Введение к работе
Актуальность проблемы. Генная терапия является перспективным подходом к лечению наследственных и приобретенных заболеваний с помощью генов и продуктов их экспрессии. Результатом генной терапии является нормализация, ослабление или ликвидация патологического процесса, полное или частичное восстановление поврежденных или утраченных функций клеток, тканей, органов и излечение организма. Одной из центральных проблем генной терапии является отсутствие эффективных способов доставки генных конструкций в клетки. Наблюдаемая в большинстве случаев низкая эффективность трансфекции с использованием “незащищенной” ДНК послужила толчком к разработке средств внутриклеточной доставки генетических конструкций. На сегодняшний день вирус-опосредованный перенос считают наиболее эффективным способом доставки ДНК в клетки млекопитающих in vivo. Однако использование вирусных векторов серьезно ограничено их иммуногенностью и риском инсерционного мутагенеза. Альтернативным подходом является поиск невирусных носителей, способных повысить эффективность доставки гена “интереса” в клетки.
Перспективным направлением в разработке средств доставки генов является создание невирусных носителей на основе поли- и олигопептидов. Высокомолекулярный полилизин был одним из первых полимеров, использованных для невирусной доставки ДНК в организм (Wu, Wu, 1988). На первых этапах таких работ исследователей привлекала биодеградируемость полилизина и его производных, наличие стандартизованных и недорогих методов синтеза и очистки. Важным преимуществом таких носителей была возможность их модификации сигналами для преодоления вне- и внутриклеточных барьеров транспорта ДНК (Pouton, Seymour, 2001; Morris et al., 2000).
Одним из направлений модификации высокомолекулярного линейного полилизина явилось создание разветвленных полимеров. Плотность положительного заряда на разветвленной молекуле существенно выше по сравнению с линейным поликатионом. Методом светорассеяния установлено, что форма разветвленного полилизина по сравнению с линейным полилизином приближается к сферической, и в значительной мере напоминает структуру глобулярных белков. Наличие т.н. «гистоновой мимикрии» данной группы соединений предопределило интерес к исследованию их в качестве невирусных средств доставки ДНК (Власов, 2006).
Способность к трансфекции в значительной мере зависит от присутствия на поверхности носителя функциональных групп. Вводя в состав носителя те или иные химические группировки, можно избирательно влиять на эффективность преодоления определенного барьера. Ранее в работах по изучению лизин-гистидинового сополимера была отмечена перспективность такой модификации. За счет выхода комплексов ДНК/носитель из эндосом полученные соединения обеспечивали более эффективную доставку ДНК, чем сам полилизин в присутствии эндосомолитического агента (Midoux, Monsigny, 1999).
Основным недостатком использования высокомолекулярных полимеров оказалась их высокая токсичность (Brown et al., 2001). Возможным способом снижения токсичности было уменьшение молекулярного веса. Однако способность низкомолекулярных соединений образовывать комплексы с ДНК, стабильные при физиологических условиях оказалась сниженной. Это явилось предпосылкой к развитию направления, связанного со стабилизацией таких носителей методом перекрестных сшивок (Adami, Rice, 1999). Возможным подходом к образованию перекрестных сшивок между молекулами носителя является его модификация остатками цистеина (McKenzie et al., 2000). Наличие остатков цистеина обуславливает возможность образования дисульфидных связей между молекулами. В результате образуется полимер, который в сравнении с низкомолекулярными соединениями способен более эффективно конденсировать ДНК в стабильные комплексы. При попадании в клетку полимер распадается за счет редукции дисульфидных связей, что снижает его токсичность.
Необходимым требованием при разработке средств доставки ДНК является создание носителей, способных обеспечивать специфичный перенос генных конструкций, путем их модификации лигандами к соответствующим тканеспецифичным рецепторам (Schaffner, Dard, 2003; Kawakami et al., 2004; Park et al., 2006). Для генной и клеточной терапии актуальным направлением является создание системы направленного транспорта генов в стволовые и опухолевые клетки. Возможным подходом для направленной доставки генов в эти клетки является модификация носителя лигандом к хемокиновому рецептору CXCR4, который присутствует в более чем 20 видах опухолей и представлен на поверхности некоторых типов стволовых клеток (Juarez et al., 2004).
Вышесказанное предопределило направление данного исследования, связанного с изучением серии разветвленных аминокислотных носителей с неупорядоченным ветвлением, самосшивающихся цистеин-богатых пептидов и сигнальных пептидов для связывания с рецептором CXCR4 на поверхности клеток.
Целью данной работы является поиск перспективных невирусных носителей на основе поли- и олиголизина для направленной доставки генных конструкций в клетки млекопитающих.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследование влияния состава носителей на условия образования комплексов с ДНК.
2. Определение влияния состава пептидных носителей на трансфекционную активность их комплексов с ДНК in vitro.
3. Анализ токсических свойств комплексов ДНК с гиперразветвленными и цистеин-богатыми пептидами.
4. Разработка пептидных последовательностей для адресной доставки ДНК в клетки с экспрессией рецептора CXCR4.
5. Изучение особенностей проникновения сигнальных пептидов в клетки экспрессирующие рецептор CXCR4.
6. Изучение особенностей трансфекции клеток in vitro комплексами сигнальных пептидов и ДНК.
Научная новизна работы. Впервые были изучены серии оригинальных синтетических поли- и олигопептидов в качестве средств доставки генетических конструкций в клетки. Проанализировано влияние состава и структуры исследованных лизин-богатых носителей на трансфекционную активность комплексов с ДНК in vitro. Впервые были исследованы N-концевые последовательности хемокинов SDF-1 и vMIP-II в качестве лигандов для рецептор-опосредованного переноса генных конструкций в клетки. Продемонстрированы специфичность связывания данных последовательностей с рецептором и направленная доставка ДНК в клетки с экспрессией CXCR4.
Практическая значимость работы. Полученные результаты могут служить основой для создания невирусного модульного носителя, содержащего сигналы для преодоления барьеров внутриклеточного транспорта и адресной доставки генных конструкций в клетки. Разработан вариант пептидного носителя, который может найти применение при разработке генной терапии ряда наследственных и онкологических заболеваний.
Положения, выносимые на защиту. Замещение в составе гиперразветвленного полилизина части терминальных остатков лизина на гистидин увеличивает трансфекционную активность его комплексов с ДНК. Тип полимеризации, длина и состав самосшивающихся цистеин-богатых пептидов влияют на эффективность трансфекции комплексов ДНК/носитель. При оптимальных зарядовых соотношениях самосшивающиеся пептиды менее токсичны, чем гиперразветвленные полилизины. Последовательности N-концевых фрагментов хемокинов SDF-1 и vMIP-II обеспечивают адресную доставку ДНК в клетки с рецептором CXCR4. Сигнальные пептидные носители связываются с рецептором CXCR4, избирательно проникают и доставляют ДНК в клетки.
Апробация работы. Представленные в диссертации результаты были доложены на III съезде ВОГИС (2004); в материалах 5 конгресса медицинских генетиков (2005); на 6 международной конференции по генетике соматических клеток (2005); на 11, 12, 13, 14, 15 и 16 Конгрессах Европейского Общества Генной Терапии (2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008); на 14, 15 и 17 Европейской Конференции по Генетике Человека (2004, 2005, 2007); на 9 Ежегодной конференции Американского Общества Генной Терапии (2006); на конференции Британского общества генной терапии (2006); на 4 и 7 конференциях по наномедицине (2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из «Введения», «Списка сокращений», «Обзора литературы», «Материала и методов», «Результатов», «Обсуждения», «Выводов», «Списка литературы», состоящего из 314 источников, и «Приложения». Работа изложена на 178 страницах и содержит 46 рисунков и 2 таблицы.
Похожие диссертации на Линейные и разветвленные поли- и олигопептиды на основе лизинга как средства доставки генных конструкций в клетки млекопитающих
