Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Структурно-функциональные изменения головного мозга при отравлении психофармакологическими препаратами и их профилактика (современное состояние проблемы) 10
1.1. Структурно-функциональные и метаболические изменения головного мозга при острых отравлениях 10
1.2. Способы защиты головного мозга 28
Глава 2. Материал и методы исследования 32
2.1. Экспериментальная модель 32
2.2. Материал исследования 33
2.3. Методы исследования 33
2.4. Статистический анализ 37
Глава 3. Структурно-функциональное состояние различных отделов дофаминергическои системы и гиппокампа головного мозга белых крыс после острой интоксикации аминазином 39
3.1. Префронтальная кора большого мозга 50
3.2. Черная субстанция 69
3.3. Хвостатое ядро 74
3.4. Гиппокамп 78
3.5. Сравнительная оценка всех изученных отделов 88
3.6. Психоневрологический статус 97
Глава 4. Структурно-функциональное состояние различных отделов дофаминергическои системы и гиппокампа головного мозга белых крыс после острой интоксикации аминазином на фоне лечения милдронатом 105
4.1. Префронтальная кора большого мозга 105
4.2. Черная субстанция и хвостатое ядро ПО
4.3. Гиппокамп 116
4.4. Сравнительная оценка всех изученных отделов 122
4.5. Состояние про- и антиоксидантной систем 127
4.6. Психоневрологический статус 129
Глава 5. Обсуждение полученных результатов 131
Выводы 145
Литература
- Способы защиты головного мозга
- Материал исследования
- Черная субстанция
- Черная субстанция и хвостатое ядро
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение закономерностей структурно-функциональной реорганизации различных уровней и отделов головного мозга млекопитающих при его диффузно-очаговых повреждениях является важной проблемой современной нейроморфологии (Боголепов Н.Н. 1979; Сотников О.С. и др., 1994; Логвинов СВ. и др., 1994; Семченко В.В. и др., 1999, 2005; Аврущенко М.Ш. и др., 2000; Bering R. et al., 1997; Corbett D., Crooks P., 1997; Nudo R.J., 2003; Marrone D.F., Petit N.L., 2002). Это связано с тем, что более глубокое системное изучение реакции различных уровней организации головного мозга на повреждение необходимо для понимания механизмов компенсаторной и репаративной реорганизации межнейронных отношений, изменения интегративно-пусковой деятельности мозга и теоретического обоснования необходимости целенаправленной коррекции процессов пато- и саногенеза в поврежденном мозге для максимально полной реабилитации его функций (Семченко В.В. и др., 1999; Clemens J.A., 2000; Neumann-Haefelin Т. et al., 2000).
Известно, что после тотального ишемического или токсического воздействия на организм в головном мозге происходит сначала селективное, специфическое для ведущего патологического фактора повреждение нейронов и синапсов, а затем репаративная реорганизация поврежденных и адаптивная реорганизация неповрежденных нейронных сетей. Это приводит к перестройке нейронных сетей и рассматривается, как структурная основа изменения деятельности головного мозга после повреждения (Семченко В.В. и др., 1995, 1999; Schmidt-Kastner R., Freund T.F., 1991; Castejon О J. et al, 1995; Scott D.E., Hansen S.L., 1997; Carulli D. et al, 2004).
Особое значение приобретают работы, в которых проводится комплексное сравнительное изучение нескольких иерархических уровней (си-наптический, нейронный, модульный, мультимодульный) структурно-функциональной организации различных отделов поврежденного головного мозга. К сожалению, подобных работ очень мало, и акцент в них делается на решение узкоспециализированных проблем, а общие закономерно-
сти изменения структурной основы деятельности головного мозга после различных патологических воздействий остаются малоизученными. Это не позволяет понять закономерности реализации деструктивных и компенсаторно-восстановительных процессов в головном мозге при различных ги-поксических, ишемических, токсических, травматических повреждениях и связать их с конкретными психоневрологическими проявлениями энцефалопатии соответствующего генеза.
С другой стороны, мало изучены специфические особенности проявления деструктивных и компенсаторно-восстановительных процессов в различных нейромедиаторных системах головного мозга. Нет сравнительных исследований реакции на повреждение различных отделов этих систем. И это, несмотря на то, что уже давно определены основные приоритеты функции различных нейромедиаторных систем (Оленев С.Н., 1987; Шеперд Г., 1987; Хухо Ф., 1990; Ашмарин И.П., Стукалов П.В., 1996). В этой связи особый интерес вызывает изучение последствий интоксикации фенотиазиновыми нейролептиками, в результате которой происходит селективное повреждение нейронов дофаминергической системы, играющей значительную роль в регуляции высших функций мозга и развитии таких заболеваний как шизофрения (Оленев С.Н., 1987; Risch S.C., 1996; Black J.E. et al., 2004; Jang H.O. et al., 2004).
Исследование головного мозга при интоксикации фенотиазиновыми нейролептиками имеет также практическое значение. Так, в общей структуре лекарственных отравлений данные препараты занимают одно из первых мест, а летальность при их применении достигает 9-10% (Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000; Лужников Е.А. и др., 1999, 2002; Маркова И.В., 1998).
Несмотря на всё вышесказанное, закономерности реализации деструктивных и компенсаторно-восстановительных процессов в различных отделах дофаминергической системы головного мозга после острой ами-назиновой интоксикации изучены недостаточно полно. Кроме того, нет сравнительных данных по изучению особенностей этих процессов в отде-
лах мозга, принадлежащих и не принадлежащих к дофаминергической системе.
Цель исследования. Выявить закономерности реорганизации нейронных популяций в различных отделах дофаминергической системы и гиппокампа головного мозга белых крыс после острой интоксикации аминазином и обосновать возможность их целенаправленной коррекции мил-дронатом.
Задачи исследования:
1. Изучить особенности деструктивных и компенсаторно-
восстановительных процессов в нейронах префронтальной коры, черной
субстанции, хвостатого ядра и гиппокампа головного мозга белых крыс
после воздействия токсической дозы аминазина.
Способы защиты головного мозга
При острых отравлениях нейролептиками патогенетически обоснованным является применение различных средств детоксикации организма для максимального уменьшения их концентрации в крови и степени связывания тканями, что снижает летальность на 7-30% (Лужников Е.А., Кас-томарова Л.Г., 2000).
Имеются данные о том, что использование афферентной терапии сопровождается ускоренным удалением фенотиазинов, молекул средней массы и устраняет дисбаланс про- и антиоксидантной систем (Гольдфарб Ю.С. и др., 1998; Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000).
В ряде случаев эффективная гемоциркуляция при отравлении фено-тиазиновыми нейролептиками достигается при использовании серотонина адипината (Ильяшенко К.К. и др., 1998), кофеина, эфедрина, катехолами-нов (Богоявленский В.Ф., Богоявленский И.Ф., 1999; Лужников Е.А., 1999; Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000).
Кроме лечебного комплекса, направленного на удаление токсина из организма, антидотной терапии, средств, коррегирующих гемодинамику и дыхание, необходимы препараты, действие которых патогенетически направлено на коррекцию механизмов ишемического и гипоксического повреждения клеток организма. Одним из перспективных направлений защиты мозга при отравлениях нейролептиками может быть использование милдроната, кардиопротекторное действие которого уже доказано (Яци-нюкБ.Б., 2003).
Милдронат (дигидрат 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат) ока зывает коррегирующее воздействие на карнитинзависимый метаболизм жирных кислот в условиях ишемии и адренергических повреждений (Симхович Б.З., 1988; Калвинып И.Я., 2002). Механизм действия милдро ната заключается в ингибировании фермента у бутиробетаингидроксилазы, который катализирует последнюю стадию биосинтеза карнитина из у-бутиробетаина в печени, почках и семенниках. По данным литературы, милдронат вызывает уменьшение свободного кар нитина в печени и сердце (Приедина И.А., Шутенко Ж.В., 1989; Молодчи на Т.Н., Шутенко Ж.В., 1989), способствует переходу клеток на более эко номный режим функционирования, благодаря улучшению кровотока, со хранению АТФ и нормализации кальциевого обмена (Ратунова Т.М. и др., 1989).
Поскольку, при остром отравлении аминазином имеются условия (накопление аминазина на мембранах митохондрий, снижение АД, гипоксия, ацидоз, увеличение свободных жирных кислот) для активации меха низмов ишемического повреждения (некроз, апоптоз) высокочувствительных клеток всех основных систем организма, то следует ожидать эффективного использования милдроната в условиях острого отравления этим препаратом.
В литературе преобладают данные, подтверждающие кардиопротек-тивное действие милдроната. Так, в работе Т.М.Ратуновой и др. (1989) курсовое применение милдроната перед экспериментальной окклюзией коронарной артерии у крыс предотвращало снижение АТФ на 35-37%. Милдронат способствовал также сохранению АТФ и креатинфосфата в условиях адренергических воздействий. При этом в сердце отмечались лишь незначительные ишемические изменения (Симхович Б.З., 1988).
Милдронат в дозе 50-100 мг/кг защищает сократительную функцию миокарда при воздействии ишемии и аноксии. Курсовое применение милдроната в значительной мере предохраняет сердце от нарушения метаболизма кальция в условиях иммобилизационного стресса, на 42% снижает вызываемое адреналином повышение в сыворотке крови активности креа-тинфосфокиназы и на 85% - лактатдегидрогеназы (Симхович Б.З., 1988; БриедеЯ.Л., 1989).
Выявлена способность милдроната стимулировать карнитиннезави-симый метаболизм жирных кислот и активизировать метаболизм глюкозы (Шутенко Ж.В., 1988; Симхович Б.З., 1988). Это может компенсировать недостаток энергии, вызванный выключением карнитинзависимого метаболизма жирных кислот.
В работе Б.Б.Яцинюка (2003) показано, что профилактическое и лечебное применение милдроната в условиях острого отравления аминазином оказывало кардиопротекторный эффект. Под влиянием милдроната улучшался энергетический обмен в миокарде, предотвращалось накопление свободных жирных кислот, и уменьшались процессы перекисного окисления липидов, повышалась эффективность использования глюкозы, и уменьшалась проницаемость кардиомиоцитов.
Материал исследования
Анализ на нормальность распределения (критерий Колмогорова-Смирнова) и дисперсионный анализ материала (отличное от нормального распределение, различие дисперсий), а также небольшое количество выборок показали целесообразность использования непараметрической ранговой статистики. Поэтому, различия между независимыми выборками определяли с помощью рангового дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса и критерия Колмогорова-Смирнова. Для категориальных пере-менных применяли Хи-квадрат (% ) и точный критерий Фишера. Материал в таблицах представлен как среднее ± стандартное отклонение, а на графиках - как медиана, верхний и нижний квартиль (Гланц С, 1998).
Вычисление верхней и нижней границ 95% доверительных интервалов для относительных частот признака проводили по формуле: P±tx(sjP(\-P)/n+\/2n), где Р - относительная частота событий, выраженная десятичной дробью, п — общее число объектов исследования в выборке, t — значение t-критерия, соответствующее объему исследуемой выборки, 1/2п - поправка на непрерывность (Реброва О.Ю., 2002).
В настоящей работе на основании морфометрического изучения нейронных популяций различных отделов головного мозга и синапсов пре-фронтальной коры большого мозга белых крыс группы I (интоксикация аминазином без использования милдроната) и II (интоксикация аминазином с последующим использованием милдроната) планируется проверить следующие основные статистические гипотезы: 1) интоксикация аминазином не влияет (нулевая гипотеза №1) и влияет (альтернативная гипотеза №1) на структурно-функциональное состояние изученных отделов мозга; 2) аминазин одинаково (нулевая гипотеза №2) и по-разному (альтернативная гипотеза №2) влияет на структурно-функциональное состояние изученных отделов мозга; 3) милдронат не изменяет (нулевая гипотеза №3) и изменяет (альтернативная гипотеза №3) закономерности развития патологических и саногенетических механизмов в изученных отделах головного мозга. Статистические гипотезы № 1 и №2 будут проверены при сравнении различных отделов головного мозга животных группы I, а гипотезы №3 — при сравнении указанных отделов головного мозга животных группы I и II в динамике наблюдения (1 час — 45 суток). Необходимое количество измерений в каждом конкретном случае для проверки статистических гипотез определяли с помощью соответствующего инструмента (Power Analysis) в "Statistica 6.0".
Для сопоставления структурно-функционального состояния изученных отделов мозга и функционирования центральной нервной системы в целом проведен сравнительный анализ психоневрологического статуса экспериментальных животных в трех вышеназванных группах исследования.
Все эксперименты и исследования выполнены на базе Омской государственной медицинской академии (ЦНИЛ, кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии) и частично в лаборатории ультраструктуры и пато-морфологии института молекулярной биологии научного центра "Вектор" МЗ РФ (зав. лабораторией доктор биологических наук Е.И.Рябчикова). Статистический анализ осуществлен при консультативном участии доктора медицинских наук С.С.Степанова.
В процессе обзорного свето- и электронномикроскопического анализа при аминазиновой интоксикации во всех отделах дофаминергической системы и гиппокампа головного мозга экспериментальных животных (группа I) были выявлены: 1) неравномерность кровенаполнения сосудов (полное спадение просвета одних и переполнение кровью других); 2) отек стенок сосудов; 3) разрыхление и разволокнение базальной мембраны; 4) сочетание гиперхромии и уплощения с просветлением и набуханием ядер эндотелиальных клеток; 5) вакуолизация цитоплазмы и слущивание эндо-телиальных клеток. Эти изменения микрососудов сопровождались перива-скулярным отеком астроглии. Гемокоагуляционные расстройства проявлялись частичной и полной окклюзией микроциркуляторного русла агрегатами эритроцитов, тромбоцитов, образующих микротромбы, и слущен-ным эндотелием.
Максимально эти изменения развивались через 1-7 суток после введения аминазина. В более отдаленном периоде (через 14, 30, 45 суток) у 26% (критерий х =6,5, df=l, /?=0,045) животных группы I отмечалось восстановление структурной организации микрососудов. У остальных 74% (критерий х —7,13, df=l,p=0,01) животных этой группы к вышеназванным изменениям присоединялись периваскулярные кровоизлияния, плазморра-гия, мукоидное и фибриноидное набухание стенки более крупных сосудов. Все это свидетельствовало о значительной степени повреждения гемато-энцефалического барьера и появлении вторичных нарушений кровообращения при аминазиновой интоксикации у животных без фармакологической коррекции.
Черная субстанция
Этот отдел головного мозга контрольных белых крыс характеризуется значительно меньшей плотностью нейронов (22,5±2,4 на 0,001 мм3), чем в префронтальной коре (на 0,001 мм 74,1+5,3 - мелкоклеточные слои II-III, 45,0±4,3 - крупноклеточный слой V). В черной субстанции контрольных животных преобладали нормохромные нейроны.
Отравление аминазином приводит к существенным изменениям всех изученных показателей, характеризующих нейронную популяцию этого отдела мозга. По данным дисперсионного анализа, в течение 45 суток эксперимента (без учета контроля) наиболее значительные изменения были характерны для нормохромных нейронов (табл. 6).
Численная плотность различных типов реактивно измененных нейронов и общая численная плотность нейронов черной субстанции показаны в таблице 7. Общая численная плотность нейронов статистически значимо уменьшалась (на 13,8%, /? 0,05) в черной субстанции через 3 суток после начала эксперимента, затем этот показатель прогрессивно уменьшался и в конце наблюдения (45 суток) дефицит нейронов достигал 28,0% (р 0,001).
В сравнении с контролем через 1 сутки после введения аминазина содержание нормохромных нейронов уменьшалось на 59,0% (рассчитано в процессе анализа 100 клеток). При этом содержание гипохромных нейронов без повреждения ядра и цитоплазмы увеличивалось на 16%, клеток-теней - на 13%, гиперхромных несморщенных нейронов — на 21% и ги-перхромных сморщенных - 9% (табл. 8).
Через 3 суток, в сравнении с предыдущим сроком, на 8% уменьшалось содержание клеток-теней, все остальные показатели статистически значимо не изменялись (табл. 8).
Через 7 суток, в сравнении с предыдущим сроком, на 19% уменьшалось содержание гиперхромных несморщенных нейронов, и на 12% увеличивалось содержание гиперхромных сморщенных нейронов (табл. 8).
Через 30 суток содержание гиперхромных несморщенных нейронов увеличивалось до уровня 3 суток, а содержание остальных показателей статистически значимо не изменялось (табл. 8).
В конце эксперимента существенно увеличивалось содержание нор-мохромных нейронов, и уменьшалось содержание клеток-теней, в сравнении с предыдущим сроком. Однако, уровня контроля показатели нейронной популяции черной субстанции, как и других отделов головного мозга, не достигали. Сохранялось значительное количество реактивно измененных нейронов. При этом, содержание необратимо измененных нейронов в конце эксперимента было на уровне 23%, как и в первые трое суток. Максимальное содержание необратимо измененных нейронов (39%) отмечалось через 7 суток и сохранялось на этом уровне через 30 суток после введения аминазина (табл. 8). Все это свидетельствует о длительном сохранении повреждающих факторов в головном мозге при аминазиновой интоксикации.
Таким образом, при отравлении аминазином черная субстанция является чувствительным отделом головного мозга белых крыс. Общая численная плотность в этом отделе мозга в течение всего периода наблюдения уменьшается на 28%, а содержание необратимо измененных нейронов даже через 45 суток после введения аминазина остается очень высоким (23%). Следовательно, полученные результаты отвергают нулевую гипотезу №1 и по характеру изменений нейронной популяции черной субстанции.
Общая численная плотность нейронов в хвостатом ядре контрольных животных была на уровне этого показателя в черной субстанции (27,6±1,8 на 0,001 мм3), преобладали нормохромные нейроны.
По данным дисперсионного анализа, после отравления аминазином в течение 45 суток (без учета контроля) изменялись все показатели, кроме содержания клеток-теней, а наиболее значительные изменения были характерны для нормохромных и гиперхромных сморщенных нейронов (табл. 9).
Численная плотность различных типов реактивно измененных нейронов и общая численная плотность нейронов хвостатого ядра головного мозга белых крыс показаны в таблице 10. Общая численная плотность нейронов статистически значимо уменьшалась (на 12,0%, р 0,05) через 3 суток после начала эксперимента, затем этот показатель прогрессивно уменьшался, и в конце наблюдения (45 суток) дефицит нейронов составил 21,0% 0? 0,001) (табл. 10).
В сравнении с контролем, через 1 сутки после введения аминазина содержание нормохромных нейронов уменьшалось на 50,0% (рассчитано при подсчете 100 клеток). Содержание гипохромных нейронов без повреждения ядра и цитоплазмы увеличивалось на 8%, клеток-теней — на 6%, гиперхромных несморщенных нейронов - на 17% и гиперхромных сморщенных — на 10% (табл. 11).
Через 3 суток, в сравнении с предыдущим сроком, на 15% увеличилось содержание гиперхромных сморщенных нейронов, все остальные показатели статистически значимо не изменялись (табл. 11).
Через 7 суток, в сравнении с предыдущим сроком (3 суток), статистически значимых изменений при р 0,05 выявлено не было (табл. 11). Через 30 суток изученные показатели также статистически значимо не изменялись (табл. 11).
В конце эксперимента существенно (на 19% в сравнении с 30-ми сутками) увеличивалось содержание нормохромных нейронов, и на 12% уменьшалось содержание гиперхромных несморщенных нейронов. Однако, уровня контроля показатели нейронной популяции хвостатого ядра, как и других отделов головного мозга, не достигали. Сохранялось значительное количество реактивно измененных нейронов. При этом, содержание необратимо измененных нейронов (клетки-тени и сморщенные нейроны) в конце эксперимента было - 24%, примерно на уровне первых суток.
Максимальное содержание необратимо измененных нейронов (30-31%) отмечалось через 3 и 7 суток после введения аминазина (табл. 11). Все это свидетельствует о значительной длительности реорганизации нейронной популяции хвостатого ядра, как и других отделов дофаминергиче-ской системы головного мозга после аминазиновой интоксикации.
Черная субстанция и хвостатое ядро
При парном сравнительном анализе по срокам (критерий Колмогорова-Смирнова для независимых выборок) выявлено, что максимальные различия характерны для показателей, отражающих реактивное состояние нейронов (табл. 26-31). Показатели центральной тенденции (средние) общей численной плотности нейронов незначительно различались через 1, 30 и 45 суток после введения аминазина. Это свидетельствует о том, что найденные при дисперсионном анализе статистически значимые различия в большей степени касаются степени вариации показателя в группе I и II. Тем не менее, нулевая гипотеза №3 о том, что милдронат не влияет на характер изменения нейронов префронтальной коры отвергается, и принимается альтернативная гипотеза, как по группам в целом (MANOVA), так и по отдельным срокам исследования (критерий Колмогорова-Смирнова).
У животных группы II (милдронат) в слоях верхнего этажа префронтальной коры (И-Ш) абсолютное содержание нормохромных нейронов было статистически значимо выше через 1, 3, 30 и 45 суток после введения аминазина, в слое V - в течение всего периода наблюдения (45 суток). Содержание гипохромных неповрежденных нейронов в слое V префронтальной коры было выше у животных группы II в течение 7 суток, а затем — ниже, чем в группе I. В слоях П-Ш коры этот показатель был ниже у животных группы II через 45 суток (табл. 27). Численная плотность клеток-теней была меньше в слое V префронтальной коры животных группы II, начиная с третьих суток и до конца эксперимента, а в слоях И-Ш коры — через 3, 30 и 45 суток (табл. 28).
Гиперхромных несморщенных и сморщенных нейронов в префронтальной коре животных группы II было также меньше, начиная с 3 суток эксперимента (табл. 29-30). Все это свидетельствовало о снижении интенсивности процесса некротического повреждения нейронов префронтальной коры при использовании милдроната преимущественно через 3 суток.
При использовании милдроната через 3 суток (период максимальной деструкции синапсов по светлому типу) после введения аминазина содержание деструктивно изменных терминален на 14,2% ниже (критерий Колмогорова-Смирнова, /? 0,01), а общая численная плотность синапсов (суммарно по всем срокам) на 12,5% (/? 0,01) выше, чем у животных без милдроната.
Таким образом, использование милдроната после острого отравления аминазином уменьшало содержание реактивно измененных нейронов и синапсов, способствовало сохранению общей численной плотности нейронов и межнейронных контактов префронтальной коры. В полной степени положительное влияние препарата на нейроны префронтальной коры начинало проявляться через 3 суток после начала лечения, когда абсолютное содержание необратимо измененных нейронов в группе II было ниже, чем в группе I и в верхнем, и в нижнем этажах префронтальной коры. В более отдаленном периоде (7-45 суток) эффект милдроната был несколько выше в слое V. Все это отвергает нулевую гипотезу №3 об отсутствии влияния милдроната на кору большого мозга и подтверждает наличие положительного нейропротекторного эффекта препарата. Однако, необходимо отметить, что данный препарат полностью не останавливает патологический процесс в префронтальной коре. Об этом свидетельствует высокое абсолютное и относительное содержание реактивно измененных нейронов на протяжении всего периода лечения препаратом и незначительное влияние на общую численную плотность нейронов префронтальной коры. Различия между группами I и II по общей численной плотности нейронов удалось выявить через 1, 30 и 45 суток в слоях П-Ш и V коры.
По данным многофакторного дисперсионного анализа использование милдроната в течение 7 суток после отравления аминазином оказывало влияние также на динамику всех изученных показателей, характеризующих нейронную популяцию черной субстанции и хвостатого ядра. В большей степени воздействие препарата проявляется в черной субстанции (выше уровень различий «р») (табл. 32).
Парный сравнительный анализ показал наличие статистически значимых различий по всем показателям, характеризующим реактивные изменения нейронов, и общей численной плотности нейронов данных отделов мозга (табл. 33-38). В черной субстанции животных группы II показатели центральной тенденции (средние) общей численной плотности нейронов, статистически значимо отличались от таковых группы I через 3-45 суток, а в хвостатом ядре — только через 30 и 45 суток после начала лечения милдронатом. Следовательно, найденные различия между группой I и II отвергают нулевую гипотезу №3 для данных отделов мозга — милдронат влияет на нейронные популяции черной субстанции и хвостатого ядра, хотя и в разной степени.
