Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Система эритрона 10
1.1.1. Морфофизиология эритроцитов 10
1.1.2. Теория кроветворения 21
1.1.3. Особенности системы эритрона у птиц 30
1.2. Современные представления о механизмах адаптации и стресса 33
1.2.1. Общие механизмы адаптации и стресса 33
1.2.2. Особенности протекания стресс-реакции у птиц 38
1.2.3. Механизмы саморегуляции эритроцитарного баланса в организме при стрессовых воздействиях различного генеза 45
1.3. Резюме по обзору литературы 50
2. Материалы и методы исследования 52
3. Результаты исследования и их обсуждение 58
3.1. Гематологические показатели у птиц в физиологических условиях 58
3.2. Влияние десинхроноза на систему эритрона у птиц 72
3.2.1. Морфофункциональная динамичность параметров красной крови у петухов 75
3.2.2. Резистентность эритроцитов - показатель функциональной реактивности системы крови 81
3.3. Влияние хронического стресса на систему эритрона у птиц 94
3.3.1. Изменение морфофункциональных параметров красной крови 96
3.3.2. Резистентность эритроцитов - показатель физиологического состояния клетки 101
3.3.3. Клеточный стресс 116
Заключение 121
Выводы 124
Практические предложения 126
Библиографический список 127
Список использованных сокращений 160
Приложения
- Морфофизиология эритроцитов
- Особенности протекания стресс-реакции у птиц
- Гематологические показатели у птиц в физиологических условиях
- Изменение морфофункциональных параметров красной крови
Введение к работе
Актуальность темы. Одним из важнейших эволюционно выработанных и наследственно закрепленных свойств живого организма является обеспечение постоянства внутренней среды - гомеостаза. Адаптивные гомеостатические реакции осуществляются согласованным управлением ряда физиологических систем посредством иерархии нервной регуляции и эндокринных факторов (Г.Н. Кассиль, 1983; А.И. Бурказин, О.Г. Газенко, 1983; А.Я. Росин, 1984; А.Н. Голиков, 1985; Ф.З. Меерсон, 1986) при условии нормального протекания эритропоэза (Н.В. Васильев с соавт., 1992; Е.Б. Шустов, 1999).
В механизмах адаптации организма к различным экстремальным воздействиям большое значение приобретает система крови, позволяющая давать объективную оценку физиологического состояния (В.М. Лившиц, В.И. Сидельникова, 2000; А.Ф. Романова, 2000) и прогнозировать развитие адаптационного процесса (Г.М. Яковлев, 1990).
В современной гематологии значительная часть исследований посвящена изучению компенсаторно-приспособительных реакций в системе эритрона у человека и млекопитающих животных. Накоплен обширный фактический материал по физиологии системы эритрона в стрессовых условиях и при патогенезе заболеваний (Я.Г. Ужанский, 1968; П.Д. Горизонтов, 1981; Е.А. Черницкий, А.В. Воробей, 1981; А.В. Шашкин, И.А. Терсков, 1986; СБ. Назаров, 1995; Г.И. Козинец с соавт., 1996; 1997; H.F. Bunn, 1986; E.J.Jr. Benz, 1994). Разработан интегративный системный подход к проблеме процесса эритрообразования и его регуляции (А.Д. Павлов, В.М. Морщакова, 1987; С.Дж. Эмерсон, 2000; Т.Г. Сарычева, Г.И. Козинец, 2001; К.В. Судаков, Ю.М. Захаров, 2002; K.J. Isselbacher, 1994; D.A. Willams, 1995). Глубокая степень проработки этих вопросов на людях и млекопитающих животных способствовала автоматическому переносу многих закономерностей функционирования системы эритрона на организм птицы, что обосновывается идеей единства эволюционных принципов, лежащих в основе филогенетического развития соединительной ткани (крови) (А.А. Заварзин, 1953).
Морфофункциональные особенности эритрона птиц предопределяют невозможность в полной мере переносить методы клинической гематологии в исследования на птице. Недостаточная методологическая проработка данного вопроса ограничивает возможности изучения морфофизиологии системы эритрона птиц, что привело к более широкому распространению биохимических методов исследования в практическом птицеводстве и ветеринарии.
В связи с высокой стрессируемостью птицы, обусловленной их эколого-физиологическими особенностями, в частности цикличностью возбудимости центральных стволовых нервных структур (Т.А. Погребняк, Е.А. Липунова, 2001; Т.А. Погребняк, 2002), а также возросшей нагрузкой на организм при использовании современных промышленных технологий, особенно актуальным становится раскрытие механизмов протекания стресс-реакции в различных системах жизнеобеспечения.
На современном этапе исследования системы эритрона у птиц при стрессировании носят отрывочный и незавершенный характер. Комплексная проработка особенностей компенсаторно-приспособительных реакций в системе красной крови в физиологических и экстремальных условиях, с учетом эволюционно сложившихся особенностей гомеостатической функциональной системы птиц, позволит осуществлять на практике оценку стрессовых состояний и прогнозировать развитие адаптационного процесса.
Цель работы - исследование компенсаторно-приспособительных реакций красной крови как механизма адаптации системы эритрона птиц к стрессовым воздействиям разной интенсивности. Достижение цели осуществлено на основе комплексного изучения некоторых функциональных, биохимических, морфометрических и цитокинетических характеристик эритроцитов в физиологических условиях, при стрессовых воздействиях, после
6 перестройки циркадианной структуры и в процессе непрерывного стрессирования.
В ходе проведения комплекса исследований решены следующие частные задачи теоретического и экспериментального характера:
Усовершенствованы некоторые морфометрические и цитокинетические методы исследования с целью идентификации субпопуляций по морфометрическим индексам и визуализации разновозрастных клеточных популяций системы эритрона у птиц на одном мазке.
Определены морфофункциональные параметры эритроцитарной системы в физиологических и экстремальных условиях.
Выявлены функциональные перестройки в системе эритрона по данным цитокинеза эритроцитарного баланса под влиянием стрессоров.
Изучена зависимость процессов эритропоэза и эритродиереза в условиях стрессовых нагрузок на организм птицы.
Исследована структурно-функциональная динамика адаптивных реакций на клеточном уровне.
Научная новизна работы заключается: в новом решении задачи методологического обеспечения исследований, направленных на комплексное, системное изучение особенностей реакции системы эритрона птиц (с учетом их эволюционных особенностей) на стрессовое воздействие; в постановке и решении задачи исследования адаптивных процессов в системе эритрона птиц при стрессе. Новым научным результатом являются выявление реакций перераспределения крови, инициации регенераторных процессов и активации эритроидного ростка кроветворения в процессе хронофизиологической адаптации и перевод системы в режим минимизации с последующей дизадаптацией при продолжительном стрессировании; в выявлении эффекта эритродиереза на фоне ретикулоцитоза, обусловленного сохранением способности костного мозга к развитию компенсаторных процессов как стереотипной реакции красной крови на стрессирование; - в установлении роста проницаемости клеточных мембран и увеличения концентрации внеэритроцитарного гемоглобина как фактора дестабилизации мембран эритроцитов.
Научная новизна исследования подтверждена тремя положительными решениями на выдачу патента на изобретение («Способ визуализации форменных элементов крови птиц на одном мазке» - № 2002112129, дата приоритета 06.05.02; «Способ определения ретикулоцитов в инкубированной крови птиц» - № 2002119253, дата приоритета 16.07.02; «Способ идентификации субпопуляций эритроцитарной системы» - № 2002134029, дата приоритета 17.12.02).
Практическая значимость. Усовершенствован ряд морфометрических и цитокинетических методов исследования красной крови. Определены морфофункциональные константы эритроцитарной популяции у птиц в физиологических условиях, раскрыты механизмы реагирования системы красной крови и повреждения эритропоэза в экстремальных условиях.
Положения, выносимые на защиту:
Морфометрические и цитокинетические способы визуализации форменных элементов крови отличаются от известных тем, что на основе количественной оценки интенсивности цитокинеза позволяют осуществлять идентификацию форменных элементов крови и проводить анализ гетерогенности эритроцитарной популяции в условиях физиологической и репаративной регенерации системы крови.
Адаптивные процессы в системе эритрона птиц на стрессовые воздействия проявляются как реакции перераспределения крови, усиления регенераторных процессов и активации эритроидного ростка кроветворения при остром стрессе; перевод эритрона в режим минимизации с последующей дизадаптацией - при хроническом стрессе.
Стереотипная реакция системы красной крови на острую и хроническую формы стресса проявляется в виде экстремального эритродиереза на фоне ретикулоцитоза, обусловленного гипоксией и сохранением способности костного мозга к развитию компенсаторных реакций.
Дестабилизация мембран эритроцитов проявляется в росте проницаемости и увеличении уровня внеэритроцитарного гемоглобина.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и получили положительную оценку на VI Международной научно-практической конференции «Экологическая безопасность и здоровье людей в XXI веке» (Белгород, 2000); Всероссийской конференции «Физиология организмов в нормальном и экстремальном состояниях», посвященной памяти и 95-летию со дня рождения В.А. Пегеля (Томск, 2001); VII Международной научно-практической экологической конференции «Приспособления организмов к действию экстремальных экологических факторов» (Белгород, 2002); на заседании кафедры биофизики ВГУ (Воронеж, 2003) и на совместном заседании кафедр анатомии и физиологии человека и животных, медико-биологических дисциплин и зоологии и экологии БелГУ (Белгород, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано десять научных работ, среди них - три положительных решения на выдачу патента на изобретение:
Липунова Е.А. Динамика изменения красной крови у птиц при стрессовых воздействиях / Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина, B.C. Белякова // Экологическая безопасность и здоровье людей в XXI веке: Материалы VI Всерос. науч.-практ. конф. - Белгород, 2000. - С. 111.
Липунова Е.А. Цитокинетические показатели эритроцитарного баланса у птиц в физиологических условиях / Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина // Физиология организмов в нормальном и экстремальном состояниях: Сб. ст. / Под ред. В.И. Гридневой- Томск, 2001. - С. 31-33.
Липунова Е.А. Динамические сдвиги в системе эритрона у птиц при экстремальных воздействиях/ Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. -№ 1 (16).-2002.-С. 101-106.
Липунова Е.А. Способ визуализации форменных элементов крови птиц на одном мазке / Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина (заявка № 2002112129 на выдачу патента на изобретение, дата приоритета 06.05.02).
Липунова Е.А. Способ определения ретикулоцитов в инкубированной крови птиц / Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина (заявка № 2002119253 на выдачу патента на изобретение, дата приоритета 16.07.02).
Липунова Е.А. Устойчивость эритроцитарных мембран в условиях хронического стресса / Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина // Приспособления организмов к действию экстремальных экологических факторов: Материалы VII Междунар. науч.-практ. экол. конф. - г. Белгород, 5-6 нояб. - Белгород: Изд-во БелГУ, 2002. - С. 44-47.
Скоркина М.Ю. К методике оценки морфометрических параметров эритроцитарной популяции у птиц / М.Ю. Скоркина, Е.А. Липунова // Приспособления организмов к действию экстремальных экологических факторов: Материалы VII Междунар. научн.-практ. экол. конф. - г. Белгород, 5-6 нояб. -Белгород: Изд-во БелГУ, 2002. - С. 86-89.
Липунова Е.А. Способ идентификации субпопуляций эритроцитарной системы / Е.А. Липунова, В.М. Никитин, Н.А. Чеканов, М.Ю. Скоркина (заявка на изобретение № 2002134029 на вьщачу патента на изобретение, дата приоритета 17.12.02).
Липунова Е.А. Регенерация системы красной крови у птиц при стрессировании / Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина, А.А. Беляева // Актуальные проблемы медицины и биологии: Сб. науч. работ / Под ред. Н.И. Ильинских. -Томск, 2003. - Вып. 2. - С. 25-30.
10. Скоркина М.Ю. Эритрокинетика у птиц в условиях хронического стресса / М.Ю. Скоркина, Е.А. Липунова // Науки о человеке: Материалы IV Междунар. конгресса молодых ученых. - Томск, 2003 (в печати).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах, содержит 10 таблиц и 22 рисунка, библиографический список включает 350 источников (из них 248 на русском языке и 102 - на иностранном).
Морфофизиология эритроцитов
Для эритроцитов характерны трансформации формы. Так, в экспериментальных условиях эритроциты млекопитающих из дискоцитов могут превращаться в стоматоциты и эхиноциты без изменения объёма. Снижение внутриклеточного рН вызывает стоматоцитоз. Установлено, что зависимость формы эритроцитов от величины рН не носит линейного характера (М.М. Gedde et al., 1995). Раскрытие причин дискообразной равновесной формы эритроцита и механизма ее трансформации - один из не решенных до настоящего времени вопросов.
Основная роль в поддержании формы клетки отводится мембране. Ученые выдвигают несколько гипотез о статических реологических свойствах мембраны эритроцита: 1) роль электростатических сил в поддержании дискообразной формы; 2) способность мембраны приобретать в покое «спонтанную» кривизну в зависимости от биохимического состава; 3) влияние трансформирующих воздействий на сократительную реакцию участков мембраны (в зависимости от концентрации ионов Са2+) (В.А. Левтов с соавт., 1982).
Размеры эритроцитов неодинаковы. Определение среднего диаметра эритроцитов позволяет вычислять их среднюю площадь поверхности, а также судить о размерах капилляров тела животного (П.А. Коржуев, 1964). При высыхании мазка линейные размеры эритроцитов уменьшаются, по данным разных авторов, на 10-20% (П.А. Коржуев, 1949; Д.И. Гольдберг с соавт., 1973). Исследователи отмечают, что обычная световая микроскопия дает неопределенность изображения краев микроскопируемого объекта 0,5 мкм, что соответствует 6% ошибке в определении диаметров и 20% - в определении средней толщины эритроцитов (В.А. Левтов с соавт., 1982).
В большинстве случаев на сухих мазках диаметр эритроцита человека равен 7,2 - 7,7 мкм. В изотонической среде эритроцит человека имеет диаметр 7,1 - 9,2 мкм (в среднем 8 мкм). Толщина на утолщенном крае (высота тора) -около 1,7 - 2,4 мкм, в центре - 0,9 - 1,2 мкм.
Для исключения субъективных ошибок в определении линейных размеров эритроцитов применяют различные способы анализа формы клеток.
Теоретические исследования в области обработки медицинских изображений привели к созданию в ряде стран автоматизированных систем -анализаторов изображений. Изображение несет в себе информацию об объекте и в этом смысле может рассматриваться как многомерный сигнал, описываемый функцией двух или большего числа переменных. Первые результаты цифровой обработки изображений стали применяться для автоматизированных подходов решения многих стандартных задач анализа медицинской видеоинформации (В.А. Сойфер, 2001).
Современные компьютеризированные цитологические методы, применяемые в области исследования клеточной физиологии, дают возможность изучить морфологические особенности клеток на качественно (Г.И. Козинец с соавт., 1990; Г.Г. Левин, Г.И. Козинец, 1997; Л.В. Байдун с соавт., 2001).
Методы сканирующей электронной микроскопии позволяют получить трехмерное изображение, сведения об особенностях строения поверхностной цитомембраны, морфологически охарактеризовать различные формы эритроцитов, определить их процентное содержание и функциональные особенности (Т.А. Нагаева с соавт., 2001; В.В. Новицкий с соавт., 2001).
На основе данных многомерного анализа клеток возможно создание моделей, позволяющих раскрывать фундаментальные аспекты патогенеза многих заболеваний. Один из примеров - способ анализа взвешенных частиц, состоящий в том, что в одной плоскости одновременно регистрируют два или три изображения каждой частицы, соответствующие ее проекциям на взаимно перпендикулярные плоскости. Полученные изображения дают возможность сделать заключение о размерах частиц и определить геометрические параметры объектов формы эллипсоида вращения. Автоматизированная оценка несферичности частиц позволяет описать форму и размеры эритроцитов человека при патологии (СМ. Коломиец, 1996; 1997).
В современной гематологической практике для определения количества и формы клеток используют анализаторы, работающие по принципу кондуктометрического подсчёта клеток с использованием лазерного светорассеивания (М.В. Конова, М.Е. Федотова, 2001; СМ. Коленкин, А.А. Кишкун, 2001).
Кроме того, используют анализаторы изображений, позволяющие найти для каждого объекта координаты х и у, определяющие его положение в измеряемом поле, а также положение его центра масс. Другие измеряемые величины, которые часто закладываются разработчиками в программное обеспечение, - это ряд параметров формы, данные о ближайших соседних объектах, оптическая плотность и интегративная оптическая плотность данной площади (А. Лейси, 1992; А.А. Славинский, Г.В. Никита, 2002).
Для вычисления объема эритроцита часто производят деление общего объема эритроцитарной массы на число клеток в объеме. В качестве общего объема используют показатель гематокрита, а число клеток определяют путем подсчета в камере Горяева. Однако показатель гематокрита не является истинным показателем объема эритроцитарной массы и завышает полученные значения на 2 - 3%. В связи с этим рекомендуется для вычисления корпускулярного объема эритроцита применять геометрические расчеты (В.А. Левтов с соавт., 1982).
Принятая модель эритроцита, представляющая его в виде цилиндра, допускает методическую погрешность в определении его объема и других параметров. Выявлена определенная зависимость между объемом эритроцитов и их количеством: чем больше эритроцитов, тем меньше их объем. Количество эритроцитов крови птиц в среднем 3-Ю л", средний объем одной клетки в среднем 150 мкм , у рептилий - 0,90-10 л" красных клеток, а средний объем составляет 355 мкм , у млекопитающих — около 9,27-10 л" , средний объем -51 мкм3 (П.А. Коржуев, 1964). Одна из важнейших физиологических характеристик эритроцитов -поверхность клеток. Гемодинамика обеспечивает протекание обмена на разделительных поверхностях систем «кровь - ткань» и «кровь - внешняя среда» (А.Н. Голиков, 1985), структурной единицей которых является эритроцит. Этот показатель трудно определить, так как эритроциты млекопитающих и других позвоночных животных не представляют собой по форме правильных геометрических тел. Предложены математические формулы вычисления поверхности эритроцитов, суть которых сводится к «рассмотрению эритроцита как цилиндрической модели (Велькер, 1863), сфероида, без учета толщины клетки (Бюркер, 1922; Пондер, 1934), диска (Кноль), плоского цилиндра (Эммонс)» (Цит. по: П.А. Коржуев, 1949, с. 106).
Особенности протекания стресс-реакции у птиц
Среди большого разнообразия факторов внешней среды, влияющих на организм, имеются общие для всех животных, например, свет, температура, гравитация, атмосферное давление, солнечные ритмы. Именно на эти, ведущие природные воздействия у животных вырабатываются типичные системные реакции, лежащие в основе адаптации к стрессам (А.Н. Голиков, 1985).
При стрессировании птицы активируются компенсаторно-приспособительные процессы, что приводит к гипертрофии и гиперфункции систем, ответственных за адаптацию организма, атрофии и гипофункции органов, имеющих ритмическую деятельность (Ю.П. Квиткин с соавт., 1977).
Стресс у птицы вызывают различные стрессоры. В птицеводстве выделяют 15 стресс-факторов, которые оценивают по 4-балльной шкале (И.А. Болотников с соавт., 1983). В эксперименте стресс можно вызвать различными стресс-факторами - раздражение птиц электрическим током, иммобилизация, вибрация, инъекции различных веществ (фармакологических средств, ядов, токсинов) и др.
При создании экспериментальных моделей стресса необходимо учитывать высокую резистентность птиц к изменениям естественных факторов среды и высокую реактивность к действию необычных стрессовых влияний (Y. Beuving, 1980). С этих позиций достаточно актуально изучение стресса и адаптации у птиц в условиях кратковременного нарушения суточного периодизма и длительного стрессирования - эмоциональные (психические, ранговые, зоосоциальные) стрессы.
Известно, что живой организм имеет пространственно-временную организацию, основанную на синхронизации внутренних и внешних ритмов («датчиков»), поддерживающих гомеостаз и уравновешивание организма с факторами внешней среды (Д.С. Саркисов с соавт., 1975, 1977). Ритмичность функций организма объединена в иерархическую систему, и ее временная организация рассматривается как результат исторического развития циркадианного ритма (В.Е. Соколов, Г.В. Кузнецов, 1978; Б.С. Алякринский, 1979).
Циркадианные ритмы, как и генетический код, - фундаментальное свойство биологической системы, а циркадианная система по значимости сопоставима с нервной и эндокринной. В основе биологических ритмов организма лежат наследственно закреплённая и спонтанно проявляющаяся цикличность многих физиологических функций. Тем не менее нельзя исключать влияние экзогенных факторов («внешних датчиков», «датчиков времени»): они вносят существенные коррективы в цикличность колебательных процессов. Основной экзогенный фактор - фотопериодизм.
Десинхроноз - это рассогласование суточных колебаний ведущих процессов жизнедеятельности организма с внешними циклическими процессами (Б.С. Алякринский, 1973; Ю. Ашофф, 1984). Состояние десинхроноза соответствует всем критериям ОАС (Г. Селье, 1964) и отождествляется с состоянием неспецифического напряжения. При этом нарушается синхронизация всех внутренних ритмов организма (внутренний десинхроноз) или внутренних ритмов с ритмами внешней среды (внешний десинхроноз) (Б.С. Алякринский, 1973; СИ. Степанова, 1977; Ю. Ашофф, 1984).
Физиологическая основа развития десинхроноза - смещение акрофазы циркадного ритма секреции концентрации кортикостероидов, мелатонина, половых, тиреоидных гормонов.
Архитектоника и регуляция циркадианных ритмов осуществляются нервной и эндокринной системами. У млекопитающих центральным аппаратом, способным в роли пейсмекера генерализовать (координировать) циркадианные колебания функций организма, выступает гипоталамус, в частности его супрахиазматическое ядро. У птиц (куры, утки, воробьи) пейсмекерную роль в отношении циркадианной системы выполняет шишковидная железа (эпифиз). Физиологические особенности указанных структур и в целом нейроэндокринная регуляция циркадианной системы описаны в ряде монографий и обобщающих работах (Е.И. Чазов, В.А. Исаченко, 1974; Э.Б. Арушанян с соавт., 1988; А.Н. Агаджанян с соавт., 1987; Ф.И. Фурдуй, 1987; RJ. Wurtman et al., 1986).
Куры обладают очень высокой чувствительностью к изменениям светового дня. Свет, как фактор внешней среды, оказывает модулирующее влияние на ритмичность процессов жизнедеятельности. Действуя через ретино-диэнцефальные связи мозга на переднюю группу ядер гипоталамуса, свет оказывает влияние на эпифиз, обладающий собственным биологическим ритмом. Гипоталамус у кур модулирует активность ретикулярной формации, вегетативной нервной системы, эндокринных желез (Е.И. Чазов, В.А. Исаченко, 1974; Ю. Ашофф, 1984; Ф.И. Фурдуй, 1986; Е.А. Липунова, Т.А. Погребняк, 1991, 2000, 2001; Т.А. Погребняк, 2002).
Важная роль в формировании адаптивных реакций к световому режиму, как и к действию других специфических и неспецифических раздражителей, принадлежит циркадианным ритмам реактивности гормональных звеньев гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (11 НС). Так, недостаточная освещенность снижает активность гонад, увеличивает синтез тиреотропных гормонов (ТТГ), стимулирует линьку, а длительная и интенсивная освещённость способствует увеличению двигательной активности, тормозит линьку, понижает естественную живую массу тела птицы (И.В. Петрухин, 1972; В.И. Фисинин, Г.К. Отрыганьев, 1987); адаптация кур к изменению фотопериодизма сопровождается увеличением синтеза кортикостерона (А.К. Данилова с соавт., 1975). Ритмичная смена периодов света и темноты окружающей среды является ведущим регулятором двигательной активности, пищевого поведения и потребления корма (А.К. Данилова с соавт., 1987).
К эмоциональным стрессам у животных относится борьба самцов, агрессия хищников, агрессивно/оборонительные реакции, межвидовые агрессии, эмоции при иммобилизации и недостатке пространства.
Гематологические показатели у птиц в физиологических условиях
Выбор контрольных точек был определен на основе литературного анализа суточной динамики гормонального фона у цыплят и кур при изменениях светового режима (В.В. Митюшников, 1985). Установлена ведущая роль в формировании адаптивных реакций у птиц к световым режимам, как и к действию других специфических и неспецифических факторов, циркадных ритмов реактивности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (Н.А. Агаджанян, 1987; М.Г. Колпаков, 1978; В.А. Матюшов, 1976).
Зоосоциальный стресс моделировали перегруппировкой птиц и увеличением плотности посадки до 567 см2 на голову. Контролем служили птицы, содержавшиеся изолированно по одной в клетке. Кровь на анализ получали из подкрыльцовой вены с 8 до 10 ч на 2-е, 3-е, 7-е, 10-е, 15-е, 23-е и 29-е сутки непрерывного стрессирования (см. схему опыта).
Для оценки общего состояния животных производили взвешивание и клиническое обследование. Коррелятами развития стресс-реакции служили: поведение и двигательная активность птицы, её габитус, поедаемость корма, динамика массы тела, уровень глюкозы в крови, количество эозинофилов, расчетный коэффициент гемоконцентрации. Для оценки функциональной активности надпочечников проводили тест Торна (А.Я. Аврутина, СМ. Кисляк, 1978) с помощью препарата адренокортикотропного гормона (АКТГ). Оптимальной дозой гормона оказалось 2,5 ЕД/кг массы птицы.
Уровень глюкозы в крови определяли по цветной реакции с орто-толлуидиновым реактивом (В.Г. Колб, B.C. Камышников, 1976). Подсчет эозинофилов производили по способу И.С. Пиралишвили в модификации Устинова (СП. Кулаченко, Э.С Коган, 1979). Коэффициент гемоконцентрации рассчитывали по формуле, предложенной Л.Н. Катюхиным и М.Н. Масловой (1984).
Подсчет эритроцитов производили в камере Горяева. Гематокрит измеряли после центрифугирования крови на гематокритной центрифуге СМ-70. Концентрацию гемоглобина в цельной крови (В.В. Меньшиков, 1987) и в плазме (О.Н. Савельев с соавт., 1990) определяли унифицированным гемиглобинцианидным методом. Для определения морфометрических показателей эритроцитов готовили мазки по общепринятым способам, которые окрашивали по Лейшману и по предложенному нами способу («Способ визуализации форменных элементов крови птиц на одном мазке» - № 2002112129, дата приоритета 06.05.02). Производили суправитальную окраску проб крови бриллиантовым крезиловым синим и фиксацию - докраску по Лейшману, что позволило одномоментно визуализировать на одном мазке клетки лимфоцитарного и разновозрастные популяции эритроцитарного ряда. Определяли: средний диаметр эритроцита, используя автоматизированную систему - анализатор изображений с программным обеспечением «ВидеоТесТ»; средний объем, толщину, площадь поверхности и сферичность рассчитывали по математическим формулам, традиционно принятым в гематологии (П.А. Коржуев, 1964; Л.Г. Смирнова, Е.А. Кост, 1960).
Функциональные свойства эритроцитов определяли по результатам эритроцитометрии и гематологическим параметрам: рассчитывали общую дыхательную поверхность эритроцитов, содержащихся віл крови; содержание гемоглобина в одном эритроците; кислородную емкость крови; количество гемоглобина на единицу объема рассчитывали с поправкой на ядро (М.М. Wintrobe, 1933; 1993; I.D. Collins, W.R. Kelly, 1977).
Одним из критериев физиологического состояния эритроцитов является показатель мембранной стойкости. Для его оценки исследовали осмотический и химический (индуцированный) гемолиз. Устойчивость эритроцитарных мембран к гипоосмотическим растворам хлорида натрия определяли по методу Лимбека и Рибьеру в модификации Идельсона (В.В. Меньшиков, 1987), позволяющему выявить выход в кровяное русло разностойких субпопуляций. Оценивали степень вовлечённости различных субпопуляций эритроцитарной системы в адаптивный процесс по их осмотической резистентности. Кислотную резистентность эритроцитов к действию 0,004 Н раствора соляной кислоты регистрировали по методу Гительзона и Терскова (1959). По результатам осмотического и химического гемолиза строили интегральные (отражающие последовательность вовлечения эритроцитов различной степени стойкости в гемолиз) и дифференциальные (позволяющие определить скорость, с которой эритроцит перемещается из одного состояния стойкости в другое) эритрограммы.
Степень повреждений в белково-липидной структуре эритроцитарной мембраны в экстремальных условиях определяли по ее устойчивости к гипоосмотическим растворам мочевины методом, предложенным Колмаковым (В.А. Михайлович с соавт, 1993; Д.С. Додхоев, 1998). Показатель жесткости мембраны определяли по сорбционной способности эритроцитов (ССЭ) -степени сорбции мембраной метиленового синего (А.А. Тогайбаев с соавт, 1992; Д.С. Додхоев, 1998).
Дифференцированность эритроцитов по возрасту оценивали по данным эритрокинетической функции костного мозга, усиление которой расценивается как процесс физиологической адаптации к действию стрессовых агентов различной природы (А.В. Илюхин, 1982). Репродуктивную способность костного мозга оценивали по общему количеству эритроцитов в периферической крови, а активность эритропоэза - по относительному количеству ретикулоцитов в кровяном русле. Приняв его за индикатор регенераторной активности эритробластической части костного мозга и экспериментально определив полупериод гибели эритроцитов, рассчитывали общую возмещенную потерю эритроцитов, что, согласно представлениям Е.Н. Мосягиной с соавт., (1976) и А.В. Илюхина с соавт. (1982), отражает костномозговую продукцию.
Изменение морфофункциональных параметров красной крови
Стрессирование птиц обусловливает напряжение функциональных резервов в эритроцитарной системе. Критический период (гипоксическая ситуация) складывается на 3-е сутки, когда оказались пониженными количество эритроцитов, гематокрит, концентрация гемоглобина, общая дыхательная поверхность эритроцитов и кислородная емкость крови соответственно на 12,20%; 10,15% (р 0,05); 14,14% (р 0,05); 13,87% (р 0,05) и 14,80 % (р 0,05) (см. табл. 7).
На 10-е сутки при пониженном (на 6,72%; р 0,05) содержании эритроцитов кислородная емкость крови и концентрация гемоглобина в единице объема эритроцита в опытной группе птиц возрастают соответственно на 9,34% (р 0,05) и 4,26% (р 0,05) (см. табл. 7). Снижение числа эритроцитов мы рассматриваем как проявление одной из тактик регулирования системы эритрона, переводящей ее на максимально экономный режим, что для системы и организма имеет защитное значение.
К 15-м суткам стрессирования количество эритроцитов в подопытной группе петухов было ниже на 11,59 % (р 0,05), при этом уровень гемоглобина и гематокрит повышались на 9,81 и 3,70% (р 0,05) соответственно. Среднее содержание гемоглобина в эритроците (СГЭ) подопытных птиц на протяжении эксперимента было выше, чем у контрольных. Достоверные различия наблюдались на 10-е и 23-е сутки - на 16,61 и 13,47% (р 0,05) соответственно (см. табл. 7). Вероятно, такие процессы обусловлены изменениями геометрического профиля клеток эритроцитарной популяции и, как следствие, увеличением гемоглобина в эритроците. Известна корреляционная зависимость между изменением числа эритроцитов и их размерами: содержание эритроцитов прямо пропорционально общей дыхательной поверхности крови и обратно пропорционально их размерам (А.И. Клиорин, Л.А. Тиунов, 1974;М.Н. Сумин с соавт., 2001).
Под влиянием любых воздействий (внешних факторов или при нарушении гомеостаза) в эритроците развиваются процессы, направленные на поддержание постоянства дыхательной поверхности крови (П.А. Коржуев, 1964). В наших исследованиях стрессирование птицы сопровождалось снижением общей дыхательной поверхности эритроцитов на протяжении всего эксперимента. Достоверные различия отмечались на 3-е и 23-е сутки - на 13,87 и 15,45% (р 0,05) соответственно (см. табл. 7). Снижение общей дыхательной поверхности обусловлено количественным сокращением эритроцитов. Примечательно, что стойкое их снижение на протяжении опыта компенсировалось увеличением размеров и насыщаемостью клеток гемоглобином (см. табл. 7).
Количественные колебания эритроцитов тесно связаны с изменением их геометрического профиля, что в первую неделю непрерывного стрессирования нашло выражение в увеличении морфометрических индексов клеток: к 10-м суткам объем, площадь поверхности, толщина и сферичность возрастали на 8,25% (р 0,05); 4,89 (р 0,05); 4,17 и 2,58% (р 0,05) соответственно (табл. 8). Таблица 8 Выявленное на 23-е сутки стрессирования увеличение объема и толщины эритроцитов (на 17,97 и 18,71%; р 0,05) расценивается нами как важнейший механизм адаптивных изменений профиля клеток, направленный на поддержание кислородного гомеостаза, необходимого для создания оптимальных условий протекания окислительных реакций в организме.
Наблюдаемые изменения геометрического профиля и морфометрических индексов эритроцитов, отражающих их морфофункциональные особенности, мы рассматриваем как эффективный механизм системы эритрона направленный на поддержание гомеостаза в условиях экстремальной нагрузки. При стойком понижении количества эритроцитов (критическое падение их уровня приходится на 7-е стуки стрессирования; см. табл. 7) устранение кислородного запроса организма становится возможным только за счет увеличения объема, площади поверхности и толщины клетки, что одновременно способствует поддержанию объемной массы эритроцитов на уровне, близком к физиологическому. Так, на 7-е сутки стрессирования гематокрит у подопытной и контрольной птицы составил соответственно 34,90 и 35,0% (см. табл. 7). Высокий уровень процессов оксигенации крови, по мнению Л.И. Иржака (1985), может достигаться или за счет большого количества эритроцитов и повышения содержания в них гемоглобина, или за счет увеличения среднего объема эритроцита и снижении их числа.
Увеличение объема и площади поверхности эритроцитов (на 17,97%; р 0,05 и 4,92%; р 0,05 на 23-е сутки) следует расценивать как положительное проявление адаптивных изменений профилей клеток, обеспечивающих оптимальный уровень протекания окислительных реакций в организме. Известно, что увеличение поверхности эритроцита облегчает диффузию кислорода в плазму и, следовательно, способствует лучшему обеспечению потребностей тканей в кислороде (Н.В. Васильев с соавт., 1992).
Морфологические изменения эритроцитарной популяции четко связаны с насыщаемостью клеток гемоглобином. Увеличение размеров клеток у птиц подопытной группы сопровождается ростом СГЭ. Приходим к заключению, что внутриклеточные изменения (ускорение синтеза гемоглобина) являются компенсаторно-приспособительными, направленными на сохранение гомеостаза (Д.С. Саркисов, 1977).
Компенсаторное возрастание у подопытных петухов содержания гемоглобина в отдельном эритроците поддерживает кислородтранспортную функцию крови при пониженном количестве эритроцитов, что улучшает ее реологические свойства (Н.В. Васильев, Ю.М. Захаров, 1992). Существует мнение, что в каждом эритроците генетически зафиксировано определённое число молекул гемоглобина, которое может быть синтезировано независимо от размеров клетки (В.Г. Леонова, 1987; Н.Ф. Стародуб, В. И. Назаренко, 1987). Полагаем, что сложившееся ранее представление о связи между объемом клетки и содержанием в ней гемоглобина (Л.И. Иржак, 1985) может оспариваться. Более того, в эритроидных клетках возможна конформационная изменчивость гемоглобинов, отражающаяся на их функциональных способностях (Н.Ф. Стародуб, В.Н. Назаренко, 1987; H.F. Bunn, B.G. Ferget, 1986).
