свойств штаммов вируса, используемых при создании вакцины и заражения рыб. Иммуногенной основой вышеописанной ДНК-вакцины pcDNA-G-a был ген гликопротеина американского изолята, но для российской аквакультуры перспективнее было бы создать вакцину на основе референсного штамма вируса ВВК. Устранение возможных различий в антигенной структуре иммуногенных белков, кодируемого вакциной и входящего в состав вируса, используемого для экспериментального заражения, возможно, позволит достичь максимального защитного эффекта от вакцинации в нашем регионе. 3.2.1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pcDNA-G-3JI4 -кандидатной ДНК-вакцины Для создания экспериментальной вакцины, которая бы специфично «работала» против референсного в отечественной акваиндустрии изолята вируса ВВК, была сконструирована плазмидная ДНК, содержащая полноразмерный ген гликопротеина российского изолята ЗЛ4. Поскольку размер G-гена вируса довольно большой (1530 п.н.), целесообразно было вести амплификацию его последовательности по частям. Выбор праймеров осуществлялся на основе анализа иуклеотиднои последовательности G-гена и межгенных районов вируса ВВК референсного европейского штамма Fijan. Последовательности двух пар используемых праймеров представлены на рисунке 3.9. Праймеры имеют сайты узнавания рестриктаз, что позволяет после амплификации вести клонирование фрагментов в векторную ДНК более эффективно по "липким" концам. На первом этапе, для секвенирования двух полученных фрагментов G-гена, проводили их клонирование по стандартной методике в плазмидныи вектор pUC19 (Invitrogene) (рис. ЗЛО). Из литературы была известна последовательность генома только европейского штамма вируса. Секвенирование последовательности ДНК наших клонированных фрагментов подтвердило то, что они действительно кодируют гликопротеин вируса БВК. Было обнаружено 9 нуклеотидных замен в отношении референсного европейского штамма Fijan, три из которых значимые, приводят к заменам аминокислотных остатков: изолейцина в 61 положении на триптофан, лизина в 350 положении на глутамин и лейцина на аргенин в 497 положении. Вырывниваиие нуклеотидыых последовательностей генов гликопротеина вируса ВВК штаммов Fijan и ЗЛ4 представлено на рис. 3.11.
На следующем этапе было проведено клонирование двух полученных его фрагментов в плазмидный вектор pBluSK(-) для сборки полноразмерного вирусного гена и «правильной» его ориентации в полилинкере pcDNA3 (рис. 3.10). Конечная конструкция pcDNA-G-3JI4 - кандидатная ДНК-вакцина -содержит таким образом вставку полноразмерного гена гликопротеина штамма ЗЛ4 вируса ВВК под контролем цитомегаловирусного промотора (рис. 3.12). 3.2.2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pBACarpVax-G-ЗЛ4 - кандидатной ДНК-вакцины Для создания почти всех существующих к настоящему времени экспериментальных ДНК-вакцин против самых разных патогенов человека и животных были использованы плазмидные вектора с CMV промотором, который обеспечивает высокий уровень продукции целевого рекомбинантного белка во многих типах эукариотических клеток (Schmidt Е. et.al.). Однако существует мнение, что цитомегаловирус человека является этиологическим агентом при развитии некоторых злокачественных опухолей. Поэтому, введение в организм человека и употребление в пищу продуктов (в нашем случае рыбы), содержащих ДНК этого вируса, может вызывать опасения. В нашей экспериментальной ДНК-вакцине, как было сказано ранее, экспрессия рекомбинантного G-гена в плазмидном векторе pcDNA3 проходит под контролем цитомегаловирусного промотора, что могло бы впоследствии привести к трудностям при прохождении вакцины через разрешительные инстанции. Это стало причиной для поиска замены CMV промотору в составе ДНК-вакцины. В работе Gomez-Chiarri et al. (1999) было показано, что (3-актиновый промотор карпа в составе плазмидного вектора способен обеспечить высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка, хотя и немного ниже, чем CMV промотор. Для получения уровня продукции, который достигается при использовании CMV промотора, необходимо увеличить дозу плазмидной ДНК со вставкой Р-актинового промотора карпа (Rasmussen J. et.al). Нашими коллегами из Датской ветеринарной лаборатории (г. Орхус) CMV промотор в исходном векторе pVaxl (Invitrogene) был заменен на J3-актиновый промотор карпа. Полученный плазмидный вектор pBACarpVax был использован нами при конструировании варианта ДНК-вакцины против ВВК. Для создания конструкции pBACarpVax-G-3JI4 - безопасной ДНК-вакцины против ВВК, последовательность гена гликопротеина из pcDNA-G-3J14 была клонирована нами в предоставленную векторную плазмиду pBACarpVax по сайтам рестрикции EcoR I/Xho І (рис. 3.13). Конечная конструкция pBACarpVax-G-ЗЛ 4 - каидидатная ДНК-вакцина -содержит таким образом вставку полноразмерного гена гликопротеина российского референсного штамма ЗЛ4 вируса ВВК под контролем промотора 0-актина карпа (рис. 3.13). 3.2.3. Продукция рекомбинантного вирусного гликопротеина в культуре клеток Для подтверждения способности созданной нами генно-инженерной конструкции pBACarpVax-G-ZL4 обеспечивать экспрессию гена рекомбинантного вирусного гликопротеина нашими коллегами из Датской ветеринарной лаборатории были трансфецированы клетіш культуры ЕРС. В результате эксперимента иммунохимически гликопротеин вируса ВВК был выявлен в мембране и цитоплазматических везикулах трансфецированных клеток. 3.2.4.
Защитные свойства вакцин-кандидатов Эффективность полученных конструкций тестировали по схеме, аналогичной для экспериментальных вакцин со вставкой гена гликопротеина американского изолята вируса ВВК, описанной ранее. Проведенные испытания показали, что в/м инъекция 1 міст кандидатной ДНК-вакцины pcDNA-G-3JI4 на грамм массы тела рыбы обеспечивает выживаемость 43 % карпов в группе, с ИЗ - 37 % в случае заражения вирусом ВВК на восьмой неделе после иммунизации. При заражении на десятой неделе, значения данных показателей составили 82 % и 72 %, соответственно. Кандидатная ДНК-вакцина pcDNA-G-a в этом эксперименте продемонстрировала самую высокую протективность: выживаемость 92,9 % рыб, индекс защиты 89 %. При сравнении с результатами предыдущих аналогичных экспериментов с ДНК-вакциной со вставкой G-гена американского изолята (эксперименты 1 и 2) и настоящего эксперимента выявляется незначительно большая эффективность конструщии pcDNA-G-a (табл. 8). В этом эксперименте еще раз было подтверждено, что наиболее оптимально для развития эффективного защитного ИО проводить заражение вирусом через 10 недель после введения препарата ДНК-вакцины. Защитный эффект конструкции pcDNA-G-3JI4 был немного ниже. Вероятнее всего это обусловлено большей гетерологичностью между изолятами вируса ВВК, используемыми при создании этого варианта ДНК-вакцины (ЗЛ4) и для заражения (М2). Молдавский изолят М2 входит в одну гено-группу с американским, тогда как ЗЛ4 относят к группе 5, с несколько отличающимися антигенными свойствами. Представителей каждой подгруппы, как правило, связывает общая география происхождения (Shchelkunov I.S. et.al., 2005). Генетические различия двух данных групп вирусов подкрепляется полученными ранее данными об их антигенном различии. Последнее выражалось в том, что кроличья и карповая гипериммунные антисыворотки к штамму М2 вируса ВВК нейтрализовали изоляты из России и стран СНГ и не распознавали европейские изоляты вируса (Bjorklund Н., 2002). Кроме того, Щелкуновым недавно установлено, что антисыворотки карпа, полученные на штамм ЗЛ4, не распознают европейские штаммы вируса и слабо нейтрализуют отечественные штаммы из других геногрупп (не опубликованные данные). Тогда как, антисыворотки на штамм М2 и европейсіше штаммы вируса свободно распознают и нейтрализуют все отечественные изоляты вируса.
Генно-инженерные плазмидные ДНК - кандидатные вакцины, кодирующие нуклеопротеин россйского изолята вируса весенней виремии карпа
Наиболее подходящим кандидатом на роль иммуногенной основы для рекомбинантной вакцины против ВВК, несомненно, является, расположенный на поверхности вириона трансмембранный гликопротеин. Однако в литературе описаны работы по ДНК-иммунизации смесью плазмид, содержащих последовательности, кодирующие два разных вирусных гена. Протективные свойства подобных комбинированных препаратов зачастую выше, чем у вакцин, содержащих только один вирусный ген. В связи с этим, одной из задач работы являлось создание генетической конструкции, кодирующей ген нуклеопротеина вируса ВВК, и ее тестирование на рыбах в качестве самостоятельной ДНК-вакцины, и для иммунизации смесью плазмид, несущих гены гликопротеина и нуклеопротеина данного патогена. Для создания такой генно-инженерной конструкции была разработана схема сборки полноразмерного гена нуклеопротеина российского изолята вируса (рис. 3.15). Для повышения эффективности клонирования гена нуклеопротеина вируса ВВК была использована ПЦР-технология с применением синтетических праймеров. Поскольку размер N-гена вируса довольно большой - 1332 п.н., целесообразно было вести амплификацию его последовательности по частям. Выбор праймеров для инициации реакции ОТ-ПЦР осуществлялся на основе анализа нуклеотидной последовательности N-гена и межгеиных районов вируса ВВК референсного штамма Fijan (рис. 3.16). На первом этапе, для секвенирования полученных фрагментов N-гена, проводили их клонирование по стандартной методике в плазмидный вектор pUC 19. Идентификацию рекомбинатных клонов осуществляли рестриіщионньш анализом и электрофорезом в агарозном геле. Из литературы известна лишь последовательность генома европейского штамма вируса ВВК. Секвенирование последовательности ДНК наших клонированных фрагментов подтвердило то, что они действительно кодируют нуклеопротеин вируса ВВК (рис. 3.17). Было выявлено 55 замен в отношении референсного европейского штамма Fijan, восемь из которых значимые, приводят к заменам аминокислот. На следующем этапе было проведено клонирование всей последовательности гена нуклеопротеина в плазмидный вектор pBACarpVax. Конечная конструкция pBACarpVax-N-3JI4 - содержит таким образом вставку полноразмерного гена нуклеопротеина вируса ВВК российского изолята ЗЛ4 под контролем промотора р-актина карпа для наработки нуклеопротеина в эукариотических клетках (рис. 3.15. продолжение).
Для исследования иммуногенных и протективных свойств данной плазмидной ДНК был поставлен эксперимент на пяти группах рыб, получивших следующие рекомбинантные плазмидные ДНК в дозе 1мкг/г массы тела рыбы: pBACarpVax-G-3JI4 1 мкг рВАСагрУах-]Ч-ЗЛ4 1 мкг рВАСагрУах-0-ЗЛ4 1 мкг + рВАСагрУах-М-ЗЛ4 1 мкг pBACarpVax 1 мкг буфер Введение конструкции рВАСагрУах-1Ч-ЗЛ4 практически не защищало иммунизированных рыб при экспериментальном в/б заражении вирусом ВВК. Инъекция рВАСагрУах-М-ЗЛ4 обеспечивала только достоверное увеличение среднего времени выживания в этой группе рыб, свидетельствующее о том, что процесс гибели растянут во времени (0,01 Р 0,05). Это является выгодным признаком при развитии болезни на фоне весеннего подъема температуры воды. В группе рыб, получивших обе плазмидные конструкции, защитный эффект не отличался от такового при введении одной кандидаткой ДНК-вакцины рВАСагрУах-С-ЗЛ4 (Р 0,05). 3.4. Влияние повышенной температуры воды и ридостина на эффективность ДНК-вакцинации С целью повысить эффективность «российской» кандидатной ДНК-вакцины (pcDNA-G- 4) процедура иммунизации в случае заражения через 8 недель после иммунизации была несколько модифицирована. В эксперименте две из четырех опытных групп рыб помещали в отдельный бассейн, температуру воды в котором через сутки поднимали до 17-19С и поддерживали в течение 10 дней, затем их возвращали в аквариум с температурой воды 13-15С. Для вакцинации двух групп использовали совместное с плазмидой введение иммуностимулятора ридостина (R) (НИКТИБАВ, Бердск). В одной группе рыб были проделаны обе эти дополнительные процедуры. Таким образом, эксперимент был поставлен на следующих группах рыб: 1. pcDNA-G-3JI4 - интактная ДНК-вакцина; 2. pcDNA-G-3JI4, R - ДНК-вакцина + ридостин в дозе 1 мкг/кг ихтиомассы; 3. pcDNA-G-3JI4, t - ДНК-вакцина + 10 дней рыбы при 17-19С; 4. pcDNA-G-3JT4, R+ t- ДНК-вакцина + ридостин + 10 днейпри 17-19С; 5. pcDNA3, R - контрольная плазмида + ридостин в дозе 1 мкг/кг ихтиомассы; 6. pcDNA3, f - кої-ітрольная плазмида + 10 дней при 17-19С; 7. pcDNA3, R+1 - контрольная плазмида + ридостин+ 10 дней при 17-19С. Ридостин (Ridostinum) - иммуномодулирующее и противовирусное лекарственное средство, основным действующим началом которого является двуспиральная рибонуклеиновая кислота (ДС РНК) киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Поскольку действующее начало имеет физико-химическую структуру, близкую к структуре генетического материала патогенных вирусов и бактерий, то введение ридостина вызывает мощный ИО в организме, включающий индукцию интерферона. Ридостин обладает выраженной а-у-интерферон-индуцирующей активностью. Его относят к индукторам "раннего типа". В результате его действия происходит быстрый запуск мощного механизма противовирусной защиты. В іслетках организма интерферон индуцирует экспрессию ряда белков, которые ингибируют трансляцию РНК. В их состав входят 2 ,5 -олигоадеиилатсинтетаза, протеинішназа Р1 и Мх белки (Acosta F. et.al.).
Одним из эффектов ридостина также является увеличение экспрессии генов главного комплекса гистосовместимости и нормализация соотношения субпопуляций Т-лимфоцитов (Т-хелперы/Т-супрессоры). Помимо этого идет активная стимуляция фагоцитарной активности макрофагов и нейрофилов периферической крови и другие процессы неспецифической резистентности, противодействующие инфекции (вектормедика). Две примечательные особенности четко проявились в этом эксперименте. Первая - неожиданное отсутствие защитного эффекта при введении ДНК-вакцины в комплексе с ридостином (табл. 9). Однако ранее было показано высокоэффективное действие ридостина против вируса ВВК, продолжавшееся не менее месяца (Alikin Y.S. et.al. 2000). По-видимому, одновременное введение ридостина с ДНК-вакциной значительно ускорило элиминацию плазмиды из тканей карпа и привело к тому, что рекомбинантный G-белок синтезировался в недостаточном количестве, это негативно отразилось на напряженности развивающегося иммунного ответа к данному АГ. Действие самого ридостина к моменту заражения (через 8 недель) почти закончилось и выражалось только достоверном увеличении средней продолжительности выживания в группе, получившей вместе с этим препаратом пустой плазмидный вектор pcDNA3 (рис. 3.18, табл. 9). Вторая особенность, выявленная в эксперименте - усиление защитного эффекта от вакцинации в группе рыб, которых содержали в течение 10 дней после введения плазмидной конструкции при повышенной до 17-19С температуре воды. На 17-е сутки после заршкения только для этой группы рыб показатели защиты были достоверно выше таковых в контрольной группе и опытной группе с интактной вакциной. К концу эксперимента (80-е сутки после заршкения) различие по отношеншо к контрольной группе сохранилось на прежнем уровне достоверности, но стало недостоверным по отношению к группе рыб, получивших интактную вакцину. В то же время в последнем случае сохранилась достоверность различий по индексу защиты (рис. 3.18, табл. 10):
