Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Структурно-функциональная характеристика кожи в норме и при механическом повреждении 9
1.1. Современные проблемы (современное состояние представления о 9
структуре кожи
1.2. Механическое повреждение и характеристика раневого процесса при заживлении кожной раны
1.3 Регенерация тканей кожи и источники ее посттравматической регенерации
1.4 Реактивность организма на травму 16
1.5. Методы коррекции раневого процесса 19
Глава 2. Материал и методы исследования 24
2.1. Дизайн исследования 24
2.2. Экспериментальная модель и серии исследования 25
2.3. Методы исследования 27
2.4. Статистический анализ 32
Результаты собственных исследований 34
Глава 3. Анатомо-физиологическая характеристика кожи белой крысы в норме и после механического повреждения
3.1. Светооптическая обзорная и морфометрическая характеристика кожи в норме и динамике раневого процесса
3.2. Иммуногистохимическая характеристика динамики раневого процесса 65
3.3. Системный ответ организма белой крысы на механическое повреждениє кожи бедра
Глава 4. Сравнительная иммуноморфологическая характеристика раневого процесса кожи белой крысы при различных способах его коррекции
4.1. Протезирование дренажно-детоксикационной системы поврежденной кожи сорбентом СУМО
4.2. Активация процесса регенерации поврежденной кожи с помощью мази «Ретинол+Метилурацил» :
4.3. Сравнительный анализ влияния на интенсивность пролиферации эпителиальных клеток в перинекротической зоне сорбента, мази «Ретинол+Метилурацил» и их сочетания
Глава 5. Обсуждение полученных результатов 108
Выводы 130
Практические рекомендации 131
Список литературы
- Механическое повреждение и характеристика раневого процесса при заживлении кожной раны
- Экспериментальная модель и серии исследования
- Иммуногистохимическая характеристика динамики раневого процесса
- Активация процесса регенерации поврежденной кожи с помощью мази «Ретинол+Метилурацил»
Введение к работе
Актуальность проблемы. Механическое повреждение кожи - неизбежное следствие практически любой травмы, часто встречается, значительно варьирует по тяжести и площади контакта с травмирующим фактором, имеет большое значение для исхода посттравматического восстановления организма, а часто и социальной реабилитации пострадавших (Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1990; Мурзабаев Х.Х., 2002; Бычков В.Г., 2009).
Значение исследования раневого процесса в коже связано не только с ростом стихийных бедствий, производственных и бытовых травм, автокатастроф, военных действий, но и с необходимостью привлечения современных высокоинформативных методов изучения его патогенеза, в том числе механизмов компенсаторно-восстановительной реорганизации цито- и гистоархитектоники составляющих компонентов кожи, взаимоотношения ее дренажно-детоксикационной системы и пролиферативной активности эпителиальных, эн-дотелиальных клеток, клеток соединительной ткани и крови на разных этапах замещения дефекта, формирования соответствующих гистионов (Мурзабаев Х.Х., 2004; Чепурненко М.Н., 2007; Ноздрин В.И. и др., 2009; Одинцова И.А., 2010; Данилов Р.К., 2010).
Структурно-функциональные механизмы заживления раны кожи после повреждающего механического воздействия хорошо изучены. По данным литературы, раневой процесс в коже рассматривается как реализация потенциально возможных адаптивных механизмов комплекса тканей организма в рамках взаимодействующей системы гистиона. Однако широко обсуждаемая концепция о гистионе позволяет по-новому оценить фазность течения раневого процесса с учетом взаимоотношения клеток различных дифферонов в гистионе и его последующей трансформации при заживлении раны (Одинцова И.А., 2003; Ноздрин В.И. и др., 2006; Чепурненко М.Н., 2007; Данилов Р.К., 2010; Соловьев Г.С. и др., 2010; Hamamoto Т. et al., 2009; Nussbaum E.L. et al., 2009).
При изучении гистофизиологии кожи после повреждения большое значение, как и в других органах (Сапин М.Р., 1995, 2001; Машак А.Н. и др., 2010; Стадников А.А., 2008, 2010) играет определение состояния ее дренажно-детоксикационной функции. Поэтому исследование раневого процесса, как своеобразной системы, которая зарождается, формируется, функционирует и подвергается регрессу, со всеми сопровождающими эти изменения системными и межсистемными взаимоотношениями, несомненно, позволит получить новые научные данные.
Таким образом, вопросы нормализации (протезирования) дренажно-детоксикационной функции кожи и целенаправленной коррекции пролиферативной активности ее недифференцированных клеток, как основы регенерации кожного дефекта, изучены недостаточно, и их расшифровка имеет существенное теоретическое и прикладное значение для усовершенствования тактики и разработки способов локального консервативного лечения механической травмы кожи.
В связи с вышеизложенным, считаем целесообразным проведение сравнительного морфометрического и иммуноморфологического изучения деструктивных и репаративных изменений кожи в динамике постгравматического периода при воздействии мази «Редецил» (на основе ретинола и метилурацила) (Ноздрин В.И. и др., 2009) и неспецифическом воздействии на раневой процесс сорбента СУМС-1, который обеспечивает локальную нормализацию дренажно-детоксикационной функции любой микроциркуляторной системы (Бородин Ю. И. и др., 1997; Бгатова Н.П., Новоселов., 2000; Семченко Л.Ю. и др., 2002).
Цель работы. Выяснить закономерности репаративной регенерации кожи после механического повреждения и обосновать способы целенаправленной коррекции раневого процесса.
Задачи исследования:
1. Провести сравнительное анатомическое и гистологическое морфомет-
рическое исследование пространственной реорганизации различных отделов и
компонентов кожи в норме и после механического повреждения.
2. Выявить особенности деструктивных и компенсаторно-
восстановительных изменений основных клеточных дифферонов перинекроти-
ческой зоны кожи и ее микроциркуляторного русла в динамике посттравмати
ческого периода.
3. Определить влияние раздельного и сочетанного применения сорбента
СУМС-1 и мази Редецил на ремоделирование кожи: микроциркуляторного рус
ла, гисто- и цитоархитектоники основных клеточных дифферонов в посттрав
матическом периоде.
Новизна исследования. В эксперименте с использованием комплекса гистологических, иммуногистохимических, морфометрических методов и системного статистического анализа получены новые количественные данные об изменении структурно-функционального состояния и гистофизиологии различных клеточных дифферонов и функциональных гистионов кожи в динамике восстановительного периода после ее механического повреждения. Установлено, что после повреждения кожи изменяется отношение толщины слоев, объемных долей коллагеновых волокон, эпителиальных клеток волосяных влагалищ, микрососудов, межклеточного пространства. Увеличение толщины эпидермиса в 4,4 раза и численной плотности его клеток в 1,2 раза сопровождается увеличением индекса пролиферации базальных клеток эпидермиса в 5,6 раза (до 88,6±12,2%) по сравнению с контролем. Выявлены особенности количественных изменений, структурного взаимодействия всех типов клеток перинекроти-ческой зоны кожи в динамике деструктивных и компенсаторно-восстановительных процессов, показана роль дивергенции в репаративном гистогенезе. Обоснована возможность целенаправленной коррекции раневого процесса кожи с помощью сорбента СУМС-1 и мази Редецил. Выявлено, что сорбент СУМС-1 и мазь Редецил имеют различные временные интервалы оптимального воздействия на раневой процесс. Максимальный эффект сорбента достигается в фазу активного воспалительного процесса (1-3 сут), а мази Редецил - на фоне активации механизмов репаративного гистогенеза (7-14 сут).
Теоретическое и практическое значение работы. С помощью современных иммуногистохимических и морфометрических методов исследования проведена более глубокая детализация структурно-функционального состояния всех клеточных и неклеточных компонентов кожи в динамике раневого процесса. Количественная оценка результатов иммуногистохимического выявления миоидных клеток в эпидермисе и дерме позволила уточнить роль дивергенции в посттравматическом гистогенезе кожи. Выявленные особенности динамики деструктивных и компенсаторно-восстановительных процессов кожи в посттравматическом периоде при протезировании дренажно-детоксикационной функции кожи и стимуляции пролиферативной активности камбиальных клеток позволили понять особенности пространственных структурных изменений кожи, формирования воспалительного и регенерационного гистионов на различных этапах заживления раны в зависимости от характера воздействия в посттравматическом периоде.
Полученные данные послужат базой для дальнейшего изучения закономерностей регенерации кожи после ее механического повреждения, а также целенаправленного поиска способов коррекции раневого процесса. Результаты настоящего исследования и теоретические положения, разработанные на их основе, могут быть использованы в преподавании на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии, патологической физиологии, анатомии человека высших медицинских учебных заведений при изучении вопросов морфологии и функционирования кожи в условиях нормы и после механического повреждения.
Внедрение полученных результатов. Данные об особенностях регенерации кожи после механической травмы в эксперименте и возможных путей их коррекции внедрены в курс лекций, практических занятий и научно-исследовательскую работу кафедр гистологии, анатомии человека и патологической физиологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Росздрава.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
После механического повреждения кожи бедра белых крыс в перинек-ротической зоне происходит фазная анатомогистологическая пространственная реорганизация ее отделов, обусловленная комплексом взаимосвязанных изменений относительного объема эпидермиса, волосяных влагалищ, дермы, интер-стициальных пространств, микрососудов и различных клеточных дифферонов.
-
Активизация и реализация структурно-функциональных механизмов репаративного гистогенеза после механического повреждения сопровождается взаимосвязанными изменениями эпителиального, фибробластического, макро-фагального и эндотелиального дифферонов, активацией механизмов дивергенции, в результате которых увеличивается общая масса клеток, количество основного вещества соединительной ткани, формируется неоангиогенез, усиливается внутри- и междифферонная гетероморфия, появляются специализированные миоэпителиальные и миофибробластические клетки с последующей адап-
тивной пространственной перестройкой межклеточных и междифферонных взаимоотношений.
3. Стимуляция дренажно-детоксикационной функции кожи с помощью сорбента СУМС-1 и пролиферативной активности камбиальных клеток кожи с помощью мази Редецил ускоряет процесс трансформации гистиона фазы воспаления в регенерационныи гистион и сокращает длительность репаративного гистогенеза.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Республиканской конференции молодых ученых Республики Башкортостан с международным участием «Медицинская наука, 2009», посвященной году Поддержки и развития молодежных инициатив, Дню медицинского работника (Уфа, 2009); конференции ученых Республики Башкортостан с международным участием «Научный прорыв, 2009», посвященной году Поддержки и развития молодежных инициатив, Дню республики (Уфа, 2009); на «II Сибирском ветеринарном конгрессе», посвященной актуальным вопросам ветеринарной медицины (Новосибирск, 2010); научной конференции «Вопросы морфологии XXI века», посвященной 80-летию со дня рождения А.А.Клишова (Санкт-Петербург, 2010); на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы медицинской науки», посвященной 1000-летию Ярославля (Ярославль, 2010), на X Конгрессе международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них в изданиях перечня ВАК - 3.
Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Содержание диссертации изложено на 158 страницах машинописного текста, фактические данные иллюстрированы 58 рисунками, 7 таблицами и схемой. Указатель литературы включает 200 источников, из них иностранных - 100. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.
Механическое повреждение и характеристика раневого процесса при заживлении кожной раны
Данные по изучению механизма действия синтетических аналогов витамина А на различные клеточные популяции в норме и патологии представлены в обзорах Ю.И. Афанасьева и соавт. (1986, 1989), В.И. Ноздрина и соавт. (1989, 1990, 1995, 1997), в работах Г.А. Зелинского и соавт. (1979), В.И. Щербакова (1990), Ю.Т. Волкова (1995, 1997).
Действие витамина А на эпителиальные ткани изучено наиболее полно. Эпидермис реагирует на недостаток витамина А истончением ростковой зоны, полиморфизмом ядер, утолщением рогового слоя (Ноздрин В.И: и соавт., 1997, 2000). Умеренно повышенные дозы ретиноидов стимулируют пролиферацию кератино-цитов как в моделях in vitro (культура эпителия кожи и эпидермальне эксплантан-ты), так и in vivo у экспериментальных животных и человека, способствуя накоплению в популяции молодых низкоплоидных клеток (Kautsky et al., 1995).
Биологически активные формы витамина А не обладают мутагенным действием, а при длительном применении, и сами являются антимутагенами и, что вызываемый ими у кератиноцитов гиперпластический эффект, носит обратимый характер (Афанасьев Ю.И. и др., 1990). Tsambaos и Orfanos (1985) проанализировали литературные данные о специфических эффектах 13-цисретиноевой кислоты (13 цРК) в отношении пролиферации и дифференцировки эпителия и пришли к заключению, что они могут быть связаны со способностью этого вещества активизировать РНК-полимеразу, синтез ДНК и РНК.
При введении животным фармакологических доз производных витамина А усиливаются реакции гуморального и клеточного иммунитета, повышается про лиферация лимфоцитов тимуса, активируется размножение лимфоцитов в ответ на митогены, стимулируется цитотоксичность Т-киллеров (Иванова И.А., 1994; Волков Ю.Т., Ноздрин В.И., 1996; Волков Ю.Т. и соав., 1997). 13 цРК способна изменять количество и функциональную активность NK-клеток и повышать отношение хелперных/супрессорных форм лимфоцитов (Greaves et al, 1988; Andrades J. A. Et al., 1999; Anderson G.G. et al., 2010).
По данным A.B. Сергеева и соавт. (1983), ІЗцРК в смешанной культуре лимфоцитов способна дозозависимо стимулировать образование Т-киллеров. Небольшие дозы ретиноидов играют роль фактора, поддерживающего продукцию Т-лимфоцитов в физиологических условиях, введение витамина А и ретиноидов in vivo в повышенных дозах также стимулируют реакции гуморального иммунитета (Иванова И.А. и соавт., 1999). Жучков С.А. (2007) показал, что при накожной аппликации растворов, содержащих 13-цис-ретиноевую кислоту, происходит увеличение количества делящихся клеток на фоне снижения числа покоящихся и полиплоидных клеток, что отражается в усилении пролиферативной и синтетической активности клеток. Крутых Е.Г. (2008) после ежедневного, в течение двух недель аппликации дегтя беревого на кожу межлопаточной области спины крыс выявил изменения морфогенеза интерфолликулярного эпидермиса, проявляющегося его утолщением с развитием гиперкератоза, возрастанием средней площади кератиноцитов шиповатого слоя, уменьшением ядерно-цитоплазматического отношения, расширением зернистого слоя, увеличением пролиферативной активности кератиноцитов и числа гипердиплоидных клеток.
Таким образом, биологически активные формы витамина А принимают участие в поддержании нормальных функций системы иммунологического надзора. Умеренно повышенные дозы препаратов этой группы стимулируют реакции гуморального и клеточного иммунитета, оказывая влияние на гранулоциты, макрофаги и лимфоциты (Ноздрин В.И. и соавт., 2004).
Входящий в состав мази «Редецил» метилурацил ускоряет процессы клеточной регенерации (восстановления); ускоряет заживление ран, стимулирует клеточные и гуморальные (тканевые) факторы зашиты. Оказывает также противовоспалительное действие. Характерной особенностью препарата является стиму ляция эритро- и особенно лейкопоэза (процесса образования эритроцитов и особенно лейкоцитов), в связи с чем его обычно относят к группе стимуляторов лейкопоэза (Ноздрин В.И. и др., 2006).
Очень важным в раневом процессе, при механической травме в том числе, остается вопрос о дренажно-детоксикацинной функции микроциркуляторного русла кожи и методах их коррекции. Для этих целей в настоящее время используют различные сорбенты. Сорбенты (от лат. Sorbens — поглощающий) — твердые тела или жидкости, избирательно поглощающие из окружающей среды газы, пары или растворенные вещества. В хирургической практике, при интоксикациях различного генеза применяется сорбент углеродминеральный СУМС-1. Хорошие результаты при его применении наблюдались у больных сахарным диабетом.
Сорбент СУМС-1 - это окись алюминия, покрытая углеродной пленкой методом пиролиза. СУМС-1 обладает высокой адсорбционной способностью в отношении эндо- и экзотоксинов различного происхождения, используется в медицине в качестве энтеросорбента для снятия интоксикации организма. СУМС-1 обладает высокой адсорбционной способностью, высокой биосовместимостью со средами организма, обеспечивает избирательное извлечение (адсорбцию) токсинов, не нарушает водно-солевой баланс (Любарский М.С. и соавт., 2001).
Исследования последних лет показывают, что многие сорбенты (активированный уголь, цеолиты), выводят из организма не только токсины, но и ионы, необходимые для поддержания, гомеостаза. СУМС-1 не вызывает нарушения водно-электролитного баланса, эффективен при лечении заболеваний, сопровождающихся интоксикацией средне- и высокомолекулярными веществами (Бгатова Н.П., Новоселов Я.Б., 2000; Семченко Л.Ю. и соавт., 2002) В монографии Рачков-ской Л.Н, (2005) отмечалось благотворное влияние на липидный обмен самостоятельного курса сорбента СУМС-1.
Остается актуальным вопрос о путях оптимизации течения раневого процесса путем воздействия на него фармакологическими препаратами. На этапе экссудации - выхода жидкой части крови и форменных элементов во внесосудистое русло под действием биологически активных веществ — серотонина, гистамина, цитокинов целесообразно использовать сорбенты для улучшения дренажно детоксикационной функции микроциркуляторного русла. Так как сорбент СУМС-1 во всех клинических случаях применялся внутрь и о его действии можно было судить по улучшению общего состояния организма, необходимо понять механизм его местного действия. Во второй фазе раневого процесса, когда идет рост новообразования соединительной ткани и появления клеток фибробластиче-ского дифферона необходимо применять препараты, влияющие на пролиферацию и дифференцировку клеток эпидермиса. К таким препаратам относятся биологически активные формы витамина А (Ноздрин В.И. и соавт., 2004, 2008).
Таким образом, проведенный обзор литературы свидетельствует о том, что существует огромная базовая информация о структурно-функциональной организации кожи в норме и при различной патологии, включающей и механическую травму. Однако детального иммуноморфологического изучения всех компонентов гистиона на различных этапах раневого процесса нет.
Кроме того, слабо изучены возможности специфических и неспецифических методов коррекции регенераторного процесса. Под специфическими методами мы понимаем способы фармакологического воздействия непосредственно на рецепторы основных путей активации механизмов пролиферации клеток, под неспецифическими методами - способы, улучшающие микроокружения регенераторного субстрата (микроциркуляция, дренажно-детоксикационая функция).
В связи с этим мы считаем целесообразным проведение экспериментального исследования на животных, которое позволит ответить на возникшие в ходе обзора литературы вопросы.
Экспериментальная модель и серии исследования
Для оценки результатов иммуногистохимического окрашивания с использованием антител к СК-14 измеряли ширину зоны положительной и «отрицательной » экспрессии белка (в мкм) при помощи комплекса Микмед - 2-1600-3 и программного обеспечения Image Tool (USA, Universiti Texas).
Цитохимические методы. Нейтрофильные гранулоциты уничтожают микроорганизмы, разрушают и переваривают поврежденные клетки и ткани, участвуют в регуляции деятельности других клеток благодаря способности к выработке ряда цитокинов. Цитоплазма нейтрофильного гранулоцита содержит первичные, вторичные и третичные гранулы. Самые крупные первичные (азурофильные) гранулы содержат миелопероксидазу, вторичные гранулы содержат щелочную фосфатазу. Они секретируются в межклеточное вещество соединительной ткани, где играют большую роль в мобилизации медиаторов воспалительной реакции и активации .системы комплемента. Цитоплазма лимфоцитов содержит лизосомы, секретирующие кислую фосфатазу, которая определяет цитотоксическую активность клеток (Данилов Р.К., 2008). В мазках периферической крови в лейкоцитах цитохимическими методами определяли: 1) активность миелопероксидазы - бензидиновый метод по Грехем- Кнолли (Карпищенко А.И., 1998); 2) активность щелочной фосфатазы - реакция азосочетания в модификации А.Г.Михеева(1970); 3) активность кислой фосфатазы - реакция одновременного азосочетания по A. Goldberg, Т. Barka (1962).
Уровень цитохимической активности кислой фосфатазы, щелочной фосфатазы и миелопероксидазы лейкоцитов оценивали путем расчета среднего цитохимического коэффициента, подсчитывали 100 клеток и разделяли их группы в процентном отношении в зависимости от выраженности реакции, определяемой по интенсивности отложения красителя. В нейтрофилах и лимфоцитах определяли 4 степени активности (0-я группа - отсутствие окраски, 1-я группа - единичные гранулы, 2-я группа - мелкая пылевидная зернистость, 3-я группа - наличие в цитоплазме нескольких четких крупных гранул) и последующем вычислением среднего цитохимического коэффициента полуколичественным методом по М. Astaldi, L. Verga (1957). СЦхК= (а+2б+Зс)/100, где а - количество лейкоцитов со слабой, 6-е умеренной, в - с высокой активностью фермента при подсчете на 100 лейкоцитов, 2.4. Статистический анализ Системный статистический анализ проводили при помощи программ Statisti-са for Windows (Версия 6.0, StatSoft, Inc.) (Боровиков В., 2001; Реброва О.Ю., 2002).
Сначала определяли основные статистические характеристики изучаемых параметров (средняя, медиана, квартили, дисперсия, стандартное отклонение, стандартная ошибка, асимметрия и эксцесс). Затем проводили тест на нормальность распределения признака (критерии Колмогорова-Смирнова, Шапиро Уилкса W). В случае (1) нормального или близкого к нормальному распределения признака, (2) при условии равенства дисперсий распределения признака в сравниваемых группах, использовали методы параметрической статистики (t-критерия для зависимых и независимых выборок, дисперсионный анализ ANOVA). Условия 1 и 2 соблюдались только по некоторым параметрам и срокам. Поэтому предпочтение было отдано менее чувствительной, но и менее ограниченной условиями применения непараметрической ранговой статистике. Различия между независимыми выборками определяли с помощью двухвыборочного критерия Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова. Использовали также ранговый дисперсионный анализ ANOVA Краскела-Уоллиса. Для категориальных переменных применяли Хи-квадрат., точный критерий Фишера. Степень связи между двумя переменными устанавливали с помощью корреляции Спирмена.
Материал был представлен как среднее ± стандартное отклонениесредней (M±s) или как медиана, Q1 — верхний квартиль, Q2 — нижний квартиль (Me, Q1,-Q2) (Автандилов Г.Г., 1980; Гланц С, 1998). Нулевая гипотеза отвергалась, а альтернативная принималась при степени значимости соответствующей р 0,05, мощность статистического исследования была в пределах 0,70-0,90. Для большей части медицинских и биологических исследований этого вполне достаточно (Реброва О.Ю., 2001; Гланц С, 1998).
Все исследования выполнены лично автором на базе Башкирского Государственного Медицинского Университета (кафедра гистологии, зав. кафедрой -д.м.н., профессор Х.Х. Мурзабаев), в гистологической лаборатории ВНИИ БТЖ СО РАСХН (зав. лабораторией - к.в.н. Е.Ю. Секин), на базе Омской Государственной Медицинской Академии (ІДНИЛ, зав. лабораторией - д.м.н., профессор Т.И. Долгих, кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии).
Иммуногистохимическая характеристика динамики раневого процесса
Таким образом, через 7 сут фронт эпителиального пласта в зоне раны продвинулся более чем на 500 мкм, а толщина эпидермиса в перинекротической зоне увеличилась до 63,7±5,6 мкм. Происходит своеобразное «выталкивание» клеток эпидермиса перинекротической зоны преимущественно (почти в 10 раз) вдоль эпителиального пласта. Для объяснения причины этого явления мы предлагаем теоретическую гипотезу (как дополнение к уже существующим) роли биомеханических сил в зоне раны для экспансии эпителия. Гиперплазия и гипертрофия базальных клеток эпидермиса в перифокальной зоне приводит к тому, что между базальной мембраной и роговым слоем эпидермиса увеличивается градиент концентрации и плотности клеточного материала. Наиболее подвижными клетками эпидермиса являются клетки 2-3 слоя, именно эти клетки и выдавливаются в зону роста, увлекая за собой связанные с ними окружающие клетки. Кроме того, под пластом этих клеток, вероятно, создается микроокружение, необходимое для формирования базальной мембраны и последующей миграции по ней базальных клеток.
Суммирование и сопоставление данных морфометрического исследования анатомо-функционального состояния дермы показало, что после травмы имеются определенные закономерности изменения ее структурных компонентов (рис. 2). Через 6 ч, 1 и 3 сут после травмы толщина дермы увеличивается соответственно на 15,9, 19,5 и 17,2% в сравнении с контролем. При этом объемная плотность коллагеновых волокон, сальных желез, эпителия волосяных влагалищ и численная плотность фибробластов статистически значимо уменьшаются. В большей степени изменяется относительная плотность коллагеновых волокон (на 34,8%) (рис. 2). Анализ участков дермы, содержащих только коллагенове волокна, фиб-робласты и межклеточные пространства (рис. 5, 6), проведенный с помощью программы ImageJ 1.44, показал, что в норме межклеточные пространства составляют 6,9% (95% ДИ - 4-9%), а поле травмы - 20% (95% ДИ - 15-25%), что статистически значимо больше. Все это с высокой степенью достоверности свидетельствует о том, что в течение 3 сут после травмы пространственные анатомические изменения обусловлены увеличением относительной плотности межклеточного пространств в единице объема дермы - ее отеком.
Через 7 сут отек дермы уменьшается, а относительная плотность волокон коллагена, волосяных влагалищ и численная плотность фибробластов увеличивается. Высокий уровень этих показателей сохраняется и через 14 сут после травмы (рис. 2).
Нижеприведенные изменения объемной плотности основных компонентов дермы кожи бедра белой крысы после высококинетической травмы сопоставимы по времени с изменением объемной плотности сосудов дермы и гиподермы (рис. 14). Отек дермы в раннем периоде (6 ч, 1 сут) сопровождается уменьшением объемной плотности сосудов дермы на 60% и увеличением этого показателя в гиподерме на 59,6% (рис. 14). 200
Динамика морфометрических показателей дермы перинекротической зоны кожи бедра белых крыс после высококинетической механической травмы. - различия статистически значимы в сравнении с контролем при/? 0,05, - прир 0,01; Л - различия статистически значимы в сравнении с предыдущим сроком при/? 0,05, ЛА - при/? 0,01 и ЛАЛ - при/? 0,001. ТД - толщина дермы, ОПКВ - объемная плотность коллагеновых волокон, ОПСЖ - объемная плотность сальных желез, ОПЭВВ - объемная плотность эпителия волосяных влагалищ, ЧПФ - численная плотность фибробластов.
Через 3 сут объемная плотность сосудов дермы увеличивается на 146,7% по сравнению с предыдущим сроком и на 86,7% превышает контрольное значение. При этом объемная плотность сосудов гиподермы несколько уменьшается и превышает контрольный уровень только на 22,9%. Следовательно, в этот период происходит подготовка архитектоники сосудистого русла перинекротической зоны к интенсивному кровоснабжению регенерата. Через 7 сут объемная плотность сосудов дермы превосходит контрольный уровень уже на 126,7%, а в гиподерме находится на уровне контроля. Восстановление объемной плотности сосудов в дерме происходит через 14 сут после травмы (рис.14). 300 250 т л 200 л### ## \ л Хэи ОПГ в дерме Ш ОПГ в гиподерме 100і / л# 50 V TffffT 0 контр бч Ісут Зсут 7сут 14сут Рис. 14. Соотношение изменения объемной плотности гемососудов (ОПГ) дермы и гиподермы в коже белых крыс после высококинетической механической травмы бедра. - различия статистически значимы в сравнении с контролем при / 0,05, - при /? 0,01; Л - различия статистически значимы в сравнении с предыдущим сроком при/? 0,05; # - различия статистически значимы в сравнении с дермой при/? 0,05, ## - прир 0,01, ### - при/? 0,001.
Необходимо отметить еще одну закономерность изменения анатомо-функционального состояния кожи после ее высококинетического повреждения: увеличение объемной плотности клеток волосяных влагалищ в перинекротиче-ской зоне не сопровождается увеличением количества волос. Плотность волос уменьшается, а их пространственное распределение в дерме приобретает более высокую степень неупорядоченности. Мы полагаем, что микроокружение пери-некротической зоны изменяет динамику процесса дифференцировки эпителиальных клеток волосяных влагалищ - незрелые клетки, в силу их высокой пролифе-ративной активности и градиента концентрации, удаляются из зоны роста волоса и перемещаются в эпидермис с последующей дифференцировкой в клетки, свойственные уже для этого слоя кожи.
После нанесения механической травмы образуется сквозное повреждение кожи. При обзорном микроскопическом исследовании области механического повреждения выделяются две зоны - зона первичного некроза и перинекротиче-ская зона кожи. Механизмы гибели клеток в этих зонах различны. В зоне первичного некроза в момент травмы гибель клеток происходит в результате непосредственного действия кинетической энергии с нарушением физической целостности всех компонентов кожи, а после травмы — по типу некроза с конденсацией хроматина, появлением перинуклеарной вакуоли, вакуолизацией цитоплазмы. В пери-некротической зоне гибель клеток - более длительный процесс, а их жизнеспособность зависит от расстояния от зоны некроза и степени тканевой гипоксии. Тем не менее, преобладают обусловленные ишемией некротические механизмы повреждения эпителиальных клеток.
Активация процесса регенерации поврежденной кожи с помощью мази «Ретинол+Метилурацил»
При сравнении всех экспериментальных групп (II-V) по срокам исследования (ANOVA Краскела-Уоллиса) статистически значимые различия между группами по уровню экспрессии белков СК-14 и Ki-67 отмечались через 1, 3, 7 и 14 сут (ANOVA Краскела-Уоллиса; Н 9,8, р 0,01).
Парное сравнение между группами показало, что выявленные в ходе ANOVA различия через 1 и 3 сут были обусловлены статистически значимым увеличением на 15-22% (95% доверительный интервал) содержания Ki-67 иммунопозитивных клеток в группах животных с СУМС-1 (группа IV и V) по сравнению с животными группы II (критерий Манна-Уитни р 0,01). Различия же через 7 и 14 сут были обусловлены статистически значимым увеличением на 10-17% содержания Ki-67 иммунопозитивных клеток в группах животных, леченных мазью Редецил (группа IV и V) по сравнению с животными группы II (критерий Манна-Уитни р 0,05). Это свидетельствует о том, что через 6 часов после травмы во всех группах животных в зоне повреждения устойчиво преобладают катаболические процессы, а использованные препараты не меняют уровень экспрессии изученных белков ни .за счет специфического (активация ретинол-связывающих рецепторов), ни за счет неспецифического (протезирование дренажно-детоксикационной функции и локального снижение уровня интоксикации) влияния на эпителиальные клетки кожи.
Через 1 и 3 суток увеличение экспрессии белков СК-14 и Кі-67 в большей степени обусловлено положительным влиянием сорбента на дренажно-детоксикационную функцию кожи на фоне выраженного воспаления, а через 7 и 14 суток - активацией ретинол-связывающих рецепторов и последующей пролиферации на фоне естественного включения механизмов регенерационного гистогенеза.
Необходимо отметить, что у животных группы III, IV и V (лечение) уровень экспрессии изученных белков статистически значимо не различался от расстояния (0-200 мкм и 250-500 мкм) удаленности от границы некротической и перинекротической зоны. Это свидетельствует о том, что выявленные в группе II различия экспрессии белков пролиферации от расстояния от зоны некроза можно объяснить различным состоянием процессов микроциркуляции на расстоянии 0-200 и 250-500 мкм от зоны некроза раны. Сорбент, вероятно, нивелирует эти различия за счет протезирования дренажно-детоксикационной функции кожи на всей площади его контакта с поврежденной кожей.
Таким образом, при анализе результатов иммуногистохимического изучения уровня экспрессии белков СК-14 и Кі-67 в зоне механического повреждения кожи белых крыс получены новые данные об особенностях влияния на пролифератив-ную активность базальных клеток эпидермиса и волосяных фолликулов специфических и неспецифических способов ее регуляции. В условиях нарушения дренажно-детоксикационной функции кожи после ее механического повреждения существенно снижаются возможности специфической (посредством определенных рецепторов) активации репаративных механизмов. Вероятно, только после нормализации микроциркуляторных процессов в тканях кожи (например, с помощью сорбентов) становится возможным эффективная целенаправленная специфическая коррекция восстановления популяции эпителиальных клеток эпидермиса и волосяных фолликулов. Полученные результаты будут полезными в расшифровке патогенетических механизмов раневого процесса и его регуляции.
Иммуногистохимическое выявление CD-68 (макрофаги) показало, что после механического повреждения в перинекротической зоне кожи во всех группах животных увеличивается количество клеток, экспрессирующих этот белок. CD-68-позитивные клетки выявляются во всех слоях эпидермиса, но чаще встречаются в его поверхностных слоях. Максимальное количество макрофагов во всех группах животных выявлялось через 3 сут после повреждения, минимальное — через 6 ч. Это свидетельствует о том, что тестируемые средства коррекции раневого процесса не изменяют общих закономерностей течения раневого процесса. Однако у животных группы III и V (использование сорбента) в эпидермисе чаще встречались клетки с интенсивной иммуногистохимической реакцией с внутриклеточной локализацией и распространением метки по цитоплазме, что свидетельствовало о высокой экспрессии CD-68. Вполне вероятно, что это свидетельствовало о модуляции локальной иммунной реакции организма в ответ на механическое повреждение. Таким образом, протезирование дренажно-детоксикационной функции кожи с помощью сорбента влияет на индуктивную фазу локальной иммунной реакции, облегчая функционирование макрофагально-го дифферона путем снижения концентрации токсинов.
Для группы III (мазь) подобных закономерностей не выявлено. Это связано с тем, что фармакологический эффект мази максимально полно реализуется в условиях завершающей фазы воспаления и активации регенерационного гистогенеза (7-14 сут), когда макрофагальная реакция уже подавляется естественными механизмами регуляции раневого процесса.
Выявленные иммуногистохимические различия позволяют с позиции кле-точно-дифферонной организации кожи рассматривать восстановительные процессы в ее эпидермисе как подвижную открытую систему взаимодействующих дифферонов (различных эпителиоцитов, внутриэпидермальных макрофагов), состояние которых может целенаправленно изменяться с помощью протезирования дренажно-детоксикационной функции кожи.
