Введение к работе
ікнуальность демы. Мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера (МДД/Б) - является іаиболее распространенным наследственным нервно-мышечным заболеванием человека. Іастота встречаемости составляет 1 на 5000 новорожденных мальчиков для мышечной [истрофии Дюшенна (МДЦ) и 1 на 18500 для мышечной дистрофии Беккера (МДБ). Основным линическим проявлением МДД/Б является прогрессирующая мышечная дистрофия. Симптомы шодистрофии Дюшенна (МДД) начинают в возрасте 3-5 лет. К 12-15 годам пациенты с МДД еряют способность передвигаться самостоятельно. Летальный исход, как правило, наступает із-за сердечной недостаточности либо отказа дыхательной мускулатуры в возрасте около 20 лет Partridge, 1997). В случае более легкой формы миодистрофии - МДБ, симптомы заболевания [ачиншот проявляться значительно позже, и больные часто доживают до 35-50 лет.
Причиной заболевания являются мутации в гене дисгрофина (Koenig et al., 1987; Hoffman et 1., 1987). Основным продуктом гена в мышечных тканях является присарколеммный белок [ышечный дистрофии, выполняющий функцию связующего звена между внутренним [итоскелетом миофибриллы и внеклеточным матриксом. Присутствие в мембране мышечного олокна аномального белка (МДБ) или же его полное отсутствие (МДД), индуцирует ;ервичные нарушения в структурной организации и функции сарколеммы, что приводит к апуску каскадного процесса дегенерации мышц (Hoffman et al. 1987).
Отсутствие эффективного медикаментозного лечения делает актуальной разработку новых -енотерапевтических подходов к лечению миодистрофии Дюшенна/Беккера. Суть метода, аютачается во введении больному конструкций с нормальным геном дистрофина, беспечивающим синтез полноценного белка и восстанавливающим структуру и функцию іьішц. В экспериментах in vivo на биологических моделях МДД мышах mdx. была показана озможность возобновление синтеза дистрофина в скелетных и сердечной мышцах после нутривенного введения аденовирусного вектора с кДНК гена дистрофина человека. ( toatford-Perricaudet et al., 1992). Кроме возобновления синтеза белка, было отмечено, что иперэкспрессия человеческого дистрофина предотвращает патологические и механические вменения поврежденных мышечных волокон без побочных эффектов.
'< сожалению, кардинальных успехов в генотерапии МДД/Б пока не достигнуто (Баранов, 999). Причиной этого являются, не только гигантские размеры гена и его мРНК, но и, лавным образом, отсутствие эффективных средств доставки гена в мышцы. Системы ставки генных конструкций, или носители, должны обеспечивать: компактизацию ДНК, іроникновение в клетки мишени, предотвращать деградацию ДНК лизосомальными іерментами и обеспечивать ядерную транслокацию. При этом, система доставки должна !ыть не токсичной или иммуногенной, а входящие в ее состав компоненты быть іиодеградируемьгми ( Wilson, 1998).
Считается, что достижение терапевтического эффекта возможно при успешной трансфекции re менее 20% , а, по последним данным, даже 30-40% мышечных волокон не только скелетной гускулатуры, но так же мышц сердца и диафрагмы (Phelps et al, 1995). При этом основными ритериями эффективности трансфекции и терапевтического эффекта являются: появление .истрофин-положительных мышечных волокон (ДПМВ), нормализация уровня биохимических іаркеров МДД/Б, изменения физиологических параметров мышц. Высокий уровень рансфекции пока достигнут только в нескольких опытах, где кДНК гена дистрофина вводили с юмощью аденовирусного или ретровирусного векторов (Ascadi et al., 1995; Fassati et al., 1995). іспользование вирусных носителей, однако, наталкивается на существенные методические рудности. Наибольшим препятствием к использованию вирусных векторов является «ражённый иммунный ответ на вирусные антигены. Вышеперечисленных недостатков в яачительной мере лишены невирусные носители (липосомы, олигопептиды, полимеры и др.). Однако эффективность трансфекции при их использовании in vivo оказывалась очень низкой
(Turner et al., 1997). Таким образом, проблема создания и испытаний новых средст; доставки генных конструкций в мышцы продолжает оставаться актуальной проблемоі генотерапии миодистрофии Дюшенна.
Данная работа является продолжением цикла проводимых лабораторией пренатальної диагностики ИАГ РАМН исследований, по разработке экспериментальных основ генотерапт МДД/Б и посвящена анализу результатов доставки кДНК гена дистрофина человека в мышвд мышей mdx при помощи различных типов невирусных носителей генов. Цели и задачи исследования. Целью работы является поиск оптимальных методої невирусной доставки гена дистрофина человека в мышцы mdx мышей и оценка эффект; генетической трансфекции.
Для реализации намеченной цели были поставлены следующие задачи:
Проанализировать эффективность экспрессии гена дистрофина человека в зависимости от Типа генных конструкций и способов их доставки в пораженные мышцы мышей mdx
Иммуноцитохимическими и молекулярными методами изучить эффект генокоррекции; '3. Изучить возможность системной коррекции дефекта скелетных мышц, диафрагмы и сердцг мышей mdx в условиях внутримышечного введения генных конструкций;
Научная новизна и практическая значимость.
Впервые исследованы особенности трех новых невирусных способов доставки кДНК геш
дистрофина в мышцы биологических моделей МДД мышей mdx. Впервые показане
существование феномена "дистантной трансфекции". Открытие феномена "дистантной
трансфекции" органов и тканей модельных животных открывает перспективы для системной
терапии миодистрофии Дюшенна путем внутримышечного и внутривенного введения
генотерапевтических конструкций. Впервые показана возможность прохождения
синтетических полимерных микросфер с "терапевтическими" генами .... через гематоэнцефалический барьер. Впервые доказана возможность высоко эффективной ядерной доставки генных конструкций с использованием невирусного носителя. Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы в качестве экспериментальной основой для разработки доклинических и первой клинической фаз испытаний геннотерапевтических конструкций для лечения миодистрофии Дюшенна. Основные положения, выносимые на защиту:
Возможность эффективной доставки кДНК гена дистрофина с помощью невирусны:
носителей. Обеспечение длительной экспрессии генных конструкций, доставленных в мышш
с использованием невирусных способов доставки. Возможность трансфекции различны;
групп мышц просте однократного внутримышечного введения (феномен "дистантноі
трансфекции"). Прохождение невирусных носителей с геными конструкциями через гемато
энцефаллический барьер. Возможность эффективной ядерной доставки с использование»
невирусных носителей. . .
Апробация работы. Представленные в диссертации результаты были доложены на VIII итогої конференции «Геном человека-98» (Черноголовка, 1998), 30-м совещании Европейского общее по тенетике человека (Лиссабон, 1998), VI совещании Европейской рабочей группы по геш терапии человека (Иерусалим, 1998), V Российском Национальном Конгрессе «Человек лекарство» (Москва, 1998), II Американском совещании по генной терапии (Вашингтон, 1999), итоговой конференции «Геном человека-99» (Черноголовка, 1999), II съезде Всероссийск общества генетиков и селекционеров (С-Петербург, 2000), II Всероссийском съезде медицинсі генетиков (Курск, 2000).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 8 таблицами и 10 рисунками. Диссертация состоит из
