Содержание к диссертации
Оглавление 2
Список сокращений 4
Введение 5
Обзор литературы 9
2.1. Фотодипамическая терапия 9
Физико-химические свойства ФС 12
Внутриклеточная локализация ФС 15
Методы доставки ФС в опухолевые ткани и клетки 20
2.2. Направленная внутриклеточная доставка ФС в ядра опухолевых клеток-мишеней ...26
Рецептор-опосредованный эндоцитоз 28
Цитоплазм єно-ядерный транспорт 38
Транслокационный домен дифтерийного токсина: преодоление эндосомного барьера 45
Использование носителей 49
Создание молекулярных конструкций для направленного транспорта ФС 50
3. Материалы и методы 53
3.1. МРТ 53
Структура и состав МРТ 53
Плазмиды, кодирующие МРТ 53
Экспрессия МРТ в бактериальных клетках 56
Выделение и очистка МРТ 57
Рефолдипг лигандного модуля МРТ 58
3.2. Получение импортинов 58
3.2.1 Плазмида, кодирующая р-импортин 58
Трансформация клеток 59
Клетки, экспресс ирующие ot-импортин 60
Экспрессия импортинов в бактериальных клетках 60
Выделение и очистка сс-импортина 61
Выделение и очистка р-импортина 62
Измерение концентрации белка 62
Электрофорез белков 63
Вестерп-блот препаратов МРТ 63
Получение препаратов МРТ и ЭФР, меченных |251 64
Фотосенсибилизатор 65
3.7.1. Получение водного раствора тринатриевой соли хлорина efi 65
3.8. Синтез и очистка коныогатов МРТ с ФС 66
3.8.1 Активация карбоксильных груші хлорина Сь 66
Синтез коныогата МРТ- ФС 66
Очистка коныогата 67
3.9. Культура клеток 68
Определение количества рецепторов к ЭФР и МРТ на поверхности клеток А431 и констант сродства радиоактивно меченных ЭФР и МРТ к рецепторам 68
Анализ связывания и эидоцитоза ЭФР рецепторами па поверхности клеток А431 ..69
Исследование сродства лигандов к рецептору ЭФР клеток А431 70
Получение монослойных липосом, нагруженных флуоресцентным красителем 71
Определение мембранолитичсского действия рскомбннаптных белков на липосомы „ 72
Исследование деградации [' Э1]-МРТ клетках А431 73
Анализ связывания МРТ с комплексом импортшюв , 74
Модификация поверхности сенсорных чипов 75
Получение комплекса импортшюв 76
Получение кинетических кривых взаимодействия МРТ с импортипами 76
Математическая обработка кинетических кривых 76
3.17. Определение внутриклеточной локализации МРТ 77
3.17.1, Инкубация клеток с МРТ , 77
3.17.2. Иммунофлуоресцсптное окрашивание клеток 78
3.17.3, Окрашивание клеточных ядер 79
3.17.4. Получение и обработка изображений 79
3.18. Исследование эффективности ФДД ФС 80
Инкубация клеток с ФС 80
Облучение 81
Определение выживаемости клеток 81
4. Результаты 82
4.1. Получение и очистка МРТ 82
Иммупоблотинг ИМР-(СЯЛ 5У40)-ДТокс-сп-ЭФР 85
Получение и очистка импортшюв 85
Модификация поверхности чипов СМ5 с помощью МРТ 86
Взаимодействие МРТ с гетеродимером сс/р-импортшюв 89
Взаимодействие МРТ с а-импортином и р-импортином 94
Характеристика клеточной модели 96
4.7, Характеристика клеточной модели 97
4.8. Влияние спейссра на сродство МРТ к рецептору ЭФР клеток А431 98
Влияние спейсера на сродство МРТ к рецептору ЭФР клеток А431 99
Влияние рсфолдинга лиганда па сродство МРТ к клеточному рецептору 101
Исследование связывания радиоактивно меченных МРТ с клетками А431 102
Влияние МРТ на целостность липидной мембраны 106
Деградация МРТ в клетках 108
Внутриклеточная локализация МРТ 112
Эффективность фотодинамического действия ФС 113
5. Обсуждение результатов 117
5.1. Сигнал ядерной локализации 117
5.2.Лиганд 120
Эндосомолитический модуль 123
Внутриклеточная локализация МРТ 125
Эффективность фотодинамического действия ФС 125
Заключение 127
Выводы 128
Список литературы 129
Список сокращений
аМСГ - а-мслаиоцит-стимулирующий гормон,
CHAPS -3-[(3-холамидопропил)-диметиламмонио]-1-пропап-сульфонат (3-[(3-
cholamidopropyl)-dimethyl-ammonio]-l-propane sulfonate),
DMEM - среда Игла, модифицированная Дульбекко (Dulbecco Modified Eagle's
Medium),
ELISA -твердофазный иммуиоферментный анализ (enzyme linkedimmuno sorbent
assay),
MG132 - ингибитор протеасом карбоксибензил-Ь-лейцин-Ь-лейции-лейциналь,
Ni-NTA-агароза - никсль-ншрозогриацетат-агароза,
РТАС58 - 54 кД компонент белкового комплекса, опосредующего транспорт через
ядерную пору (pore-targeting complex),
РТАС97 - 90 кД компонент белкового комплекса, опосредующего транспорт через
ядерную пору {pore-targeting complex),
АФК - активные формы кислорода,
БСА - бычий сывороточный альбумин,
ДДС-Na - додецил сульфат натрия,
ДТокс - транслокационный домен дифтерийного токсина,
ДТТ - дитиотрейтол,
ИПТГ - изопропил-р-О-тиогалактопираиозид,
КЯП - комплекс ядерной поры,
ЛИП -липопротеин низкой плотности,
МРТ- модульный(с) рекомбинантный(е)транслортер(ы),
НМР - бактериальный гемоглобиноподобный белок (hemoglobin-like protein),
ПГП - производные гематопорфирииа,
ППР - поверхностный плазмонный резонанс,
сп - аминокислотный спейсер,
среда оУГ-среда с повышенным содержанием питательных веществ (double yeast
tryton),
СЯЛ - сигнал ядерной локализации,
СЯЛ SV40 - сигнал ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV40,
СЯЭ - сигнал ядерного экспорта,
ФДД - фотодинамическое действие,
ФДТ - фотодинамическая терапия,
ФМСФ - фенил метил сул ьфонил фторид,
ФС - фотосенсибилизатор(ы),
ЭГТА - (этилепгликоль бис(2-аминоэтилэфир))1Ч, N, N', N'-тетраацстат натрия,
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия,
ЭФР - эпидермальный фактор роста.
Введение к работе
Протекание деструктивных реакций в белках, липидах и нуклеиновых кислотах под действием света при участии фотосепсибилизаторов (ФС) и кислорода лежит в основе быстро развивающегося метода лечения злокачественных новообразований - фотодинамической терапии (ФДТ), заключающегося в уничтожении клеток опухоли после облучения её светом, поглощаемым ФС, который накопился в этой опухоли. Перенос энергии от молекулы ФС, перешедшей под действием света в возбужденное триплетиос состояние, приводит к генерации активных форм кислорода (АФК, в первую очередь синглетного кислорода 1Ог, и свободных радикалов *ОН, Н02*), способных окислять большинство биологически важных молекул, что вызывает разрушение клеточных структур и гибель клеток.
Нормальные клетки также могут накапливать ФС, что является причиной серьезных побочных эффектов, таких, например, как повышенная фоточувствительность кожи и сетчатки глаз. Из-за высокой реакционной способности пробег АФК в клетке ограничен несколькими десятками нанометров (Hutchinson, 1957; Takemura et al., 1989; Moan and Berg, 1991; Elgohary et al., 1998; Li et al., 1999), и их повреждающий эффект проявляется вблизи места их образования. Клеточные компартменты имеют разную чувствительность к окислительным реакциям, поэтому эффективность действия ФС зависит от их внутриклеточного распределения. Все имеющие терапевтическое значение ФС преимущественно локализуются в не самых чувствительных к их действию компартментах клетки -мембранных структурах, цитозоле, по не в ядре, которое наиболее чувствительно к деструктивным окислительным реакциям, осуществляемым АФК (Wiseman and HalHwell, 1996, Sobolcv et al., 2000). Это приводит к необходимости введения в организм высоких доз ФС для получения терапевтического эффекта. Специфическая внутриклеточная доставка ФС в ядра раковых клеток является актуальной задачей биофизики клетки, поскольку могла бы значительно повысить эффективность фотодинамической терапии и снизить ее негативное воздействие на организм.
Адресную доставку ФС в ядра раковых клеток-мишеней можно осуществить, используя естественные клеточные механизмы транспорта макромолекул с помощью
модульных рекомбипаптных транспортеров (МРТ) (Roscnkranz et al., 2003). Молекула MPT с присоединенным к ней ФС в процессе внутриклеточного транспорта в ядра опухолевых клеток-мишеней выполняет за счет своих модулей несколько разных функции, последовательно взаимодействуя с компонентами клетки, определяющими различные этапы транспорта макромолекул. Избирательность накопления ФС в опухолевых клетках определяется связыванием лигаида в составе МРТ с теми иптернализуемыми клеточными мембранными рецепторами, содержание которых значительно повышено в опухолевых клетках. К таким рецепторам относятся, например, рецепторы для инсулина, эпидермального фактора роста (ЭФР), липопротеипов низкой плотности, соматостатипа и др. (см обзор (Sobolev et al., 2000)). Дальнейший транспорт ФС в наиболее уязвимый к их действию компартмент клетки - ядро - определяется наличием в составе транспортера дополнительных модулей. Эти модули обеспечивают транспорт ФС из эндосом, в которые попадают поглощенные в результате рецептор-опосредованного эпдоцитоза МРТ, в ядро. Первый из этих модулей - транслокационпый домен дифтерийного токсина - отвечает за выход транспортеров из эндосом в цитозоль, где второй из дополнительных модулей - сигнал ядерной локализации - обеспечивает ядерную доставку МРТ, где и проявляется в наибольшей степени фогоцнтотоксический эффект присоединенного к транспортеру ФС. Высокая эффективность данного подхода была продемонстрирована на культуре клеток мелаиомы с использованием ряда МРТ для адресной доставки ФС в ядра клеток-мишеней (Sobolev et al., 2000; Rosenkranz et al., 2003; Розеикранц и др., 2003), содержащие в качестве лигандпого модуля сс-меланоцит-стимулирующий гормон, рецепторы к которому сверхэкснрессированы у клеток мелаиомы.
Как уже упоминалось, специфичность по отношению к опухоли определяется природой входящего в состав транспортера лиганда, что позволяет создавать модульные полипептиды для направленного транспорта в различные типы опухолевых клеток. Повышенная экспрессия рецепторов к ЭФР наблюдается при многих опухолях (плоскоклеточный рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, молочной железы и многие другие (Kolibaba and Druker, 1997; Mendelsohn and
Baselga, 2000; Ford and Grandis, 2003)), что позволяет использовать ЭФР для избирательной доставки ФС в клетки соответствующих опухолей.
При создании нового МРТ за основу был взят транспортер для адресной доставки в клетки меланомы, исследованный ранее (Rosenkranz ct al., 2003; Розсикранц и др., 2003), в котором лигаид - мсланоцит-стимулирующий гормон -был заменен последовательностью эпидермального фактора роста человека. Новый МРТ содержит также последовательности траислокационного домена дифтерийного токсина (ДТокс), для обеспечения выхода транспортера из замкнутых внутриклеточных компартментов - эндосом, сигнала ядерной локализации большого Т-аптигепа вируса SV-40 (СЯЛ SV40), а таюке бактериального гемоглобиноподобного белка (НМР), служащего носителем для ФС. Молекула ЭФР более чем в четыре раза превосходит по размеру использованный в предыдущих работах лигапдпый модуль - а-меланоцит-стимулирующий гормон. Такое изменение конструкции МРТ может сказаться па его функционировании. Включение нескольких пептидных модулей в состав единой полипептидной цепи таюке может существенно отразиться на их способности вступать во взаимодействия с ключевыми участниками транспорта МРТ и, как следствие, на эффективности транспорта, В связи с этим представляется актуальным исследование влияния особенностей взаимодействий МРТ с клеточными компонентами транспорта на эффективность фотоцитотоксического действия ФС, присоединенного к МРТ. Полезным инструментом для исследования взаимного влияния модулей в составе единой белковой молекулы на эффективность доставки ФС является использование транспортеров, дефицитных по одному из функциональных модулей.
Целью настоящей работы было исследование влияния структуры и состава модульных рекомбинаитиых транспортеров для направленной внутриклеточной доставки ФС, содержащих эпидермальпый фактор роста в качестве лиганда, на их функциональные свойства и эффективность действия.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие практические задачи:
Исследовать особенности взаимодействия отдельных модулей рекомбинаитиых транспортеров (лиганда, эпдосомолитика и сигнала ядерной локализации) с соответствующими клеточными компонентами транспорта в зависимости от модульного состава транспортеров.
Исследовать эффективность фотодинамического действия копъюгатов
фотосепсибилизаторов с модульными рекомбинаитными
транспортерами на клетках in vitro.
Проанализировать взаимное влияние отдельных модулей иа функционирование остальных модулей и транспортеров в целом.
2. Обзор литературы
2.1. Фотодинамическая терапия
В настоящее время все большее распространение в клинической онкологии находят новые методы диагностики и лечения опухолевых заболеваний, основанные на современных достижениях фотохимии, фотобиологии и квантовой физики. Одним из таких перспективных подходов является фотодинамическая терапия -современный метод лечения рака, заключающегося в уничтожении клеток опухоли после облучения её светом, поглощаемым ФС, который накопился в этой опухоли. При этом происходит образование активных форм кислорода, таких как синглетный кислород, супероксид-анион радикал, гидроксильпый радикал и др., мишенями для которых в клетке служат различные молекулы (белки, липиды, нуклеиновые кислоты) и образуемые ими надмолекулярные структуры. В результате сложной последовательности фотохимических и фотобиологических процессов происходит необратимое разрушение раковых клеток и/или сосудистой системы опухоли.
Идея использования фотоактивирусмых химических соединений для лечения различных заболеваний далеко не нова: еще в Древнем Египте применяли растения, содержащие псоралены, и солнечный свет для лечения витилиго (заболевание кожи), однако, научное объяснение данному явлению было дано лишь в первой половине XX века. Применение в клинике этот подход получил только в конце семидесятых годов прошлого столетия, когда для лечения рака кожи была успешно использована смесь производных гематопорфирина (ПГП), состоящая из мономеров, димеров и олигомеров порфирииа (Dougherty et al., 1978). Позднее компанией QLTPhotoTherapeutics (Ванкувер, Канада) был запатентован первый препарат для ФДТ - Фотофрин, представляющий собой очищенную смесь ПГП. Несмотря на то, что во многих странах Фотофрин и по сей день достаточно успешно используют для лечения некоторых видов рака (легких, кожи, молочной железы и др.), а также некоторых неопкологических заболеваний, этот препарат имеет два существенных недостатка. Во-первых, ПГП накапливаются в раковых клетках неспецифически и очень медленно выводятся из организма, оставаясь в организме в течение 2-3
месяцев, что приводит к повышенной фоточувствителыюсти кожи и сетчатки глаз (Sharman et al., 1999). Во-вторых, спектральные характеристики Фотофрина не удовлетворяют одному из важных требований, предъявляемому к ФС, - они должны иметь интенсивный максимум поглощения в красной и ближней инфракрасной области спектра (660 - 900 им), так как с увеличением длины волны света возрастает его способность проникать в животные ткани. Небольшой пик при 630 им в спектре поглощения Фотофрина не позволяет использовать его для эффективной ФДТ обширных и глубокорасположеиных опухолей (Миронов, 1996; Sharman ct al., 1999).
Большое количество новых ФС было создано за последние 20-30 лет и продолжает разрабатываться и по сей день. Их можно разделить на 3 больших группы: 1) ФС на основе порфирина (Фотофрин и др.), 2) ФС на основе хлорофилла (хлорины, пурпурины, бактериохлорины) и 3) красители (фталопианины и др.). Большинство ФС, используемых в настоящее время в клинике, принадлежат к первой группе. Традиционно, производные порфиринов и другие фотосенсибилизаторы, созданные в 1970-х-начале 1980-х годов, относят к ФС первого поколения, ко второму поколению ФС относят порфирины и другие пигменты, появившиеся в конце 1980-х годов, в настоящее время разрабатываются ФС третьего поколения (Huang, 2005). Формулы некоторых фогосепсибилизаторов приведены нарис. 1.
Основные требования, предъявляемые к разрабатываемым ФС, можно сформулировать следующим образом (Sternbeerg et al., 1998; Detly et al., 2004): высокая химическая чистота препарата; высокий выход АФК (в первую очередь синглстного кислорода); низкая темповая токсичность; высокая устойчивость при хранении и при введении в организм; интенсивная полоса поглощения в области 660-900 им; высокая специфичность накопления в раковых клетках; слабое накопление в коже; высокая скорость выведения из организма.
СН2ЬСОг"Ма'
(СН2)2СОг Na"
HO,C(H;Ch
{СІІ2|2С02Мз'
'ЫаО;С(НйС)2-
'(CH2}2C02'Nrt*
Фотофрин
R = CH3CHOH tirai CHjCH
NH;CH;>C0CH2CH2CO2H
СгК,
HOOC coo,i
5-амииолсвулннован кислота
Бактернохлорші/;
-"f N-
X,
^
Протопорфирин IX
Н3СО ,-OCH;
1.. ./
-і '~^А-
>чЛ
N ГЧ-чг
H,CO'
Порфицсн
осн3
Фталоциании
Нафталоциаиин
Рис. 1. Структура некоторых фотосенсибилизаторов.
Другим направлением в ФДТ является предложенный канадским ученым Д. Кеннеди метод, основанный на таком регулировании биосинтеза порфирннов, при котором в опухоли в избытке образуются эндогенные порфирины. Метод Кеннеди предполагает местное нанесение предшественника всех порфиринов, образующихся в организме человека, 5-аминолевулиновой кислоты в виде крема, при этом отпадает необходимость введения в организм внешних ФС (Миронов, 1996).
2.1.1. Физико-химические свойства ФС
Молекулы ФС почти всегда находятся в основном синглстном состоянии ('S0), в отсутствие фотоактивации электроны внешнего электронного уровня спарены. При поглощении фотона, молекула ФС переходит п короткоживущее (1 -100 не) возбужденное синглетное состояние (!S*) без изменения электронного спина. Из этого состояния молекула может перейти в основное состояние ('S) или в возбужденное триплетиос состояние ( S*) с неспареипыми электронными спинами, характеризующееся большим временем жизни (более 500 ис) (Takemura et al., 1989). Находясь в этом состоянии, молекула ФС может эффективно вступать в реакции с окружающими молекулами. Описаны два различных механизма протекания реакций с участием ФС: перенос электрона или протона (реакции типа I) и передача энергии на кислород - одну из немногих молекул, для которой основным является триплетное состояние, J02 (реакции типа II).
2.1.1.1. Реакции типа 1
Взаимодействие ФС ( S*) с окружающими молекулами - акцепторами (А) в основном синглстном состоянии приводит к образованию ионных радикалов (2S+, 2А\ а также 2S" и 2А+) (Ochsner, 1997):
3S* + 'А -» 3[3S:'A]* -> 3[3sVa-|* -> V + 2А"
X спин-спиновый переход
'[2sVa-]*Vs-+-'a
так же как и свободных радикалов 2S и 2А (или *S+, *А", "S" , *А+, "S и "А соответственно). Большая часть этих радикалов взаимодействует с кислородом с образованием ЛФК, таких как "ОН и Н02*, а также *0"г, и Н2О2. Все они, а особенно
*0П, могут неспецифически окислять большинство биологически важных молекул. Для этих радикалов характерны малые величины свободного пробега в ткани, которые не превышают нескольких десятков нанометров (от 2 до 20 нм для разных АФК), что связано с их очень высокой способностью реагировать с компонентами живой клетки (Hutchinson, 1957; Hlgohary ct al., 1998).
2.1.1.2. Реакции типа II
Кислород в основном триплетом состоянии 3g~C>2 и ФС в возбужденном триплетом состоянии S* могут вступать в реакции переноса энергии с образованием синглетного кислорода, который также относится к активным формам кислорода:
3S*+%O2->lS0+%O2 Эффективный перенос энергии с молекулы ФС на кислород возможен лишь в том случае, если энергия его возбужденного состояния превышает энергию синглетного уровня кислорода (7900 см"1) (Ochsner, 1997). Во избежание неблагоприятных факторов, подавляющих генерацию синглетного кислорода, энергия возбужденного триплетного состояния ФС должна быть меньше 18000 см"1.
2.1.1.3. Фотосенсибилшированные реакции в тканих
В полярной среде преимущественно проходят реакции типа 1 вследствие стабилизации образующихся пар радикалов и ипгибировапия обратной реакции передачи электрона на ФС (Hopf et al., 1978).
Время жизни и растворимость синглетного кислорода выше в гидрофобной среде, поэтому в гидрофобном окружении в основном протекают реакции типа II (Tomio et al., 1980). Однако даже в относительно полярной среде реакции типа II часто оказываются более эффективными из-за более высоких констант скоростей взаимодействия синглетного кислорода с молекулами биологического субстрата по сравнению с радикалами, образующимися в результате реакций I типа (Ochsner, 1997).
Экспериментально было показано, что эффективность фотодинамического действия (ФДД) ФС напрямую зависит от квантового выхода синглегного
кислорода, который, в свою очередь, определяется концентрацией кислорода в
облучаемой ткани (Henderson and Dougherty, 1992; Niedre et al., 2003). Клетки в
условиях гипоксии демонстрируют высокую устойчивость к
фотосепсибилизированным реакциям (Henderson and Fingar, 1987), кроме того, высокая скорость потребления кислорода в реакциях типа II может привести к существенному снижению давления кислорода в тканях и, тем самым, к подавлению последующих фотосенсибилизироваппых эффектов, в связи с чем было предложено использование гипербарического кислорода в ходе ФДТ с целью повышения ее эффективности (Chen et al., 2002).
Во премя ФДТ в зависимости от полярности окружения и степени оксигенации ткани возможно преобладание реакций того или иного типа, смена преимущественно образующихся при ФДТ АФК может существенно повлиять па эффективность процесса. Однако, несмотря на различие в механизмах реакций обоих типов, все они в присутствии кислорода приводят к похожим окислительным повреждениям биомолекул (Sharman et al., 1999).
2.1.1.4. Фотоокисление биологических молекул
Трудно выделить тип биомакромолекул, наиболее подверженных фотоокислению, но некоторые их составляющие могут более быстро и легко окисляться, чем другие. Так, почти все белки подвергаются фотоокислению, хотя только пять аминокислот из двадцати, встречающихся в природных белках (Cys. Met, His, Туг, Тгр), наиболее чувствительны к окислению. Фотоокисление этих специфичных остатков обычно приводит к потере или изменению функций белков (Straight and Spikes, 1985).
Пурины фотоокисляются более легко, чем пиримидипы, в физиологических условиях наиболее чувствителен гуанин. Было показано, что в результате разрушения гуанина происходят одно или/и двунитевые разрывы ДНК (Straight and Spikes, 1985).
Молекулы липидов, содержащие ненасыщенные жирные кислоты, так же, как и стероиды, токоферолы и свободные ненасыщенные жирные кислоты, легко подвергаются фотоокислению. Ряд других биологически важных молекул, например,
'о.
НО'
ООН
'о.
о-он
:н2-сн-соо-
* N
H3N-
сн2-сн-соо-
II ш
'о,
н3ъг
H3isr
-ҐГЛ
N'
сн2-сн-соо-
'о.
сн2-сн-соо-
Рис. 2. Некоторые окислительные реакции сипглепшого кислорода с биомолекулами: А-с холестерином, К - ненасыщенными липидами, В - гистидниом, Г - триптофаном
(Миронов, 1996).
таких как: аскорбиновая кислота, биотип, фолиевая кислота, глутатиои, так же легко и эффективно окисляются в присутствии ФС (Straight and Spikes, 1985).
На рис. 2 показаны реакции окисления некоторых биологически активных соединений синглетным кислородом.
2.1.2. Внутриклеточная локализация ФС
В связи с тем, что длина свободного пробега АФК в тканях невелика и не превышает десятков нанометров, а размер большинства клеток организма измеряется микрометрами или десятками микрометров, на эффективности действия
ФС будет сказываться не только распределение их между опухолью и окружающими тканями, злокачественными и нормальными клетками, но и распределение внутри клеток.
Внутренний объем эукариотической клетки разделен мембранами на компартменты, различающиеся по своим функциям и свойствам, в том числе и по чувствительности к реакциям, индуцируемым АФК, по возможности восстановления поврежденных структур и по влиянию таких повреждений на жизнеспособность клетки, в первую очередь, па способность к делению. Потому для понимания механизма действия фотосенсибилизаторов в организме требуются сведения не только о распределении их в различных типах тканей, их «сродстве» к определенным клеточным типам, по и об их проникновении в различные клеточные компартменты и аккумуляции в них.
Место локализации ФС в клетке зависит от способа проникновения их в клетку и физико-химических свойств ФС: гидрофобпости/гидрофильности; типа, числа и распределения заряженных групп; числа колец; наличия центрального атома в тетрапиррольной структуре и т.д.
Разные ФС проникают в клетки in vitro различными путями: при помощи диффузии (производные гсматопорфирина (Scoundes et al., 1987), фталоциапина цинка (Berg and Moan, 1997) и др.), неспецифического эндоцитоза (N-мопоаспартилхлории е6, лизилхлорин р6 (Leach et al., 1993) и др.), фагоцитоза (агрегаты диэфиров гсматопорфирина (Berg et al., 1993), производных хлорина ей (Kelbauskas and Dictel, 2002) и др.), а также с использованием специфических механизмов транспорта через плазматическую мембрану (краситель иидоциановып зеленый (Abels et al., 2000)).
После проникновения в клетку ФС распределяются между клеточными компартментами в зависимости от своих физико-химических свойств. Так, например, моно- и дисульфопроизводные фталоциапина алюминия диффузпо распределяются по цитоплазме клеток меланомы линии LOX в культуре, тогда как три- и тетрапроизводные накапливаются в гранулярных лизосомных структурах на периферии клеток (Peng ct al., 1991). Лизилхлорин р в основном обнаруживается в эндосомах (Leach et al., 1993); ди- и триэфиры лизилхлорнна ев накапливаются также
в лизосомах клеток мышиного лейкоза, тогда как имид лизилхлорина е^ накапливается на плазматической мембране и в митохондриях (Kessel et al., 1995), причем его эффективность была существенно выше, чем у лучше накапливавшихся в клетках эфиров лизилхлорина. Заряженные анионные и катионпые ФС обычно связываются с мембранными компонентами клетки, тогда как незаряженные водорастворимые ФС распределяются более диффузно но всей клетке: так, тетрасульфоновая кислота фталоцианина цинка, обладающая четырьмя отрицательными зарядами, накапливается в лизосомах, тогда как нейтральный тетрадиэтаноламинфталоцианин цинка диффузно распределяется во внутриклеточных мембранах (Wood et al., 1997).
Существенное влияние на характер внутриклеточного распределения оказывает и тип клеток, к которым добавлены ФС. Так, в результате инкубации гииериципа с клетками линии HcLa ФС локализуется преимущественно в перинуклеариом пространстве (комплекс Гольджи и эндоплазм этический ретикулум (Delaey et al., 2001)), а в случае с клетками носоглоточной карциномы человека линий CNE2 и TW0-I - в митохондриях и лизосомах (АН and Olivo, 2002).
Фотохимические реакции, индуцированные облучением клеток, приводят к возрастанию степени перекисного окисления липидов, которое может нарушать целостность мембраны, что, в свою очередь, может привести к высвобождению ФС из места их первоначальной локализации и перераспределению по клетке (Wood et al., 1997; Scully ct al., 1998; Weizman ct al., 2000).
На основании вышеизложенных фактов, можно заключить, что при доставке ФС in vitro свободные фотоактивные молекулы способны накапливаться и цитоплазме, плазматической мембране, внутри митохондрий, в аппарате Гольджи, эндоплазматическом ретикулуме, эидосомах и в лизосомах (см. также таблицу 1). В ядрах ФС, имеющие терапевтический интерес, в детектируемых количествах обнаружены не были. В то же время давно известно, что именно клеточное ядро является крайне чувствительным к действию АФК компартментом клетки (Wiseman and Halliwell, 1996).
Таблица /. Внутриклеточная локализация некоторых ФС
Как уже было упомянуто, фотоцитотоксичсский эффект ФС, который обусловлен АФК, проявляется вблизи места внутриклеточной локализации ФС из-за малого пробега АФК внутри клетки; не более нескольких десятков нанометров. Прямые эксперименты по определению чувствительности частей клетки к действию ФС подтвердили, что ядро является наиболее уязвимым по отношению к действию ФС клеточным компартмеитом Показано, что доставка ФС хлорина е6 к ядрам клеток гепатомы при помощи копъюгата инсулин-БСА-(хлорин ed) на 2 порядка увеличивала эффективность его ФДД (Akhlynina et al., 1995), Включение сигнала ядерной локализации большого Т-антигеиа вируса SV-40 в состав такого рола конструкций позволило добиться увеличения эффективности ФДД ФС более чем в 2000 раз, что доказывает крайне высокую чувствительность клеточного ядра к фотодинамическому повреждению (Akhlynina ct al., 1997; Akhlynina et al., 1999). Микроосвещение отдельных частей клетки выявляло флуоресценцию Фотофрина-П и тексафирипа лютеция в цитоплазме клеток (в перинуклеарном пространстве и лизосомах, соответственно), но не в ядрах клеток (Liang et al., 2000). Фотоцитотоксичсский эффект, напротив, был максимальным при микрооблучеиии ядер клеток, а наименьшая эффективность ФДД всех исследопапиых ФС наблюдалась при облучении цитоплазмы, чувствительность перипуклеарного пространства превосходила чувствительность цитоплазмы, но была меньше, чем чувствительность ядер, то есть даже недетектируемые концентрации ФС в ядрах оказывали больший цитотоксичсский эффект, чем превосходящие их во много раз концентрации в цитоплазматических компартментах клеток (Liang et al., 1998; Liang et al., 2000a; Liang ct al., 2000b).
Вес эти данные показывают, что ядро является самой чувствительной к ФДД внутриклеточной мишенью, и разработка высокоэффективных способов доставки ФС в ядра-клеток мишеней может позволить значительно повысить эффективность их ФДД.
Внутриклеточное распределение ФС при доставке in vivo может измениться за счет взаимодействия ФС с компонентами крови. Когда ФС попадает в кровь, лишь малая доля молекул ФС остается в свободном состоянии, тогда как большая часть образует комплексы с липопротеинами и альбуминами, поэтому их проникновение в
клетки определяется свойствами не столько ФС, сколько ФС-переиосящих компонентов крови. Комплексы ФС с альбуминами и липопротеинами низкой плотности (ЛНП) могут проникать внутрь клеток-мишеней путем рецептор-опосредованного эндоцитоза (Vorbrodt and Dobrogowska, 1999; Polo et al., 2002).
2.1.3. Методы доставки ФС в опухолевые ткани и клетки
Наиболее существенным недостатком ФДТ, свойственным большинству химиотерапевтических методов, является невысокая специфичность накопления ФС в раковых клетках. ФС, введенный в кровь, разносится по всему организму и поглощается как опухолевыми, так и здоровыми клетками. Концентрация ФС, поглощенного раковыми клетками, как правило, незначительно превышает таковую в нормальных клетках; это приводит к тому, что сеанс ФДТ способен оказать повреждающее действие на здоровые органы и ткани. В отсутствие освещения ФС не способны генерировать АФК или проявлять иное цитотоксическое действие, поэтому некоторая специфичность по отношению к опухоли достигается уже за счет локальной активации ФС при ее облучении; в необлученных тканях токсический эффект при этом не проявляется. Но, как уже упоминалось, неспецифпческос накопление ФС в нормальных органах и тканях является причиной повышенной фоточувствительности кожи и сетчатки глаз, которая сохраняется в течение длительного времени после введения ФС и может привести к серьезным повреждениям этих органов под воздействием солнечного света.
Не удалось избежать нсспсцифичсского накопления ФС и побочных эффектов ФДТ и при использовании альтернативных способов введения ФС в опухоль, основанных па непосредственном (например, при использовании мазей) воздействии на злокачественное новообразование (Stcndcr ct al., 1997).
В связи с этим одной из наиболее важных задач в рамках ФДТ является поиск новых способов повышения селективности накопления ФС в опухолевых клетках, которые позволят снизить вероятность фотоповреждения соседних с опухолью тканей, что особенно важно в случае проникающих опухолей.
К настоящему времени разработаны различные способы направленной доставки ФС непосредственно внутрь опухолевой клетки, основанные на создании
переносящих конструкций, взаимодействующих с опухолевыми клетками. Для доставки ФС используют синтетические пептиды, липосомы, микросферы, эмульсии, а также антитела к опухолевым антигенам и лиганды к иитернализусмым клеточным рецепторам.
2.1.3.1. Липосомы
Липосомы, представляющие собой замкнутые липидные образования, уже давно применяются в медицинской практике для доставки лекарств внутрь клеток. Использование липосом различного липидпого состава для доставки гидрофобных ФС позволяет повысить селективності, накопления ФС в опухолевых клетках, при этом коэффициент распределения ФС между опухолью и здоровыми тканями возрастает от 2-2,5 до 5- 10 в случае свободного и включенного в липосомы ФС соответственно (Reddi, 1997).
Наибольшее распространение в ФДТ получили немодифицированные липосомы - моно- или многослойные фосфолипидные везикулы с добавлением холестерина (для предотвращения утечки содержимого). Так, доставка Фотофрина с помощью липосом позволила повысить эффективность ФДД и специфичность накопления ФС клетками глиомы человека линии U87, имплантированными в мозг крысы, по сравнению со свободным ФС (Jiang et al., 1998). Кроме того, большинство гидрофобных ФС агрегируют в водных растворах, что приводит к снижению их фотодинамической активности. Использование липосом позволяет снизить степень агрегированное молекул ФС (Damoiseau et al, 2001). Однако существенным недостатком подобных систем доставки является небольшое время их жизни в плазме крови: во-первых, перераспределение липидов между везикулами и липопротеинами плазмы приводит к разрушению липосом и выходу содержимого в кровяное русло, во-вторых, липосомы, связавшиеся с белками плазмы быстро поглощаются клетками фагоцитарного ряда и в результате накапливаются в органах и тканях с развитой фагоцитарной системой (печени, селезенке, костном мозге (Schroit ct al., 1986)).
Модификация поверхности липосом с помощью гликолипидов, полиэтилепгликолей (Francis et al., 1996), глюкуроновой кислотой (Oku et al., 1992) и
некоторых других веществ позволяет повысить время полужизни везикул, содержащих ФС, до нескольких десятков часов. Для повышения специфичности накопления липосом с ФС клетками-мишенями к поверхности везикул присоединяют специфичные по отношению к опухоли молекулы - мопоклопальные антитела к опухолевым маркерам (Bergstrom ct al., 1994) или лигаиды к мембранным рецепторам опухолевых клеток (фолат (Reddy et al., 1999), маннозу (Opanasopit et al., 2002), трансферрип (Derycke and De Witte, 2002) и др.).
2.1.3.2. Наиочастицы
Альтернативным вариантом увеличения эффективности проникновения ФС внутрь клеток-мишеней может служить использование наиочастиц, ианосфер, нанокапсул и мицеллярных систем. К достоинствам данного подхода можно отнести следующие свойства наиочастиц: 1) возможность получения наиочастиц с гидрофильной поверхностью, 2) большая площадь поверхности, которой могут быть приданы различные химические и биохимические свойства, 3) субмикроппые размеры наиочастиц позволяют им проникать глубоко внутрь опухоли через капиллярную систему и эффективно поглощаться клетками опухоли, 4) присоединение ФС к наночастицам можно осуществить широким спектром способов (от ковалентного присоединения до самосборки) (Wang et al., 2004). В качестве основы при создании наиочастиц моїут быть использованы керамические материалы, металлы и биодеградабельные полимеры (Wang ct al., 2004).
Кварцевые наиочастицы с присоединенным к ним производным феофорбида зффеїсгипію поглощались раковыми клетками, последующее облучение клеток светом соответствующей длины волны приводило к их гибели, причем включение ФС в состав наиочастиц не сказалось на его способности генерировать синглетный кислород (Roy et al., 2003).
Использование полимерных материалов при создании наиочастиц для ФДТ позволяет придавать частицам требуемые физико-химические и биологические свойства (например, скорость деградации в организме, условия высвобождения ФС из наиочастиц, фармакологические свойства ФС и др.). Включение ФС мезо-тетра-(4-гидроксифепил)порфирина в состав наиочастиц, состоящих из поли(0,Ь-лактида-
ко-гликолида) (1:1 и 3:1) и пол и (D,L- л а їсти да) позволило резко повысить накопление ФС клетками рака молочной железы мыши линии ЕМТ-6 и эффективность ФДД ФС при облучении по сравнению со свободным ФС (Копап et al., 2003), наиболее значительное увеличение эффективности наблюдалось с частицами с соотношением компонентов 1:1. Важно отметить, что использованные частицы полностью разрушались в присутствии трсгалозы в среде, как содержащей, так и не содержащей фетальную сыворотку. Ковалентное присоединение хлорина е$ к полистирольпым микросферам диаметром 1 мкм в 20 раз повысило концентрацию ФС, накопленного клетками карциномы мочевого пузыря человека линии MGH-U1, и, как следствие, эффективность его фотоцитотокси чес кого действия по сравнению со свободным ФС (Bachorctal., 1991).
2.1.3.3. Конъюгаты моноклональных антител с ФС
Другим способом повышения селективности накопления ФС в опухолевых клетках является использование моноклональных антител, которые специфически связываются с опухолевыми антигенами или рецепторами па поверхности опухолевой клетки. Присоединение ФС к антителам позволяет значительно повысить эффективность ФДД ФС (Reddi, 1997).
В настоящее время для доставки ФС используются антитела к компонентам системы траисдукции сигнала IIER-2, рецепторам ЭФР и фактору роста эндотелия сосудов, лейкоцитарным антигенам группы CD (например, CD20, CD22, CD33, CD44, CD52), опкофстальным антигенам (например, СЕА). Кроме того, для фототерапии опухолей используют антитела к антигенам, специфичным не для раковых клеток, а для клеток эндотелия или стромы опухоли (van Dongcn ct al., 2004). Так, конъюгаты хлорина еб с моноклопальными антителами ОС 125 накапливались в клетках рака яичников мыши линии NIII:OVCAR3 в 2-3 раза более эффективно, чем свободный ФС в той же концентрации (Goff et al., 1994). В то же время, присоединение различных ФС к нсснецифическим антителам не приводило к возрастанию эффективности ФДД па различных линиях клеток (Ни et al., 1995).
Основной мишенью ФДД для ФС, связанного с антителами, служит плазматическая мембрана, у которой чувствительность к действию АФК ниже, чем у других клеточных органелл, в частности, лизосом и особенно клеточного ядра. Для того, чтобы ФС мог проявить свое токсическое действие в наиболее уязвимых участках клетки, к антителам может быть присоединен дополнительный компонент, обеспечивающий проникновение переносящей конструкции с ФС внутрь клетки. В роли такого компонента были успешно использованы полилизин, N-(2-гидроксипропил)-метакриламид, липосомы (van Dongen et al., 2004). Альтернативой подобным модификациям может служить использование иптернализуемых антител, специфичных к опухолевым антигенам (Rihova, 1998). Так, эффективность ФДД фотоиммуноконыогатов тетрасульфоновой кислоты фталоцианина алюминия с интернализуемыми антителами Е48 к гликозилфосфатидилинозитол-сшізанпому антигену клеток карцином, с химерными антителами сМАЬ U36 и антителами 425 к рецептору ЭФР на клетки эпидермоидной карциномы человека А431 было в 32, 560 и 7500 раз, соответственно, выше но сравнению со свободным ФС (Vrouenraets ct al., 2001). Антитела 425, эффективность копъюгатов с которым была максимальной, характеризовались крайне высокой способностью к интернализации.
2.1.3.4 Комплексы ФС с интернализуемыми лигандами
Использование антител для направленной доставки ФС в опухолевые клетки имеет ряд недостатков, которые сказываются па эффективности специфической доставки ФС: 1) сродство антител к опухолевым антигенам обычно невысокое, 2) клинические опухоли характеризуются высокой гетерогенностью и непостоянной экспрессией специфичных антигенов, 3) большие молекулы антител плохо проникают вглубь опухоли, 4) большая часть антител {до 99%) остается в сосудистой системе опухоли, не достигая опухолевых клеток, 5) подавляющее большинство антител не обладает способностью иитернализоваться (Sharman et al., 2004). В связи с этим альтернативой фотоиммуноконъюгатам может служить создание копъюгатов ФС с лигандами к интернализуемым рецепторам раковых клеток.
Таблица 2. Доставка ФС внутрь раковых клеток с помощью лигандов к интернализуемым рецепторам
Характерной чертой большинства опухолевых клеток является гиперэкспрессим некоторых мембранных рецепторов, отвечающих за связывание различных писательных веществ, факторов роста, гормонов и других экстраклеточиых лигандов, участвующих в процессе пролиферации клеток. В связи с этим присоединение ФС к макромолекулярцому иптериализусмому лиганду также может обеспечить избирательную доставку ФС в опухолевые клетки, экспрессирующие рецепторы к данному лиганду в значительно большем количестве, чем окружающие здоровые клетки, В таблице 2 приведены примеры доставки ФС
внутрь опухолевых клеток разных типов с использованием специфичных лигаид-рецепторных взаимодействий.
2.2. Направленная внутриклеточная доставка ФС в ядра
опухолевых клеток-мишеней
На основании вышеперечисленных сведений можно сформулировать несколько принципиальных выводов относительно тех свойств, которыми должна обладать эффективная система для элиминации раковых клеток:
Обеспечение клеточной специфичность фотодинамического действия, что способствует минимизации негативных побочных эффектов ФДТ,
Доставка ФС внутрь опухолевых клеток, что позволяет значительно повысить эффективность фотоцитотоксического действия,
Обеспечение направленного транспорта ФС в наиболее чувствительный к фотодипамическому действию компартмент раковой клетки - ядро -для дальнейшего увеличения эффективности его действия.
Чтобы снизить негативные побочные эффекты и увеличить эффективность ФДТ, на кафедре биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в лаборатории молекулярной генетики внутриклеточного транспорта Института биологии гена РАН был разработан метод адресной доставки ФС в ядра клеток-мишепей, в основе которого лежит использование естественных клеточных механизмов транспорта макромолекул. Избирательность накопления ФС в опухолевых клетках определяется связыванием макромолекулярного лигапда в составе конструкции с теми поверхностными клеточными мембранными рецепторами, содержание которых значительно повышено в опухолевых клетках, что приводит к иптерпализации образовавшегося комплекса путем рецептор-опосредованного эидоцитоза. Дальнейший транспорт ФС в ядро клетки определяется наличием в составе переносящей конструкции соответствующего сигнала внутриклеточного транспорта макромолекул. Для обеспечения возможности ядерного транспорта интернализованной конструкции с помощью клеточных белков ядерного импорта, расположенных в цитозоле клеток, в се состав вводится компонент, обеспечивающий выход из замкнутых мембранных образований, в
Рис. 3. Принципиальная схема направленного внутриклеточного транспорта ФС в ядра клеток-мишеней с помощью модульных переносящих конструкций: 1 - связывание с рецептором; 2 - интернализация; 3 - выход из эндосом в цитозоль, 4 - связывание с комплексом импортинов и последующий транспорт в ядро.
которых оказываются поглощенные в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза макромолекулы. Кроме того, конструкция содержит доставляемый ФС, присоединенный к модулю-носителю. Таким образом, процесс адресной доставки ФС из внеклеточного пространства в ядра клеток-мишеней делится на три этапа: рецептор-опосредованный эндоцитоз, выход из эндосом в цитозоль, транспорі в ядро (рис. 3).
2.2.1. Рецептор-опосредованный эндоцитоз
Клеточная поверхность - чрезвычайно динамичная структура, участвующая, наряду с внутриклеточными органеллами, в процессах мембранного транспорта, одной из разновидностей которого является эндоцитоз - поглощение внеклеточной жидкости и частиц в составе мембранных пузырьков. В случае рецептор-опосредованного эпдоцитоза (РОЭ) внеклеточные макромолекулы (лигапды) связываются с находящимися па плазматической мембране специфическими рецепторами, после чего комплекс лиганд - рецептор иитерпализуется внутрь клетки. Выделяют два основных типа РОЭ: клатрип-зависимый и клатрин-нсзависимый.
2.2.1.1. Клатрип-зависимый РОЭ
Наиболее изучен механизм РОЭ с образованием окаймленных ямок и везикул (рис. 4). С помощью электронной микроскопии было обнаружено, что многие белки, поступающие в клетку с помощью рецептор-опосредованного эпдоцитоза, концентрируются в окаймленных, или покрытых ямках (coated pils) -специальных участках плазматической мембраны, окруженных материалом высокой электронной плотности (Smythe and Warren, 1991).
Главный компонент покрытых ямок - белок, называемый клатрииом, способен полимеризоваться с образованием корзиноподобных решетчатых структур. Молекула клатрина представляет собой треножник, каждая «нога» которого сформирована тяжелой (180 кД) и легкой (30 - 40 кД) цепью. Тяжелая цепь клатрина представляет собой инвариантную структуру, состоящую из 5 отдельных функциональных участков: глобулярного N-концевого домена, дисталыюй и проксимальной «ног», разделенных изогнутым «коленом», и С-копцсвого домена, обеспечивающего тримеризацию (Greene et al., 2000). N-коицсвой домен участвует в образовании комплексов клатрина с рядом белков эпдоцитоза, содержащих так называемую «последовательность для связывания с клатрииом» (tcr Haar et al., 2000); обе «ноги» обеспечивают межмолекулярные взаимодействия, играющие важную роль в поддержании корзиичатой структуры клатриповой сети, проксимальная «нога» также содержит участки связывания легких цепей (Brodsky et al., 2001), две
Рис. 4. Схема процесса рецептор-опосредованного эндоцитоза с образованием окаймленных везикул: 1 - связывание лиганда с мембранным рецептором; 2 -связывание адаптерных белков и клатрина с цитоплазматическими участками рецепторов, формирование окаймленной ямки; 3 - впячивание ямки внутрь клетки; 4 -отшнуровывание окаймленной ямки при участии динамина; 5 - диссоциация клатрина; 6 - диссоциация адаптерных белков, формирование ранней эндосомы (по Lemmon, 2001 с изменениями). Условные обозначения: а - лиганд-рецепторный комплекс, б - молекула клатрина, в - клатриновая сеть, г - адаптерные белки, д - динамин, е -шаперон Hsc70, ж-ауксилин.
изоформы которых (LCa и LCb) случайным образом связываются с тяжелыми цепями треножника. Предполагается, что легкие цепи участвуют в регуляции образования треножника клатрина (Ybe et al., 1998). Протяженная структура "ног" клатрина позволяет ему образовывать на цитоплазматической стороне плазматической мембраны характерную многогранную сеть, состоящую из гексагональных и пентагональных ячеек. С ростом ямки происходит ее впячивание внутрь клетки, в результате чего образуется покрытая везикула, которая и несет лиганд внутрь клетки.
В формировании покрытой везикулы помимо клатрииа принимает участие большое количество различных белков. Связывание лиганда с интсрнализуемым рецептором на поверхности клетки (рис. 4,1) приводит к конформациоипым изменениям рецептора, в результате которых становятся доступными короткие сигналы интерналнзации, входящие в состав цитоплазматического домена рецептора (Ohno ct al., 1995). Ключевую роль в узнавании сигналов интерналнзации играет гетеротетрамерпый адаптерный белок АР2, состоящий из двух больших (порядка ПОкД) субъединиц - адаптинов (а и р2), а также двух цепей с меньшей молекулярной массой: ц2 (примерно 50 кД) и о 2 (17 кД) (Robinson, 1994). Большинство сигналов интерналнзации содержат тирозин; к наиболее распространенным можно отнести сигналы типа Tyr-X-X-ф и Asp-Phe-X-Tyr (здесь X обозначает любую аминокислоту, а ф - аминокислоту с объемным гидрофобным боковым остатком), в узнавании этих последовательностей принимает участие субъединица \х2 (Ohno ct al., 1995). В узнавании сигналов интерналнзации второго класса Asp/Glu-X-X-X-Leu-Leu предположительно принимает участие субъединица Р2 (Ileilker ct al., 1996; Rapoport et al., 1998). Вариабельность остатков, входящих в состав сигналов интерналнзации (X и ф), по-видимому, определяет аффинность и специфичность связывания сигналов с различными адаптерными молекулами и, как следствие, скорость интерналнзации и дальнейшую судьбу эндоцитировапного лиганд-рецепторного комплекса (Kirchhausen ct al., 1997). сс-Субъсдипица участвует в доставке АР2 к плазматической мембране, а также связывается с АР/80, амфифизином и рядом других белков эндоцитоза (Pearse ct al., 2000); субъединица р2, помимо узнавания сигналов интерналнзации, также участвует в поддержании структуры молекулы АР2 и образовании комплекса АР2 с клатрином (Page and Robinson. 1995; Owen et al., 2000). Функция субъединицы a2 AP2 пока до конца не изучена, возможно, она заключается в поддержании необходимой конформации взаимодействующих белков (Pearse et al., 2000).
Следующей стадией образования покрытой ямки предположительно служит связывание клатрииа с р2-субъсдиницсй АР2 (рис. 4,2), для которого требуется не менее 60 тримеров клатрииа и примерно 20-30 тетрамеров АР2, связанных с
мембранными рецепторами (Kirchhausen et al., 1997), а также некоторые белки, например, адаптерный белок АР180, эпсин, Epsl5, амфифизин, сипаптоджапип и другие (Pearse et al., 2000). Считается, что эти белки нужны для регулирования сборки покрытой везикулы, изменения ее формы, отсоединения от родительской мембраны, а также для связывания доставляемых ею молекул.
Растущая окаймленная везикула впячивается в цитоплазму так, что покрытый изнутри клатрином участок сообщается с внешней средой через узкий (40-50 им) канал (рис. 4,3). Для замыкания тубулярного канала с образованием пузырька требуется энергия. Важную роль в этом процессе играет динамин - белок массой 100 кД, обладающий ГТФ-азпой активностью. Обмен связанного с динамином ГДФ на ГТФ приводит к полимеризации динамина, который формирует вокруг шейки покрытой ямки воротниконодобную структуру (Schmid, 1997). Последующий гидролиз ГТФ, возможно, является движущей силой для отделения везикулы от мембраны (рис. 4,4). Детали процесса еще не полностью изучены, однако, известно, что помимо ГТФ-азпого домена динамин содержит так называемый РН-домен (pleckstrin homology domain), который способен взаимодействовать с кислыми головками фосфолипидов, таких, например, как фосфатидилинозит (Salim et al., 1996). В настоящее время выдвинуто несколько гипотез относительно механизма отсоединения покрытой везикулы от плазматической мембраны под действием динамина. Так, одна из моделей предполагает функционирование динамина по механизму механофермента, гидролиз ГТФ приводит к конформационному расширению спирали молекулы динамина, что, в свою очередь, служит движущей силой для «выдувания» везикулы (Stowcll et al., 1999). Альтер и ативная модель, основанная на факте уменьшения диаметра динамітового кольца в присутствии ГТФ, предполагает, что информационное сжатие динамина приводит к отщеплению образовавшейся везикулы (Chen et al.. 2004). Обе эти модели объединяет гипотеза конформационных изменений молекулы динамина в результате гидролиза ГТФ; в отличие от них модель, описанная в работе Сопга и Шмида (Song and Schmid, 2003), приписывает дипамину функцию молекулярного триггера: активированный динамин (в ГТФ-связанной форме) запускает каскад реакций с участием эффекторпых молекул, приводящих к
отшнуровыванию покрытых везикул, однако подобные эффекторы пока остаются не идентифицированы.
Время полужизни покрытой везикулы не превышает одной минуты (Smythe and Warren, 1991), так как почти сразу после отделения пузырька от мембраны начинается высвобождение (диссоциация) клатрина и адаптерпых белков из покрытой везикулы в результате совместного действия белка Hsc70, принадлежащего к семейству белков теплового шока Hsp7(), и небольшого белка ауксилииа (рис. 4,5 - 6). Согласно современным представлениям ауксилин связывается с клатриновой сетью и запускает1 АТФ-азную активность шаперона Hsc70 (Jiang et al., 2000). Активированный Hsc70 разрушает клатрин-клатриповые взаимодействия, и, в результате его действия, покрытая везикула теряет окаймление, становясь непокрытой. Hsc70 остается связанным с диссоциированным клатрином и, по-видимому, принимает участие в сборке клатриновой сети на новом участке плазматической мембраны.
2.2.1.2. Клатрнн-независимый эидоцитоз. Кавеолы
Другим типом везикулярного транспорта от поверхности клеток является транспорт через кавеолы. Кавеолы представляют собой гладкие (в отличии от покрытых клатрином) впячивапия плазматической мембраны размером 50-80 нМ. Чаще всего кавеолы имеют округлую форму, однако в зависимости от типа клеток кавеолы могут обладать и более сложной формой (Rothbcrg ct al., 1992; Parton ct al., 1997). Внутриклеточная поверхность кавеол покрыта белками кавеолином-1 и кавеолином-2 (или кавеолином-3 в мышечных клетках) массой 21-25 кД (Rothberg et al., 1992), С- и N-концевой участки молекулы расположены в цитозолс, их соединяющая гидрофобная петля погружена в плазматическую мембрану (Monicr ct al., 1995), С-конец молекул кавеолипа модифицирован пальмитиновой кислотой (Dietzcn et al., 1995). Кавеолины способны связываться с холестерином, образовывать димеры и олигомеры (Monier et al., 1995; Murata et al., 1995).
Липидный состав кавеол совпадает с составом липидных рафтов, кавеолы очень богаты холестерином и сфинголипидами, которые играют значительную роль в образовании и поддержании структуры кавеол (см. обзор (Parton and Richards,
2003). Другим компонентом, стабилизирующим кавеолы, является белок филамин, соединяющий кавсолин с актиновыми филаментами (Stahlhut and van Deurs, 2000).
В образовании везикул из кавеол при отшнуровываиии их от плазматической мембраны участвуют те же белки, что и при образовании покрытых клатрином везикул из покрытых ямок (Oh et al., 1998). Как и в случае клатршг-зависимого эндоцитоза, тот же белок с ГТФ-азной активностью - динамин, сконцентрированный в «горле» кавеолы, - отсоединяет образующуюся везикулу от мембраны.
Эндоцитоз путем кавеол свойственен для значительно меньшего количества макромолекул по сравнению с клатрин-зависимым эпдоцитозом; проникновение через кавсолярные структуры продемонстрировано для альбумина, аутокринного фактора подвижности AMF, интерлейкина-2, а также ряда возбудителей вирусной и бактериальной природы: обезьяньего вируса SV-40, вируса полиомы, эховируса 1, холерного и столбнячного токсинов и др. (Parton and Richards, 2003), причем некоторые из перечисленных молекул способны проникать внутрь клеток и путем эпдоцитоза с образованием покрытых везикул (например, альбумин, холерный токсин). Возможно, эндоцитоз макромолекул не является основной функцией кавеол, а происходит нерегулируемым образом вследствие недостаточной стабилизации структуры кавеол или под действием регуляторпых факторов для очистки поверхности клетки от «заполненных» макромолекулами кавеол (Hommelgaard et al., 2005). Помимо способности эндоцитировать некоторые экстраклеточные молекулы, кавеолам приписывают также функции мехаиотранедукции (мониторинг скорости кровяного потока по поверхности эндотслиальных клеток), источника генерации сигналов с участием катионов Са2+ в эндотслиальных клетках, обеспечения проведения сигналов от внеклеточных пептидных молекул и др. (Kurzchalia and Parton, 1999).
2.2.1.3. Судьба эпдоцитированнмх молекул
Везикула, отшпуровавшаяся от поверхности клетки, сливается либо с такой же везикулой, либо с везикулой иного типа, образуя раннюю эндосому. Процесс этот энергозависим, для его осуществления необходимы цитозольные компоненты. Эидосомы представляют собой сложную систему трубочек и везикул,
предназначенную для сортировки эндоцитироватптых макромолекул. Ранние эпдосомы расположены ближе к плазматической мембране (Johnson ct al., 1993). За счёт работы протонной помпы в них понижается рН. Ранняя эпдосома имеет рН равный 6,3 - 6,8, что достаточно для диссоциации комплекса лиганд - рецептор. При закислении происходит сортировка рецепторов и лигаидов. В дальнейшем рецепторы собираются в трубкообразных элементах ранних эидосом. От эидосом отшнуровываются везикулы, которые могут возвращать рецепторы на плазматическую мембрану. Вероятно, рецепторы собираются и отделяются от эидосом благодаря своему взаимодействию с цитоскелетными компонентами. Везикулы с лигандами в эпителиальных клетках могут также быть перенесены через всю клетку, где высвобождают свое содержимое па противоположной стороне клетки (трансцитоз). Другая судьба ожидает макромолекулы, оставшиеся в эпдосомах, где-происходит дальнейшее понижение рН, в результате чего образуются поздние эпдосомы, и в дальнейшем иитерпализованные лиганды поступают в лизосомы. В лизосомах содержимое закисляется до рН 5 и ниже, и поглощенные молекулы деградируют под действием гидролаз. Продукты деградации удаляются из клетки или переносятся в цитоплазму и используются там в качестве строительного материала. Рециркуляция рецепторов происходит не всегда, и в некоторых случаях рецепторы также деградируют в лизосомах (см. таблицу 3).
Таким образом, рецептор-опосредованный эпдоцитоз является естественным клеточным процессом, предназначенным для избирательной доставки макромолекул в клетку. Интенсивные исследования механизма этого типа внутриклеточного транспорта сделали возможным его использование для направленной доставки токсинов, фотоактивных молекул, лекарственных препаратов и генетического материала в клетки.
Таблица 3. Некоторые интврнализуемые рецепторы (Геннис, 1997).
Группа 1. Рецептор возвращается к клеточной поверхности, лигянд поступает в лнзосомы
Рецептор маннозы
Рецептор асиалогликопротеина (галактозы)
Рецептор мапнозо-6-фосфата
Рецептор ЛИП
Группа 2. Рецептор и лиганд поступают в лизосомы
Рецептор ЭФР Инсулиновый рецептор
Группа 3. Трансцитоз
IgA/IgM-рецептор IgG-рецептор
Группа 4. Рецептор и лиганд возвращаются к одному и тому же домену плазматической мембраны
Траисферриповый рецептор
2.2.1.4. Эпидерма л ьный фактор роста и его рецептор как пример системы для направленной доставки веществ
Эпидсрмальный фактор роста относится к группе так называемых ростовых факторов, основная биологическая роль которых сводится к специфическому стимулированию синтеза ДНК и пролиферации клеток. Некоторые из этих факторов непосредственно или через структуру их рецепторов имеют выраженное сходство с белками - продуктами онкогенов. Нарушения нормальной цепи реакций с участием ростовых факторов (например, сверхэкспрсссия рецепторов, обладающих тирозин-киназной активностью, к которым относится и рецептор ЭФР (Salomon el al., 1995)), могут привести к злокачественной трансформации клеток. Рецепторы ЭФР присущи и здоровым, и злокачественным клеткам, однако во многих типах опухолевых и трансформированных клеток, таких как клетки рака молочной железы, легких, плоскоклеточного рака головы и шеи, глиобластомы, наблюдается сверхэкспрессия рецептора (Kolibaba and Druker. 1997; Mendelsohn and Baselga, 2000; Ford and
Рис. 5. Трехмерная структура эпидермального фактора роста человека. Условные обозначения: белым цветом отмечены атомы С, синим - атомы N, красным - атомы О, желтым - атомы S, атомы Н не показаны. Стрелками отмечены 3 дисульфидных связи.
Grandis, 2003), что позволяет использовать ЭФР для избирательной доставки ФС в клетки соответствующих опухолей.
Молекула ЭФР состоит из 53 аминокислотных остатков (рис. 5), ее третичная структура стабилизирована тремя дисульфидными связями, которые важны для связывания ЭФР со своим рецептором (Taylor et al., 1972). В связывании с рецептором важную роль также играет С-концевая часть молекулы, модификация которой приводит к падению сродства ЭФР к своему рецептору, что необходимо учитывать при включении ЭФР в состав различных транспортных систем.
Рецептор ЭФР принадлежит к одному из семейств тирозинкиназ, которое состоит из 4 близкородственных мембранных рецепторов: EGFR/ErbBl/HERl, Neu/ErbB2/HER2, ErbB3/HER3, ErbB4/HER4. Молекула рецептора синтезируется в виде 1210-амипокислотного предшественника, после протеолитического отщепления
N-концевой последовательности 1186-аминокислотный полинептид встраивается в мембрану (Jorissen et al., 2003). 20% от молекулярной массы рецептора ЭФР приходится на долю углеводных цепей, необходимых для встраивания рецептора в мембрану и выполнения им своих функций. Внеклеточная часть рецептора состоит из четырех доменов: Ы, CRI, L2 и CR2, связывание лиганда происходит между доменами L1 и L2, CR1 домены двух молекул рецептора участвуют процессе димеризации рецепторов.
Связывание ЭФР со своим рецептором приводит к конформационпым измененениям и димеризации рецепторов с последующим аутофосфорилированием иитоплазматической части рецептора. В результате при участии ряда цитоплазм атических белков (Grb2, She, Nek) и разнообразных вторичных мессепджеров запускаются различные сигнальные пути (Gibbs, 2000). Практически сразу после связывания лиганда активированные рецепторы кластеризуются в окаймленных ямках, а затем поглощаются внутрь клетки, где в эндосомах происходит сортировка поглощенных лиганд-рецепторных комплексов.
В данном случае рецептор-опосредованный эндоцитоз выполняет, по меньшей мере, две функции в процессе передачи экстра клеточного сигнала внутрь клетки. Во-первых, он может служить биофизическим механизмом ослабления сигнала с активированного клеточного рецептора. Во-вторых, в результате эпдоцитоза активированный мембранный рецептор переносится в соответствующий участок клетки, где взаимодействует с другими сигнальными молекулами (Ceresa and Schmid, 2000). При попадании в лизосомы происходит диссоциация комплекса ЭФР-рецсптор, в результате чего рецептор инактивируется.
Однако многие функции рецептора ЭФР не могут быть объяснены классическими механизмами транедукции сигнала. Так, стабилизированный на поверхности клеток комплекс ЭФР со своим рецептором ис был способен индуцировать синтез ДНК (Wakshull and Wharton, 1985), Кроме того, по многих работах было показано, что небольшое количество эндоцитировапного рецептора ЭФР и его лиганда обнаруживается в ядре, что легло в основу гипотезы о функционировании рецептора ЭФР в качестве транскрипционного фактора, обладающего митогенной функцией (Lin et al., 2001).
Таким образом, повышенная экспрессия рецепторов ЭФР на поверхности некоторых видов рака, доступность этих опухолей для облучения в ходе ФДТ и интернализация лиганд-рецепториого комплекса внутрь клетки с последующим транспортом в лизосомы и, возможно, в ядро обусловливают возможность эффективного использования ЭФР для избирательной доставки ФС внутрь опухолевых клеток.
2.2.2. Цитоплазмепо-ядсрный транспорт 2.2.2.1. Сигналы внутриклеточной локализации
Интернализация клеткой-мишенью лиганда или молекулярной конструкции, включающей его в свой состав, является необходимым, по не достаточным условием для эффективного поражения клетки. Это объясняется тем, что локализация лиганда после его рецептор-опосредован но го поглощения клетками определяется типом лиганда и не обязательно может совпадать с местами в іспетке, наиболее чувствительными к фотодинамическому повреждению. Попавший путем рецептор-опосредованного эндоцитоза лигапд может быть вынесен обратно на поверхность клетки в результате рециркуляции рецепторов, подвергнут деградации в лизоеомах или направлен клеточной системой сортировки в другие компартмеиты клетки. В частности, некоторые интерпализуемые пептидные лиганды (например, инсулин) способны в некоторой степени накапливаться в клеточном ядре (Jans, 1994). Однако для большинства подходящих лигандов необходимо обеспечить дальнейший транспорт ФС в наиболее уязвимые компартмеиты клетки. Для решения этой проблемы целесообразно использовать механизмы направленного внутриклеточного транспорта, обеспечивающих доставку макромолекул в определенные клеточные оргапеллы.
