Содержание к диссертации
Введение
1. Вирус иммунодефицита человека первого типа 12
1.1. Строение вириона. Жизненный цикл вирус 12
1.2. Анти-ВИЧ иммунный ответ 14
1.2.1. Гуморальный иммунитет 14
1.2.2. Клеточный иммунитет 16
1.2.3. Мукозальный иммунитет 17
2. Вакцины против ВИЧ/СПИД 19
2.1. Вакцины на основе аттенуированных вирусов 19
2.2. Субъединичные вакцины 20
2.3. Полиэпитопные иммуногены в качестве кандидатных ВИЧ-1 иммуиогенов 21
2.4. ДНК-вакцины 27
3. Способы доставки вакцинных препаратов 31
3.1. Микросферы 31
3.2. Вакцины на основе рекомбианантных вирусных векторов 33
3.3. Аттеиуированные штаммы сальмонелл в качестве системы доставки антигенов 34
2. Материалы и методы 41
2.1. Реактивы 41
2.2. Ферменты 41
2.3. Плазмиды 41
2.4. Бактерии 42
2.5. Культуральные и питательные среды 42
2.6. Вирусы 42
2.7. Растворы 43
2.8. Методы
2.8.1. Трансформация клеток Е.соїі плазмидной ДНК 43
2.8.2. Трансформация клеток сальмонеллы плазмидной ДНК 43
2.8.3. Выделение плазмидной ДНК 44
2.8.4. Ферментативный гидролиз ДНК 45
2.8.5. Электрофоретическое фракционирование ДНК 45
2.8.6. Элюция фрагментов ДНК из ПААГ 45
2.8.7. Конструирование рекомбинантных ДНК 46
2.8.8. Электрофоретический анализ белка 46
2.8.9. Иммуноблотинг белков с иммунными сыворотками 46
2.8.10. Иммунизация лабораторных животных 47
2.8.11. Определение ЛД5о аттенуированных штаммов сальмонеллы при перректальном введении 48
2.8.12. Исследование антигенной структуры сальмонелл 48
2.8.13. Исследование персистенции сальмонелл в органах лабраторных животных 48
2.8.14. Иммуноферментньтй анализ 49
2.8.15. Реакция бласттрансформации 49
2.8.16. Определение специфических IFN-y-продуцирующих клеток в реакции ELISPOT 50
2.8.17. Реакция вирусной нейтрализации 50
З.Результаты и обсуждение 53
3.1. Использование вирусоподобных частиц для доставки искуствеиного белка TBI 54
3.1.1. Получение гибридного белка GST-TBI и анализ его антигенных свойств 55
3.1.2. Получение вирусоподобной конструкции каидидатной вакцины 57
3.1.3. Конструирование ВПЧ. несущих ДНК вакцину pcDNA-TBI 61
3.2. Иммуиогенность экспериментальных вакцин 65
3.2.1. Схема проведения эксперимента 65
3.2.2. Оценка гуморального иммунного ответа 66
3.2.3. Вируснейтрализующая активность сывороток иммунизированных животных 70
3.2.4. Клеточный иммунный ответ при введении экспериментальных вакцин 73
3.3. Использование аттенуированных штаммов сальмонелл в качестве системы доставки искусственного белка TBI 75
3.3.1. Характеристика аттенуированиых штаммов сальмонелл 76
3.3.2. Получение рекомбинантных штаммов сальмонеллы и исследование продукции белка TBI 76
3.3.3. Исследование биохимических и антигенных свойств аттепуированных штаммов сальмонелл 78
3.3.4. Оценка стабильности плазмидных конструкций в клетках сальмонеллы 79
3.3.5 Определение ЛД;() аттенуированиых штаммов сальмонеллы при ректальном введении 79
3.4. Иммуиогениые свойства вакцинных штаммов сальмонеллы 80
3.4.1. Клеточный иммунный ответ при введении рекомбинантных штаммов сальмонелл 81
3.4.2 Гуморальный иммунный ответ 84
3.5. Изучение антигенных и иммуногенных свойств полиэпитопного белка TCI 89
3.5.1. Антигенные свойства белка ТСТ 91
3.5.2. Иммуногенные свойства белка ТСТ 91
3.5.2.1. Клеточный иммунный ответ 92
3.5.2.2. Исследование гуморального иммунного ответа 100
3.5.2.3. Вируснейтрализующая активность сывороток иммунизированных животных 102
Заключение 105
- Анти-ВИЧ иммунный ответ
- Плазмиды
- Иммуиогенность экспериментальных вакцин
- Иммуиогениые свойства вакцинных штаммов сальмонеллы
Введение к работе
Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), вызываемый вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), стал известен более 20 лет назад. На сегодняшний день СПИД является одним из наиболее серьезных инфекционных заболеваний, занимая четвертое место по количеству смертельных исходов. Главная опасность ВИЧ-инфекции, определяющая ее социальное значение -практически неизбежная гибель инфицированных в среднем через 10 лет после заражения. Начавшаяся в конце 70-ых годов эпидемия ВИЧ-инфекции, по оценочным данным Всемирной Организации Здравоохранения, к настоящему времени унесла жизни 14 мли. жителей Земли. Еще 40,3 млн. человек к концу 2005 года были инфицированы ВИЧ. Важно отметить, что Россия занимает одно из лидирующих мест по темпам роста инфицирования.
Ведущий фактор, обеспечивающий биологическое «процветание» ВЙЧ -инфекции - многолетнее малосимптомное носительство вируса. В силу этого обстоятельства ВИЧ инфицированный человек в течение многих лет остаегся источником распространения инфекции (чаще всего нераспознанным).
Учитывая стремительное распространение эпидемии СПИДа как во всем мире, так и в России, задача создания вакцины против ВИЧ-инфекции имеет чрезвычайно актуальное значение. В разработке вакцины против ВИЧ-1 в последние годы были использованы различные формы вирусного антигена, включая инактивированный вирус, модифицированный вирус, аттенуированный вирус, нативные и генноинженерные белки, синтетические пептиды, а также различные способы представления целевого иммуногена иммунной системе макроорганизма [Spearman Р. 2006, Burgers W.A. et al. 2006, Young K.R. et al. 2006]. Однако проблема создания анти-ВИЧ вакцины до сих пор не решена. Можно выделить несколько факторов, которые сдерживают прогресс в разработке вакцины.
Во-первых, ВИЧ обладает высокой генетической изменчивостью, в результате чего он меняет свою антигенную структуру быстрее, чем исследователи успевают создать вариант вакцины.
Во-вторых, недостаточность наших знаний о биологии вируса. До сих пор идет дискуссия, какое звено иммунного ответа более важно для предотвращения инфекции: индукция антител или цитотоксических Т-лимфоцитов, или же обоих звеньев вместе. Отсутствуют знания о корелляции уровня иммунного ответа и степенью протекции от заражения.
В-трстьих, вирусные белки ВИЧ-1 содержат районы, которые обладают способностью ингибировать протективный иммунитет и индуцировать развитие иммунопатологии.
Наконец, для изучения патогенеза ВИЧ-инфекции фактически отсутствуют экспериментальные модели животных. Только шимпанзе могут быть инфицированы ВИЧ-1, однако, высокая стоимость экспериментов с участием этих животных и различия в патогенезе заболевания затрудняет их широкое использование. Все это, несомненно, тормозит создание эффективного профилактического препарата.
Несмотря на перечисленные проблемы, исследования по созданию вакцины против ВИЧ-инфекции должны быть продолжены, потому что нет другого пути блокировать, или по крайне мере ослабить быстрое распространение СПИДА. В настоящее время наблюдается растущий оптимизм среди ученых, которые считают, что создание эффективной и безопасной ваюдины является вполне осуществимой задачей [McMichael and Hanke Т. 1999, Nelson R. 2003, Matano Т. et al 2004J. Несомненно, что для решения задачи весьма важным направлением исследований является разработка новых подходов к конструированию ВИЧ иммуногенов и систем их доставки.
Весьма перспективное направление в создании новой генерации эффективных и безопасных вакцин основано на идентификации в вирусных белках Т- и В-клеточных эпитопов и конструирование на их основе синтетических полиэпитопных вакцин. Такие вакцины должны быть свободны от недостатков, которые свойственны вакцинам, создаваемым на основе аттенуированного или инактивированного вирусов или же на основе нативных и рекомбинантных вирусных белков. В частности они не будут содержать нежелательных эпитопов, которые индуцируют иммунопатологию или ингибируют протективный иммунитет.
В ГНЦ ВБ «Вектор» данный подход использовался при конструировании четырех-а-спирального искусственного белка TBI (Т and В cell epitopes containing immunogen), кандидата молекулярной полиэпитопной вакцины lEroshkin A.M. et al. 1995]. Белок содержит четыре Т-клеточных эпитоиа и пять В-клеточных нейтрализующих эпитопа из белков Env и Gag ВИЧ-1. У мышей, иммунизированных белком TBI, формировался как гуморальный, так и клеточный ответ к ВИЧ-1. Анти» TBI-антитела обладали ВИЧ-нейтрализующей активностью [Eroshkin A.M. et al. 1995]. Основной недостаток белка TBI заключается в том, что он обладает относительно небольшой молекулярной массой и для индукции эффективного иммунного ответа требует использования адъюванта.
Для стимуляции ВИЧ-специфического цитотоксического ответа был проведен дизайн другого искусственного белка - поли-ЦТЛ-эпитош-юго Т-клеточного иммуногепа (TCI, Т cell immunogen), состоящего из 392 аминокислотных остатков и содержащего около 80 оптимально отобранных ЦТЛ-эпитопов. В состав TCI были включены эпитопы, которые индуцируют как CD81" ЦТЛ, так CD4+ Тх и включают последовательности из основных вирусных белков Env, Gag, Pol и Nef [Bazhan S.I., 2004]. Доставку ЦТЛ-иммуногенов целесообразно проводить с использованием ДНК вакцин, поскольку именно при использовании генной вакцинации происходит эффективная индукция клеточного ответа [Donnelly J.J. 1997] Для этой цели ген TCI был клонирован в составе плазмиды pcDNA 3.1. Известно, что иммунизация голой ДНК ваіщиной стимулирует очень слабый иммунный ответ, поэтому во всем мире проводятся интенсивные исследования по повышению эффективности ДНК вакцинации. Прежде всего, эти исследования направлены на разработку схем вакцинации и систем доставки вакцины.
Была разработана оригинальная система доставки ДНК вакцин с использованием искусственных вирусоподобных частиц (ВПЧ) [Лебедев Л.Р. и др. 2000]. Это могло бы позволить решить проблему сохранения ДНК до того момента, как ВПЧ будет поглощена антигенпрезентирующими клетками и, таким образом, уменьшить эффективную дозу вакцины [Karpenko L.I. et al. 2003].
Другим перспективным способом представления ДНК вакцин иммунокомпетентпым клеткам могут быть аттеиуированные штаммы сальмонелл [Schoen С. el al. 2004, Du A. et al. 2005, Haga Т. et al. 2006]. Преимущество доставки ДНК вакцин с помощью сальмонелл заключается, во-первых, в непарентеральном способе введения, а во-вторых, в том, что помимо системного гуморального и клеточного ответов активируется специфический мукозальный иммунитет, создающий на слизистых барьер для проникновения вируса в организм. Значимость мукозального иммунитета особенно высока для инфекций, передающихся через слизистые оболочки, именно к таким инфекциям и относится СПИД.
Цель работы заключалась в разработке средств доставки полиэпитопных иммуногенов TBJ и TCI и исследование их свойств. Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:
Получить и исследовать иммуногенные свойства искусственных вирусоподобных частиц (ВПЧ), экспонирующих на своей поверхности рекомбинантный белок GST-TBL
На основе аттенуированных штаммов сальмонелл получить рекомбинантные штаммы, продуцирующие белок TBI. Оценить стабильность плазмиды pGEX-TBI в клетках сальмонелл. Исследовать иммуногенные свойства рекомбинантных сальмонелл, включая мукозальный ответ.
Сконструировать ДНК вакцину, обеспечивающую синтез белка TBI в эукариотических клетках. Исследовать ее иммуногенность в составе ВПЧ и аттенуированных штаммов сальмонелл.
Получить ВПЧ и аттенуированные штаммы сальмонелл, несущие ДНК вакцину pcDNA-TCI. Изучить иммуногенные свойства полученных конструкций.
Анти-ВИЧ иммунный ответ
Антитела является важным компонентом защиты против вирусных инфекций и особенно важны в ограничении распространения вирусов вне клетки. Первичный контроль репликации ВИЧ-1 осуществляется именно за счет действия нейтрализующих антител [Albert J. et al. 1990.]. Наиболее выраженный гуморальный ответ наблюдаегся против Env (gp 120 и gp41) и Gag (р24 и р].7) белков. Основным механизмом, с помощью которого осуществляется нейтрализация вируса, является ингибирование антителами прикрепления вириона к клетке-мишени. Для прикрепления вируса к клетке-мишени необходим многосторонний коні акг в определенной области. Связывание антител с вирусной поверхностью делает невозможным прикрепление вируса к клетке. Дополнительными механизмами нейтрализации является индукция конформационных изменений в gpl20, приводящая к диссоциации gp 120 и gp41 [Yahi N. et al. 1994] Основные нейтрализующие эпитопы обнаружены в поверхностных белках вируса. При изучении нейтрализации культуралы-юго вируса сыворотками ВИЧ-инфицированных и иммунизированных gpl20 людей было показано, что третья вариабельная петля (V3) gpl20 является основным нейтрализующим доменом гликопротена [Javaherian К. et al. 1989]. В составе белков оболочки было выявлено три основных нейтрализующих эпитопа: два - конформационных расположены па gpl20, третий находится на gp41 и имеет линейное строение [Chanh Т.С. et а]. 1986]. Не было выявлено закономерностей между нейтрализующими серотипами, генетическими субтипами и биологическими свойствами (тропностыо) вируса [Moore J.P. et al. 2001,] Так, при изучении нейтрализующей активности сывороток крови людей, инфицированных вирусами, относящихся к субтипу А, В, С, D Б тесте нейтрализации, оказалось, что все они нейтрализуют вирус, относящийся к субтипу В. При этом, были нейтрализованы как тропные к макрофагам, так и Т-тропные штаммы вируса [Weber J. et al. 2001.]. Ряд опытов in vitro показал, что некоторые антитела, не имеющие специфической активности против вирусных белков, так же могут нейтрализовать вирус. Большинство из них направлены на белки клеточной мембраны, такие как ICAM-1 (CD54), LFA-1 (CDlla/CD18), HLA-DR, МНС1 [Rizzuto С. D. et al. 2000.].
Другой мишенью для антител могут быть регуляторные белки, например, tat, высвобождение которого из инфицированных клеток приводит к активации репликации вируса в соседних клетках [Frankel A. D. et al. 1988.]. Оказалось, что антитела против tat ингибировали ВИЧ-1 НТВ in vitro и их наличие коррелировало с отсутствием развития СПИДа in vivo [Zagury J. F. 1998.]. Помимо нейтрализации, антитела принимают участие в другом механизме борьбы с вирусом - антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) [Rowland-Jones S. 1997.]. Данный механизм основан па том, что антитела связываются с белками вируса на поверхности инфицированной клетки (клетка-мишень), что индуцирует связывание Fc фрагмента IgG со специфическим Fc-рецептором (CD16) на лейкоцитах, обладающих способностью к АЗКЦ. Связывание активирует высвобождение медиаторов лизиса эффекторной клеткой, что приводит к лизису клетки-мишени. [Forthal D.N. et al. 2001a.]. Было показано, что уровень АЗКЦ обратно коррелирует с уровнем вирусной нагрузки [Forthal D.N. et al. 2001b.]. Другой способ защиты обусловлен тем, что натуральные киллеры (НК) при стимуляции их Fc рецептора выделяют хемокины, которые в свою очередь блокируют корецепторы ВИЧ, лигандами для которых они являются [Неепеу J,L. et al. 1998.]. Таким образом, эффективность гуморального иммунного ответа в ограничении распространения вируса in vivo определяется как минимум тремя факторами: чувствительностью вирусного изолята к нейтрализации, репертуаром вырабатываемых антител и временным отрезком, в течение которого синтезируются эти антитела. Помимо гуморального ответа ВИЧ активирует и клеточное звено иммунитета. Важным звеном в контролировании размножения и распространения вируса в организме являются CD8+ цитотоксичские лимфоциты (ЦТЛ) [Letvin N.L. 1998.]. Они распознают на поверхности инфицированной клетки эпитопы вирусных белков размером 8-11 аминокислотных остатков в ассоциации с молекулами главного комплекса гистосовместимости первого типа (МНС-1) [Townsend A. Bodmer Н. 1989.]. Распознавание комплекса МНС-1 и вирусного пептида происходит Т-клеточным рецептором (ТКР) совместно с CD8 корецептором, что приводит к функциональной акгивации ЦТЛ [Wange R. and Samelson L. 1996, Weiss Л. and Littman D. 1994, Purbhoo M. et al. 1998.]. Репликация ВИЧ-1 в CD4+ Т-іоіетках может быть ингибирована присутствующими в орі анизме инфицированного CD8+ клетками [Walker СМ. et al. 1986.] через механизмы, которые включают в себя лизис клетки и высвобождение хемокинов (напр. МІР-1а, МТР-1В, RA.NTES), а также и цитокинов. Количество вируса на ранней стадии ВИЧ-1 инфекции соответствует по времени наработке вирусспецифических ЦТЛ [Panteleo G. et al. 1994.]. У пациентов с хроническим течением болезни высокие значения ЦТЛ ответа коррелируют с низким вирусным уровнем и стабильным течением заболевания [Ogg G.S. et al. 1998.]. Важная роль CD8+ ЦТЛ была подтверждена путем удаления в инфицированных ВИО обезьян вирус - специфических CD8+ клеток с помощью моноклоналы-шх антител., Было показано, что при этом у инфицированных ВИО обезьян происходило увеличение вирусной нагрузки, и развивалась иммуносупрессия [Schmitz J.E. et al. 1999, Jin X. et al. 1999.]. Несмотря на выраженный клеточный иммунитет, организму не удается избавиться от вируса. Предполагается, что клетки иммунной системы, ответственные за выполнение функций клеточного иммунитета (Т-хелперы и ЦТЛ), по-видимому, функционируют неадекватно [Brander С. and Walker B.D. 1999.] Это, прежде всего, связано с тем, что сами CD4+ являются клетками-мишенями для вируса, при этом вирус - специфические CD4+ Тх клетки подвергаются клональной делеции на ранних стадиях инфекции, т.к. именно они активируются в ответ па стимуляцию вирусом, что способствует их заражению. Этот процесс идет настолько быстро, что вирус-специфические клетки-памяти не успевают образоваться. Было также показано, что ВИЧ-специфические Т-клетки памяти содержат большее количество провирусной ДНК, по сравнению с другими клетками на всех стадиях болезни [Douek D.C. et al. 2002.]. Инфицированные клетки разрушаются за счет прямого цитопатического действия вируса и ЦТЛ [Cicala С. at al. 2000.].
Значительная часть CD4+ клеток погибает за счет апоптоза. Существуют и другие механизмы, с помощью которых вирусу удается избехсать давления иммунитета. Так. оболочечные белки вируса вызывают анергию CD4+ клеток. Все это приводит к тому, что ЦТЛ не получают дополнительной активации со стороны Тх клеток и не могут нормально функционировать. У инфицированных ВИЧ отмечено снижение уровня перфорина в ЦТЛ, что также отрицательно сказывается на уничтожении вируса. Кроме того, высокая генетическая изменчивость вируса предотвращает распознавание инфицированных клеток специфическими ЦТЛ. Мутации в геноме ведут к исчезновению имеющихся вирусных эпитопов, снижению связывания вирусных пептидов с МНС 1, неэффективному процессингу вирусных белков и пониженному распознаванию Т-клеточным рецептором инфицированных клеток [McMichael A.J. and Phillips R.E. 1997.]. Одним из примеров действия вирусных белков на клетки, является установленный факт повышения вирусным белком nef экспрессии FasL (CD95L), индуцирующих алоптоз ВИЧ-специфических ЦТЛ [Хи X. et al. 1999.]. nef также снижает экспрессию молекул МНС I на поверхности зараженной клетки, что затрудняет распознавание их НК клетками [Schwartz О. et al. 1996, Collins К. et al. 1998.1. Таким образом, клеточный иммунитет играет важную роль в ограничении развития ВИЧ в организме иифицироваииого. Именно наличие выраженного ответа со стороны Г лимфоцитов рассматривается в настоящее время как один из основных показателей эффективности кандидатных вакцин [Goulber P.J. et.al. 1999.]. 1.2.3. Мукозальный иммунитет Помимо системного иммунного ответа большое значение в предотвращении заражения и развития ВИЧ должна играть иммунная система слизистых оболочек (мукозальный иммунитет). На сегодняшний день установлено, что слизистая является основным местом проникновения вируса, по разным оценкам от 50 до 80% случаев инфицирования происходит именно этим путем [Dunn D. and Newwell M.L. 1992, Fowler M.G. 1997.].
Плазмиды
В работе использованы реактивы следующих фирм: "Sigma", США: ЭДТА, 2-меркаптоэтанол, агароза А9539, акриламид, метиленбисакриламид, глицин, MOPS (морфолинопропансульфоновая кислота), изопропил-ДО)-тиогалактопиранозид (IPTG), пунцовый С, белковые маркеры молекулярных весов, кумасси R-250, ТЕМЕД, коньгогаты антител с пероксидазои и щелочной фосфотазой, субстраты 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат, нитротетразолевый синий, АЕС, конканавалин A, Tween-20. тритон Х-100, адъювант Фрейнда "Amersham", нитроцеллюлозные фильтры Hybond-C "Serva", Германия: сахароза, бромистый этидий, бромфеноловый синий. ксиленцианол, SDS. "Fluka", Швейцария: дрожжевой экстракт, пептон. "Difco", США: тритон, бакто-агар. "Сибэнзим", г. Новосибирск, Р.Ф.: X-Gal, буферы для эндонуклеаз рестрикции (1(B), 2(G), 4(W), 5(У)). Все остальные реактивы были произведены в ВО "Реахим" и имели квалификацию "ос.ч", "чда" и "хч". "Изотоп", г. Санкт-Петербург, Р.Ф.: Т-1-тимидин. "Bioclot", Германия: Фетальная бычья сыворотка 2.2. ФЕРМЕНТЫ Эндонуклеазы рестрикции BamHl, Bglll, EcoRI, НаеШ, HindTIT, Kpnl, PstI, Pvull, Xhol, Xbal, Sail, ДНК-лигаза фага T4 были получены из ТОО "Сибэнзим", Новосибирск. 2.3. ПЛАЗМИДЫ pcDNA3.1 .(+)(Invitrogen) pGEX-2T- TBI (Лебедев Л.Р. и др. 2000) pcDNACI (Bazhan S.I. et al. 2004) pRS III (Eroshkin A.M. et al. 1995) 2.4. БАКТЕРИИ штаммы Escherichia coli из коллекции ГНЦ ВБ "Вектор" JM103 (lac-proAB), tln-l, strA, supE, endAl, hsdR, sbcB15, (F1, traD36, proAB, lacT Z M15). DH5cc(F\ () 80d/acZAM15, recAI, endAl, gyrA96, /AM, hsdR\7(vk\ mk ), supEAA, relA 1, deoR) A (ZacZYA-argF)U 169 Штамм Salmonella typhimurium SL 7207(2337-65 (=WRAY) hisG46 DEL407[aroA544::TnlO]) предоставлен Stocker В. (Стенфордский университет, США) Штамм Salmonella enteritidis E-23 (Дсуа, Л crp) предоставлен Бойченко М.Н. (Медицинская Академия им. Сеченова, г. Москва) 2.5. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ Среда LB. На 1л: Триптон Bacto - Юг, дрожжевой экстракт - 5г. NaCl - Юг. рН 7.2. Среда 2 YT. На 1л: Триптои Bacto - 16г, дрожжевой экстракт - Юг, NaCl - 5г. рН 7.2. Среда RPMT-1640 ( "Биолот",Саикт-Петербург, Россия) Среда DMEM ("Биолот", Санкт-Петербург, Россия) Дифференциальные микробиологические среды: среда Симонса, Клиглера ("НПО Питательные среды", Махачкала), ацетатный агар, среда Эндо ("ННШД ГИП", Москва). 2.6. ВИРУСЫ В работе были использованы 3 штамма вируса ВИЧ-1: 1) ВИЧ-1-899А (выделен в НИИ им. Д.И. Ивановского, г. Москва, депонент ГКВ 899) 2) ВИЧ-1 ГКВ 4046 (выделен в лаборатории ретровирусов ГНЦ ВБ "Вектор" НИИ молекулярной биологии, депонент 4046) 3) ВИЧ-1 ГКВ 4005 (выделен в лаборатории ретровирусов ГНЦ ВБ "Вектор" НИИ молекулярной биологии, депонент 4005) 2.7. РАСТВОРЫ ТЕ - 10 мМ трис-НСІ, рН 7.4, 1 мМ ЭДТА. ТБЕ - 0.089 М трис-борат рН 9.0, 0.089 М борная кислота. ТАЕ - 20 мМ ацетат натрия, 1 мМ ЭДТА, 40 мМ трис, рН 8.0 доводили ледяной уксусной кислотой. Трис-глициновый буфер - 25 мМ трис рН 8.3, 192 мМ глицин, 0.1 % SDS. Буфер (х 6) для нанесения проб ДІЖ на ГТААГ: 0.25 % бромфеноловый синий, 0,25% ксиленцианол, 30 % глицерин. PBS - 5,84г NaCl, 4,72г Na2HP04, 2,64 г NaH2PO«x 2Н20, рН 7,2 - на 1 л. 2.8. МЕТОДЫ. 2.8.1. ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК Е.соїі ПЛАЗМИДНОЙ ДНК Трансформацию проводили по стандартному методу [Маниатис Т. 1984] с модификациями. 1 мл клеточной культуры Е.соїі, достигшей оптической плотности DGOO=0.4-0.6 о.е., центрифугировали 1 мин. при 4000 об/мин. Осадок ресуспендировали на холоду в 1мл буфера!: 10 мМ MOPS, 10 мМ RbCl, рН 7.0. Суспензию центрифугировали 1 мин. при 4000 об/мин. осадок ресуспендировали в буфере 100 мМ MOPS, 10 мМ RbCl, 50 мМ СаС12, рН 6.5, и оставляли во льду на 15 мин. После центрифугирования в течение 40 сек. при 3000 об/мин тщательно удаляли супернатант, ресуспендировали осадок в 0.2 мл буфера 2, добавляли 3 мкл ДМСО и не более 10 мкл раствора, содержащего плазмидную ДНК. Смесь выдерживали во льду в течение 30 мин., затем прогревали 2 мин при 42С, добавляли 1 мл среды LB и выдерживали 60 мин при 37С. После чего бактерии высевали на агаризованную среду с соответствующим антибиотиком. 2.8.2.ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК САЛЬМОНЕЛЛЫ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК Трансформацию клеток сальмонеллы (S. typhimnrium SL 7207, S. enteritidis Е-23) проводили методом электропорации с использованием прибора фирмы Bio-Rad согласно рекомендациям изготовителя. 1 мл клеточной культуры бактерий, достигшей оптической плотности Dfioo=0.3 о.е., центрифугировали 1 мин при 6000 об/мин в охлажденном роторе. Осадок ресуспендировали в 800 мкл деионизованной воды.
Процедуру повторяли 5 раз. Затем осадок растворяли в 200 мкл 10 % глицерина и центрифугировали 1 мин при 6000 об/мин в охлажденном роторе. К ресуспендированному в 40 мкл 10 % глицерина осадку добавляли 1-2 мкл плазмидной ДНК. Электропорацию проб вели при напряжении 2.5 V. Сразу после электропорации добавляли в смесь 1 мл среды LB и инкубировали 1 час при 37С, после чего высевали на агаризоваштую среду с соответствующим антибиотиком. 2.8.3. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК Для скрининга плазмидную ДНК выделяли из 1,5 мл или из 5 мл культуры при плотности 109 клеток/мл щелочным методом [Маииатис Т. 1984] с последующим освобождением от примесей нагреванием препарата в течение 10 мин при 75С в 5 М LiCl. ДНК осаждали из супернатанта, добавляя 2,5 объема этанола. Препаративные количества рекомбинантной плазмидной ДНК получали несколькими способами: 1. Endotoxinfree Maxiprep Plasmid Purification kit (Promega); 2, щелочной метод, включающий дополнительную стадию с рядом осаждений ацетатом аммония [Saporito-Irwin S.M. et. al. 1997] описанного ниже. Ночную культуру Е. coli (2,5 мл) добавляли в 250 мл среды 2 YT с соответствующими антибиотиками, инкубировали при 37С в течение 16 ч. Клетки осаждали центрифугированием 10 мин при 10000 х g в охлажденном роторе. Высушенный осадок ресуспендировали в 6 мл раствора I (150 мкл 1,0 М Трис-ТІСІ. рН 7,6; 150 мкл 0,4М ЭДТА, рН 8,0; 600 мкл 0,5 М глюкозы; 12 мг лизоцима; 5,1 мл воды). После 20 минутной инкубации во льду, добавляли 12 мл раствора П (600 мкл 20 % SDS; 480 мкл 5 М NaOIi; 10,92 мл воды). Выдерживали 10 мин во льду, затем вносили 9 мл ледяного 7.5 М раствора ацетата аммония (рН 7,6), интенсивно встряхивали 5-Ю сек и, после 10 минут инкубации во льду, центрифугировали при 10 мин при 10000 х g в охлажденном роторе. К супернатанту добавляли 16 мл изопропаыола, оставляли на 10 мии при комнатной температуре, затем осаждали в течение 10 мин при 10000 х g в охлажденном роторе. Осадок аккуратно растворяли в 4 мл 2 М раствора ацетата аммония (рН 7,4) и после 10 мин инкубации во льду 10 мин центрифугировали при 10000 х g. Далее проводили осаждение ДНК из супернатанта 1 объемом (3 мл) изопропанола как описано выше. Высушенный осадок растворяли в 2 мл стерильной дистиллированной воды с добавлением 10 мкл раствора РНК-азы (5 мг/мл), с последующей инкубацией в водяной бане (37 С) в течение 20 мин. В пробирку вносили 1 мл ледяного раствора 7,5 М раствора ацетата аммония и через 5 мин центрифугировали при 10000 х g 10 мин. Далее проводили повторное осаждение плазмиды из супернатанта 1 объемом (3 мл) изопропанола. Полученный сухой осадок дважды промывали 70 % этанолом и растворяли в стерильной дистиллированной воде. 2.8.4. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК Реакционная смесь обычно содержала 0,2-10 мкг ДНК в буфере, рекомендованном фирмой-изготовителем, и соответствующую эндонуклеазу рестрикции из расчета 1-2 ед. активности на 1 мкг ДНК. Гидролиз проводили при 37С в течение 60 мин. Реакцию останавливали добавлением раствора ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ. ДНК осаждали этанолом из раствора 0,3 М ацетата Na, рН 7.0, осадок промывали этанолом и после высушивания растворяли в необходимом объеме ТЕ буфера.
Иммуиогенность экспериментальных вакцин
Рекомбинантный белок GSTBI и ДНК вакцина pcDNABI, входящие в состав вирусоподобных частиц были испытаны в качестве экспериментальных вакцин против ВИЧ-1. Опытные группы состояли из 30 животных и были внутримышечно иммунизированы следующими конструкциями: 1. Препаратом вирусоподобных частиц, содержащих в центре дсРНК, а на поверхности белок GSTBI (ВПЧ-ТВІ) 2. Препаратом вирусоподобных частиц, содержащих в центре только ДНК вакцину pcDNABI (ВПЧ-pcDNABI) Схема вакцинации включала в себя трехкратное введение препаратов с интервалом 2 недели между иммунизациями. Каждая доза конструкции ВПЧ-ТВІ содержала 45 мкг белка GSTBI; ВПЧ-pcDNABI - 50 мкг плазмиды pcDNABL Для оценки эффективности применения системы доставки в рамках эксперимента была также проведена иммунизация мышей следующими конструкциями: -внутримышечное введение 50 мкг плазмидной ДНК pcDNABI -внутримышечное введение 50 мкг очищенного рекомбинантного белка GSTBI совместно с ПАФ В качестве контрольных выступали следующие группы животных: 1) неиммунизированные животные 2) животные, иммунизированные препаратом ВИЧ, на поверхности которых не экспонирован белок GSTBI 3) животные, иммунизированные векторной плазмидной ДНК pcDNA3.1. Введение вакцинных конструкций приводило к появлению специфических антител в сыворотке иммунизированных животных. Сыворотка животных контрольных групп не реагировала ни с одним из использованных антигенов на. протяжении всего эксперимента. Результаты иммунизации рекомбинантным белком GST- TBI представлены в таблице 1. Из полученных данных видно, что в сыворотках иммунизированных животных обнаруживаются антитела, взаимодействующие как с рекомбинантным белком GSTB1, так и с рекомбинантными белками BH4-l(gpl20, gp41, р24). При введении полиэпитопного белка TBI в виде различных конструкций наблюдается статистически достоверное различие между группами, проявляющиеся как в разной динамике появления антител, так и в уровне их продукции. Наиболее высокие значения специфических антител были зарегистрированы в группах мышей, вакцинированных ВПЧ-ТВІ и очищенным белком GSTBI, введенным совместно с адъювантами (табл.1). Однако эти группы отличались динамикой накопления иммуноглобулинов.
При введении белка в составе ВПЧ, значения антител практически не изменялись вплоть до окончания эксперимента (62 сутки). В группе животных, иммунизированных GSTBI+ПАФ с течением времени наблюдалась тенденция к снижению выраженности гуморального ИО и начиная с 55 суток после иммунизации титры антител становятся ниже соответствующих показателей группы ВПЧ-ТВІ. Введение экспериментальной ДНК вакцины, несущей ген белка TBI, как в составе вирусоподобных частиц, так и в "голой" форме (внутримышечная инъекция плазмиды pcDNABI), так же стимулировало наработку специфических IgG (табл.2). Это говорит о том, что антигенность и конформация белка TBI. синтезированного в зукариотическои системе, значительно не изменяется, по сравнению с рекомбинантным белком, полученным в E.coli. Сыворотки контрольных мышей, которым вводили векторную плазмиду pcDNA 3.1, не взаимодействовали с ВИЧ-антигенами. Тот факт, что значения титров антител группах ВПЧ-pcDNABI и pcDNABI оказались ниже, чем в случае использования в качестве иммуногена рекомбинантного белка (табл.1), характерен для ДІіК вакцин. При ДНК вакцинации стимулируется в основном клеточное звено ИО, а гуморальный ПО активируется опосредованно за счет действия медиаторов со стороны активированных Т - хелперов и ЦТЛ [Donnelly J.J. et al. 2005, S.H. Kaufmann and J. Hess 2000]. По этой причине при ДНК вакцинации обычно не удается высокого уровня гуморального иммунного ответа. Между показателями групп животных, иммунизированных "голой" ДНК вакциной и ДНК вациной, заключенной в полисахаридную оболочку, также были выявлены достоверные отличия. Введение ДНК вакцины без использования защиты индуцировало появление специфических антител, значения которых достигали максимума на 28 сутки после начала эксперимента. При иммунизации мышей ДНК вакциной в составе ВПЧ происходило более раннее по сравнению с группой pcDNABI появление антител в сыворотке животных. Важно отметить, что значения титров антител оставались на высоком уровне вплоть до конца эксперимента (62 сут) (таб.2). Из литературных данных известно, что введение полимерных микрочастиц приводит к появлению воспалительных реакций в месте введения [O Hagan D. et al. 2001, J.-H. Jang and L,D. Shea 2006]. что возможно способствует более раннему появлению ИО на вводимую в составе частиц ДНК вакцину. Начиная с 48 суток между этими группами животных наблюдалась более чем 2-кратная разница в значениях титров индуцируемых IgG. при этом на 62 день титры антител в группе ВПЧ-pcDNABI в 5 раз превышали соответствующие значения, полученные при иммунизации "голой" ДНК вакциной pcDNABI.
Таким образом, использование микросфер в качестве системы доставки ДНК вакцины способствовало развитию более выраженного и пролонгированного ИО. Полученные нами данные согласуются с результатами ряда работ [OTIagan D. et al. 2001, Denis-Mize K.S. et al. 2003, Singh M. et al. 2006], в которых была показана высокая эффективность использования различных вариантов катионных и анионных микрочастиц при введении ДНК вакцин. O Hagan с соавт., тестируя иммуногенность gag и env ДНК вакцин, сорбированных на поверхности катионных микрочастиц, обнаружили 100-кратное увеличение продукции антител при введении вакцины в составе микросфер по сравнению с "голой" ДНК вакциной. Использование микрочастиц в нашей работе, не приводило к столь значительному приросту продукции антител. Возможно, полученный результат является следствием отличий в строении и размере микросфер, что в свою очередь приводит к различным механизмам стимуляции иммунного ответа. В случае катионных микрочастиц, несущих gag и env ДНК вакцины, плазмидная ДНК находилась на поверхности частиц, размер которых составлял порядка 10 мкм. Обладая достаточно большим размером, частицы быстро фагоцитируются АПК, адсорбированная на их поверхности плазмидная ДНК попадает в цитоплазму клетки, что приводит к экспрессии кодируемых в ее составе целевых антигенов [Denis-Mize K.S. et al. 2000]. Вирусоподобные частицы, использованные в нашей работе, имели размер 0,04-0,1 мкм, что по-видимому приводило к более длительному нахождению частиц в межклеточном пространстве без поглощения АПК. Данную гипотезу подтверждают результаты исследования J.-H. Jang and L.D. Shea, которые в течении 6 месяцев с помощью люминесцентого окрашивания клеток и методов иммуногистохимии наблюдали за распределением и экспрессией в организме мышей плазмидной ДНК, инкапсулированной в полимерные микросферы [J.-H. Jang and L.D. Shea 2006]. Было установлено, что если размер частиц не превышает 3 мкм, они более 3 месяцев обнаруживаются в месте введения, при этом происходит постепенное высвобождение ДНК, которая затем с помощью неустановленных пока механизмов попадает в клетку [V.L. Truong-Le et al. 1998, Н. Cohen et al, 2000, Т. Kushibiki et al. 2003]. Поверхность микросфер защищает плазмидную ДНК от деградации ферментами, вследствие чего увеличивается время трансгенной экспрессии целевых антигенов, что в свою очередь также приводит к пролонгации НО [J.-H. Jang and L.D. Shea 2006].
Иммуиогениые свойства вакцинных штаммов сальмонеллы
Для исследования иммуногенных свойств рекомбинантных штаммов сальмонеллы, выступающих в качестве систем доставки белка GSTBI и ДНК вакцины pcDNABI, была проведена однократная перректалытая иммунизация мышей линии BALB/c. Выбор перректального способа введения был сделан на основании сравнения результатов ранее проведенных экспериментов по изучению орального и перректального способов введения иммуиогена. Было показано, что перректальная иммунизация конструкцией S. typhimurium SL7207/ pBMC-env, индуцировала более высокий уровень иммунного ответа, по сравнению с пероральным введением [Карпенко Л.И. и др. 2003]. Видимо, при ректальном введении клетки сальмонеллы сразу попадают в хорошо кровоснабжаемую слизистую кишечника, где они непосредственно контактируют с макрофагами и другими клетками лимфоидиой ткани кишечника и запускают местный и системный иммунный ответ на целевой антиген. При этом не требуется использования антацидов, котрые нейтрализуют кислую рН желудка, как это было бы необходимо при оральном введении. Показатели клеточного иммунитета оценивали в реакции бласттрансформации. Результаты изучения активности имму но компетентных клеток при повторной встрече с антигеном in vitro представлены в табл. 6. Было выявлено, что лимфоциты иммунизированных животных отвечают повышенной пролиферацией на оба используемые в реакции специфических антигена {белок GSTBI и лизат ВИЧ-1), начиная с 14 суток. К 48 суткам не отмечено тенденции к снижению средних значений этого показателя, что свидетельствует о продолжительности ИО. Пролиферативная активность спленоцитов мышей, иммунизированных S. typhimurium SL 7207/pGEXBI, достоверно не отличалась от показателей клеток животных, которым вводили S. enteritidis E-23/pGEXBT на каждый из наблюдаемых сроков. В группах животных, иммунизированных ДНК вакциной в составе клеток сальмонеллы были зафиксированы наиболее высокие значения индекса пролиферации. Введение ДНК вакцины сопровождается активацией преимущественно клеточного звена иммунитета, в то время как при иммунизации рекомбинантиым белком происходит в основном стимуляция гуморального ИО [Donnelly J.J., 2000]. Поэтому полученный результат можно считать закономерным. В то же время ни на один из сроков наблюдения не отмечено снижения пролиферативной активности спленоцитов при их стимулировании митогеном. Эти результаты позволяют предположить, что иммунизация рекомбииантными штаммами сальмонелл, так же как и в случае использования вирусоподобных частиц, не вызывает супрессирующего действия на организм мышей (табл. 6). 3.4.2- Гуморальный иммунный ответ Системный гуморальный ответ оценивался по выявлению IgG в сыворотке иммунизированных животных.
Результаты эксперимента представлены в таблице 7. В таблице указаны значения титров AT, полученные в иммуноферментном анализе при использовании в качестве антигена белка GSTBI. Согласно полученным результатам, введение рекомбинантных штаммов сальмонеллы, продуцирующих белок GSTB1, приводило к появлению специфических IgG в организме иммунизированных животных. Следует отметить, что на 14 сутки после иммунизации значения выявляемых антител в опытных и контрольных группах не отличались, что, возможно, свидетельствует о наработке антител, специфичных к антигенам введенных бактериальных клеток. К 28 суткам титр специфических антител в опытных группах возрастает, в то время как титр антител в сыворотках крови животных контрольных групп уменьшается. Задержку в появлении антител можно объяснить фактом наличия процесса незавершенного фагоцитоза сальмонелл в АПК (макрофагах, дендритных клетках кишечника), вследствие чего презентация целевого антигена происходит не сразу после введения, а только после завершения процесса полного лизиса клеток носителя. Иммунизация рекомбинантными штаммами S.lyphimurium SL 7207 /pcDNA-ТВ1 и S.enteritidis Ё-23/pcDNABI также приводила к появлению в сыворотке животных специфических антител. Показатели гуморального ответа в этих группах животных регистрировались на более низком уровне по сравнению с соответствующими показателями, полученными при иммунизации рекомбинантным белком. Это объясняется тем, что антигены, кодируемые ДНК вакцинами, подобно вирусным антигенам, синтезируются в цитоплазме клеток. После этого происходит их протіессинг и представление на поверхности клеток совместно с комплексом МНС I класса, что приводит к активации клеточного звена ИО. Однако часто при ДНК вакцинации регистрируется и синтез специфических антител [McMichael AJL Hanke 1999, Boyer J. et al. 1997, Donnelly J.J. et al. 2000]. По-видимому, индукция антител осуществляется при попадании части синтезируемого белка в межклеточное пространство, например, такой процесс возможен при апоптозе клеток, трансфецированных ДНК вакциной. При этом количество белка, способного связываться с В-лимфоцитами, очень мало, поэтому высокого уровня гуморального ответа при введении ДНК вакцин достичь не удается. При сравнении результатов иммунизации двумя штаммами сальмонеллы {S.lyphimurium SL 7207 и S.enleritidis Е-23) были выявлены различия в значениях титров антител. В то же время, по данным SDS-электрофореза продукция белка GSTBI в клетках сальмонелл этих штаммов находилась на одинаковом уровне. Учитывая этот факт, к наиболее вероятным причинам различий в индуцируемом иммунном ответе можно отнести особенности существования бактерий в макроорганизме, такие как инвазирующая способность, время персистенции в органах иммунной системы и т.д. Мукозальный иммунный ответ оценивался по выявлению специфических TgA в слизистой тонкого кишечника иммунизированных животных (Рис. 11). В смывах кишечника животных, иммунизированных клетками сальмонелл, несущих ДНК вакцинную конструкцию, AT обнаруживались на низком уровне и достоверно не отличались от соответствующих значений IgA животных контрольных групп (S.typhimurium SL 7207 /рсШАЗ.1. и S.enteritidisE-23/pcmA3,l)(P 0,05). Полученный результат можно объяснить слабой индукцией гуморального ответа при введении ДНК вакцин. Исследование смывов кишечника животных, вакцинированных рекомбинантными штаммами сальмонелл, продуцирующих белок TBI, показало наличие специфических IgA. Максимальный уровень специфических антител наблюдался на 35 сутки после иммунизации. Значимость индукции секреторного иммунитета особенно высока при создании вакцинных препаратов, направленных нрогив инфекций, передающихся половым путем, таких как ВИЧ-инфекция.
