Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Применение липосом в медицине и ветеринарии 8
1.1.1. Липосомы, строение, свойства 8
1.1.2. Способы получения липосом 18
1.1.3. Деструкция фосфолипидов 22
1.1.4. Применение липосомальных препаратов 26
1.2. Синдром снижения яйценоскости-76 29
1.2.1. Определение болезни, распространение, экономический ущерб 29
1.2.2. Этиология 30
1.2.3. Эпизоотология болезни 35
1.2.4. Клинические признаки 38
1.2.5. Патологоанатомические изменения 39
1.2.6. Патогенез заболевания 40
1.2.7. Диагностика болезни 42
1.2.8. Специфическая профилактика заболевания 46
1.2.9 Принципы конструирования инактивированных противовирусных вакцин 48
1.3. Пероральная вакцинация 57
2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 79
3.1. Методы работы с вирусом 79
3.1.1. Культивирование вируса в развивающихся утиных эмбрионах 80
3.1.2. Культивирование вируса в культуре клеток фибробластов утиных эмбрионов 80
3.1.3. Инактивация вируса действием формальдегида 81
3.2. Используемые животные и эмбрионы 82
3.3. Методы получения липосом 83
3.3.1. Получение липосом с использованием ультразвука 83
3.3.1. Получение липосом с помощью инертного носителя 83
3.4. Используемые методы проведения диагностических исследований 85
3.5. Определение остаточных количеств органических растворителей (хлороформ) 86
3.6 Определение процента включения антигена ССЯ-76 в липосомы методом разрушения липосом 87
3.7. Подготовка препаратов липосом к электронномикроскопическому исследованию на ультратоккнх срезах 87
3.8. Приготовление препарата для определения размеров липосом электронномикроскопическим методом 88
3.8.1. Приготовление препаратов регидратированной субстанции липосомальной вакцины ССЯ -76 для исследования в электронном микроскопе 88
3.8.2. Подготовка препаратов липосомальной вакцины ССЯ -76 для исследования в электронном микроскопе (безводная фиксация) 89
3.8.3. Подготовка липосомальных препаратов для исследования в электронном сканирующем микроскопе 90
3.9. Определение размера частиц и ФДС сухой липосомальной вакцины
против ССЯ - 76 оптическим методом 90
3.10. Определение остаточной влажности и перскисного окисления липидов липосомального препарата 94
3.11. Статистическая обработка результатов 96
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 98
4.1. Методы работы с вирусом ССЯ-76 98
4.1.1. Выбор метода культивирования вируса ССЯ-76 98
4.1.2. Инактивация вируса формальдегидом 101
4.2. Изучение пригодности липосомальной формы для получения вакцинных препаратов 107
4.2.1. Изучение механизма взаимодействия липосом с клетками (фагоцитоз липосом перитонеальными макрофагами) 107
4.2.2. Исследование физико-химических свойств и биологической активности липосомальной вакцины на модели имитации переваривания in vitro 113
4.2.3. Определение коэффициента включения вируса ССЯ-76 в липосомы 116
4.2.4. Разработка оптимального ингредиентного состава инактивированной вакцины против ССЯ-76 121
4.2.5. Сравнительные экспериментальные исследования стабильности коммерческой и липосомальной форм вакцины против ССЯ-76 из штамма «В8/78» 125
4.3. Разработка технологии получения липосомальной сухой вакцины 128
4.3.1. Разработка методов получения липосом 130
4.3.2. Сравнительное изучение липосомальных препаратов из различных фосфолипидов 137
4.3.3. Лиофилизация липосомального препарата 139
4.3.4. Выбор защитной среды 140
4.3.5. Интенсификация процесса лиофилизации 143
4.3.6 Принципиальная схема получения липосомальной сухой вакцины.... 144
4.4. Разработка методов контроля липосомальной инактивированной сухой вакцины против ССЯ-76 146
4.4.1. Исследование сухой субстанции липосомального препарата 146
4.4.2. Определение фосфолипидов, входящих в состав липосом 151
4.4.3. Изучение свойств препарата при хранении (биологическая активность, остаточная влажность, сыпучесть, перекисное окисление липидов) 153
4.4.4. Определение внутреннего объема липосом методом ЭПР 156
4.4.5. Определение фракционно-дисперсного состава липосомального препарата (ФДС) 167
4.4.6. Методы контроля липосомальной вакцины против ССЯ- -76 на стерильность, стабильность (реологические свойства, антигенная и иммуногенная активность) 170
4.5. Изучение токсикологии липосомальной инактивированной сухой вакцины против ССЯ-76 171
4.6. Исследование свойств инактивированной липосомальной вакцины против ССЯ-76 в лабораторных и производственных условиях 178
4.6.1. Исследование свойств липосомальной вакцины в лабораторных условиях 178
4.6.2. Проведение производственных испытаний липосомальной вакцины 184
ВЫВОДЫ 188
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 191
ПРИЛОЖЕНИЯ 214
- Применение липосом в медицине и ветеринарии
- ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
- Методы работы с вирусом
Введение к работе
Актуальность работы. Актуальной проблемой современной биотехнологии является разработка новых вакцин для предотвращения инфекционных заболеваний с/х птиц.
В настоящее время перспективным является создание пероральных вакцин, как наиболее безопасных и эффективных форм /1/. Путем местной иммунизации (= пероральной) можно защитить животных от инфекции 121. Способом решения этой проблемы является разработка и создание липосомальных вакцин. Существует большое количество эмульсионных инъекционных вакцин, применение которых проблематично, т.к. их защитная эффективность и иммуногенность очень низкие. Одним из основных критериев при разработке вакцин нового поколения является упрощение способа применения вакцины при сохранении достаточной эффективности вакцины. Липосомы являются эффективной системой доставки вирусного антигена. Использование липосомальной формы в качестве системы доставки антигена повышает иммуногенность, защитную эффективность вакцин, повышает их устойчивость к действию протеаз желудочно-кишечного тракта. Важным достоинством липосомальной формы вакцины является возможность применения перорально, методом однократного выпаивания птице.
Это значительно упрощает и удешевляет процесс вакцинации. Иммунизирующие свойства вакцины проявляются уже на 7 день после вакцинации (для сравнения: у инъекционных форм - на 14 день) /3, 4, 5/.
В настоящее время существует ряд заболеваний, для которых используют только эмульсионные инъекционные препараты. В частности, к таким заболеваниям относится синдром снижения яйценоскости (ССЯ-76), возбудителем которого является ДНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Adenoviridae, роду aviadenovints. ССЯ-76 - это инфекционное заболевание кур, характеризующееся поражением половой системы птицы,
5 резким снижением яичной продуктивности, снесением декальцинированных и депигментированных яиц, ухудшением инкубационных качеств яиц. ССЯ-76 наносит значительный ущерб птицеводческим хозяйствам /6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24/.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение совместимости липосом с антигеном вируса ССЯ-76, исследование возможности получения сухой инактивированной липосомальной формы вакцины против синдрома снижения яйценоскости кур перорального применения, изучение ее иммуногенности и безопасности. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:
Изучить совместимость липосом с антигеном вируса ССЯ-76, биологические свойства липосом, как системы доставки антигена вируса ССЯ-76, определить оптимальный ингредиентный состав сухой липосомальной инактивированной вакцины.
Разработать технологию изготовления вакцины против ССЯ-76 липосомальной инактивированной сухой для перорального применения.
3. Разработать методики контроля вакцины против ССЯ-76 липосомальной инактивированной сухой для перорального применения.
4. Изготовить и испытать в лабораторных и производственных условиях серии вакцины против ССЯ-76 липосомальной инактивированной сухой для перорального применения. Изучить ее иммуногенность и безопасность.
Научная новизна работы. Обоснована возможность использования липосом в качестве системы пероральной доставки антигена вируса ССЯ-76 к иммунокомпетентным клеткам желудочно-кишечного тракта птицы. Изучена совместимость липосом с антигеном вируса ССЯ-76. Установлено, что при определенных условиях можно достичь 85% включения антигена в липосомы. При этом не происходит разрушения антигена и сохраняется его высокая иммуногенность. Установлена безвредность и аректогенность липосомальной формы вирус-вакцины против ССЯ-76. В производственных
6 условиях показано, что антиген, включенный в липосомы, обладает выраженными иммуногенными свойствами, создает высокий уровень иммунитета и предохраняет привитую птицу от воздействия патогенного вируса ССЯ-76 при контрольном заражении. Показано, что проведением местной иммунизации (пероральный способ доставки вакцины) молено защитить животных от инфекции ССЯ-76.
Впервые предложено получать липосомальную вирус-вакцину, по упрощенной пролипосомальной технологии, основанной на физико-химических методах формирования крупных полидисперсных липосом. Технология не предусматривает энергоемких методов ультразвуковой обработки крупных липосом до мелких, мультиламеллярных. Экспериментально в лабораторных и производственных условиях доказана эффективность такого полидисперсного липосомального препарата.
Научно-практическая значимость работы. Обоснована и экспериментально подтверждена на птице иммунизирующая доза, способ введения и схема применения липосомальной вирус-вакцины. Показана высокая иммуногенная активность липосомальной вакцины по сравнению с коммерческими вакцинами. Установлена безопасность и ареактогенность полученной вакцины, по сравнению с коммерческими вакцинами. Разработан технологический регламент изготовления, биологического контроля и применения сухой липосомальной инактивированной вакцины против ССЯ-76. На основе проведенных исследований создана отечественная вакцина против болезни кур «Синдром снижения яйценоскости -76» (сухая инактивированная липосомальная вакцина для перорального применения), разработана технология получения и методика вакцинации птицы.
Находятся в процессе утверждения Главным управлением ветеринарии РФ «Временная инструкция по изготовлению и контролю вакцины против ССЯ-76 липосомальной инактивированной сухой для перорального применения», Технические условия на вакцину против синдрома снижения яйценоскости-76 липосомальную инактивированную (ССЯ-76) сухую для
7 перорального применения и «Временное наставление по применению вакцины против ССЯ-76 липосомальной инактивированной сухой для перорального применения».
Проведены государственные комиссионные испытания лабораторных серий сухой липосомальной инактивированной вакцины против ССЯ-76 («Липосомовак») для перорального применения в экспериментальных условиях. Результаты испытаний показали высокую эффективность вакцины в условиях неблагополучных по ССЯ-76 птицеводческих хозяйств.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседаниях кафедры молекулярной биотехнологии Санкт-Петербургского государственного технологического института, на межвузовской научно-практической конференции профессорско - преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов Санкт-Петербургской Государственной академии ветеринарной медицины.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 213 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, собственные исследования, включающие, описание объектов исследований и методов, экспериментальную часть, выводы, список использованной литературы и приложения.
Работа иллюстрирована 30 таблицами и 46 рисунками. Список литературы включает 251 наименований, в том числе 122 зарубежных источника.
Применение липосом в медицине и ветеринарии
Липосомы - это липидные частицы, впервые описанные в середине 60-х годов XX века английским ученым Алеком Бэнгхемом, имеющие на электронных микрофотографиях вид замкнутых мембранных оболочек. Они являются моделью клеточных мембран. Липосомы представляют собой контейнеры для доставки лекарственных препаратов и антигенов. Мембрана липосом состоит из природных фосфолипидов, они нетоксичны и биодеградируемы, не вызывают нежелательных иммунных реакций, при определенных условиях могут поглощаться клеткой, их мембрана может сливаться с клеточной мембраной, что приводит к внутриклеточной доставке их содержимого (рисунок 1). Фосфолипиды в клетке выполняют в основном структурную роль. Анализ фосфолипидного состава клеточных мембран показывает, что в среднем, они состоят из фосфатидилхолина (рисунок 2, 3) (до 50%), фосфатидилэтаноламина (до 20%), фосфатидилинозитола (до 15%), фосфатидилсерина (до 10%), фосфатидной кислоты (до 2%), сфингомиелина (до 10%), кардиолипина (до 5%), холестерина (до 20%). По своему химическому строению фосфолипиды относятся к группе амфифильных соединений, молекулы которых состоят из 2-х частей: гидрофильной полярной головки, обладающей сродством к воде, и неполярной углеводородной цепи (хвост), придающей гидрофобный характер, образующие двойной слой фосфолипидных молекул, называемый фосфолипидным бислоем.
Бимолекулярный фосфолипидный слой представляет собой термодинамически наиболее выгодную форму ассоциации фосфолипидов, молекулы которых не способны образовывать в воде небольшие агрегаты мицеллярного типа. Согласно геометрическим представлениям возможность упаковки амфифильных молекул в бислой или мицеллы определяется соотношением размеров полярной и неполярной частей молекул. Так липиды, у которых велики различия между объемом полярной головки и поперечным сечением углеводородного хвоста образуют, в зависимости от этих различий прямые или обратные мицеллы. Те липиды, у которых различие в площадях невелико (у большинства фосфолипидов) склонны формировать бислой (липосомы). Характерным признаком фосфолипидов, образующих бислойные структуры, является очень низкая величина критической концентрации мицелообразования ( 10 " М ). Это означает, что доля неассоциированных фосфолипидных молекул, находящихся в равновесии с бислоем крайне низка. Практически весь липид находится в составе крупных надмолекулярных образований. Их структура и морфология зависят от соотношения фосфолипид - вода.
При низком содержании воды (в случае фосфатидилхолина до 40% воды по массе) водно-липидная система существует в виде гомогенной фазы, имеющей ламеллярное (слоистое) строение. Она образована параллельно расположенным протяженным бислоям, отделенным друг от друга водными прослойками. Эти фрагменты, получившие название липосомы, представляют собой замкнутые многослойные макроструктуры, которые состоят из концентрических фосфолипидных бислоев, разделенных изолированными водными промежутками. В определенных условиях могут быть получены также однослойные липидные пузырьки (или везикулы): в них только один липидный бислой отделяет внутреннее водное содержание от окружающей среды. Возможность замыкания бислоя самого на себя с образованием однослойных или многослойных везикулярных структур обеспечивается его эластичностью и гибкостью, а движущей силой этого процесса является стремление устранить энергетически невыгодный контакт воды с гидрофобными областями на краях незамкнутого бислоя.
Обсуждение результатов собственные исследования
Для промышленного птицеводства России и западных стран большое значение имеет решение проблемы высокопроизводительной и эффективной массовой иммунизации птиц против инфекционных заболеваний. Это связано с ростом риска возникновения инфекционных болезней в промышленном птицеводстве, обусловленным увеличением удельного количества выращиваемых птиц на ограниченных площадях птицефабрик. Создание новых пероральных вакцин может обеспечить быструю, эффективную и экономичную массовую вакцинацию. Появление новых инфекционных болезней в промышленном птицеводстве требует разработки новых средств борьбы и специфической профилактики, основанных на достижениях современной биотехнологии. Одним из таких сравнительно новых заболеваний является синдром снижения яйценоскости кур (ССЯ-76). По мнению большинства исследователей, ведущая роль в комплексной программе борьбы с этим заболеванием принадлежит специфической профилактике заболевания /6, 8, 131, 154, 179/.
В настоящее время в ветеринарии для вакцинации птиц, и в частности против ССЯ-76 используются жидкие эмульсионные вакцинные препараты, предназначенные для парентерального введения. Однако, парентеральный способ введения требует больших трудозатрат. В последние годы все большое внимание уделяется пероральному иммунизации. Пероральный метод введения является более перспективным для вакцин, традиционно применяемых парентерально благодаря снижению трудозатрат на проведение профилактической обработки, что дает существенный экономический эффект. Важно также и то, что парентеральные коммерческие вакцины реактогенны, содержат токсичные неантигенные компоненты, вызывают нежелательные патологические изменения на месте инъекции. Пероральные формы вакцин лишены этого недостатка.
В последние годы усилия ряда исследователей обращены на создание новых вирусных вакцин, которые вызывают как местный, так и генерализованный иммунитет при пероральном введении. Перспективным направлением создания вакцин нового типа является разработка липосомальных форм вакцинных препаратов. Новые системы доставки имеют важное значение для профилактических препаратов, которые применяются парентерально. Конструирование новых препаратов для пероральной иммунизации основывается на получении таких систем доставки антигенов, которые обеспечивают с одной стороны устойчивость антигена к действию протеолитических ферментов слизистых оболочек пищеварительного тракта, с другой - способствуют адгезии препаратов в месте введения и лучшей их проницаемости через слизистые оболочки. Включение вируса в липосомальные везикулы обеспечивает устойчивость антигена к действию кислорода, защищает иммобилизованный антигенный материал от действия агрессивных сред организма при попадании вакцины на слизистые оболочки пищеварительного тракта птицы. Важным свойством липосом является их адъювантное действие. Известно, что антигены, включенные в липосомы, по сравнению со свободными антигенами увеличивают напряженность иммунитета в десятки раз. Следовательно, применение липосомальной технологии в получении вакцин позволит повысить эффективность вакцинации птиц и существенно снизить расход препаратов. Липосомальные носители должны обеспечивать высокую биодоступность антигенов, быстрое достижение иммунокомпетентных клеток, длительное удерживание на постоянном уровне титра антител и большую эффективность препарата. Благодаря медленному дозированному выходу антигена увеличивается продолжительность действия препарата. Постепенный выход липосомального антигена также обеспечивает более длительный контакт антигена с клетками-мишенями иммунной системы организма, чем достигается рост напряженности иммунитета.
Методы работы с вирусом
Оценку репродуктивной способности, антигенной и инфекционнной активности штамма вируса ССЯ-76 проводили на развивающихся утиных эмбрионах 10-12 суточной инкубации и на первично трипсинизированной культуре клеток фибробластов утиных эмбрионов.
Эмбрионы заражали в аллантоисную полость вирусом в дозе 10 ЭИД5о/0,2 мл с последующим инкубированием при температуре(37,0±0,5) С.
В течение 120 часов инфицированные эмбрионы ежедневно овоскопировали, отбраковывая павшие, вскрывая в установленные сроки. Перед вскрытием эмбрионы охлаждали в течение 10-15 часов при температуре 2-4 С. Для работы использовали экстраэмбриональную (хориоаллантоисную) жидкость, свободную от бактериального загрязнения.
Наличие вируса в зараженных эмбрионах и динамику его репродукции устанавливали путем титрования пулов экстраэмбриональной жидкости, полученной в различные периоды с момента заражения эмбрионов в реакции гемагглютинации (РГА) с 1%-ной взвесью эритроцитов кур /114/ и выражали 1 2-величиной, обратной разведению вирусного материала.
Исследования проводили на однослойной первично трипсинизированной культуре фибробластов развивающихся утиных эмбрионов, которую готовили по общепринятой методике /117, 119/, используя 24-часовую культуру, содержащую 2 млн клеток/мл, полученную от 13-суточных эмбрионов. Выращивание культуры клеток осуществляли в пробирках на покровных стеклах. Культуру заражали вирусом в дозе 1,0 2ТЦД5о/1,0мл и инкубировали при температуре 37 С в течение 120 часов.
Интенсивность и динамику репродукции вируса определяли по изменению титра гемагглютинирующей и инфекционной активности изучаемых штаммов возбудителя в культуральной жидкости в процессе пяти последовательных пассажей и по характеру цитопатического эффекта в монослое. Для этого, по четыре пробирки с культурой, инфицированной различными дозами вируса, подвергали трехкратному замораживанию-оттаиванию с целью более полного выхода вируса из клеток и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут для осаждения клеточного детрита. Надосадочную культуральную жидкость исследовали в РГА с 1%-ной взвесью куриных эритроцитов. Цитопатический эффект определяли в инфицированной культуре клеток фибробластов утиных эмбрионов (ФУЭ), которую предварительно, фиксировали в жидкости Буэна, окрашивали гематоксилином и эозином и заливали в бальзам на предметные стекла.
Титр инфекционной активности вируса рассчитывали по методу Reed L. and Muench. Н. 1938 /145/ и выражали в Log23P%o /ОД мл и Log2 ТЦД5о /0,1 мл
При проведении всех видов исследований в качестве контроля использовали неинифицированную культуру клеток ФУЭ.
Контроль культуральной жидкости на стерильность осуществляли общепринятым методом высева на питательные среды. При отсутствии бактериального загрязнения культуральной суспензии цитологические изменения монослоя фибробластов относили на счет действия вируса.
