Введение к работе
Актуальность проблемы. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) относятся к наиболее распространенным химическим факторам окружающей среды, воздействие которых на организм человека и животных приводит к возникновению злокачественных опухолей. Индикаторным соединением ПАУ признан безусловный канцероген для человека - бензо[а]пирен (БП).
Ранее была высказана идея о возможной иммунопрофилактике рака путем индукции соответствующих специфических антител (AT) против химических канцерогенов. Сами по себе химические канцерогены, являясь низкомолекулярными органическими соединениями, не способны индуцировать AT. В связи с этим бьшо предложено два основных подхода для иммунопрофилактики рака. Первый подход основан на использовании конъюгатов химических канцерогенов (или их аналогов) с макромолекулярными носителями, например, с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Однако, использование такого конъюгата в качестве антиканцерогенных вакцин неприменимо для иммунопрофилактики рака у человека, т.к. сохраняется вероятность индукции опухоли самим канцерогеном (Moolten F.L., et al. 1984; Silbart L.K., et al. 1996). Другой подход, а именно использование моноклональных антиидиотипических AT (Chagnaud J.L. et al. 1993), также нельзя признать оптимальным, в силу того, что их применение может приводить к большому количеству осложнений, аллергизации, требует сложных и дорогих условий культивирования гибридом для их производства.
Поэтому разработка альтернативных подходов, направленных на получение иммуногенных препаратов, не содержащих никаких органических аналогов канцерогена и, тем не менее, способных индуцировать антиканцерогенный иммунный ответ, представляет самостоятельный научный и практический интерес.
Одним из таких подходов может быть получение пептидов-мимотопов химических канцерогенов.
Цель работы: получение пептида-мимотопа химических канцерогенов.
Задачи исследования:
-
Получить и охарактеризовать мАТ с заданными свойствами -высокой специфичностью к БП и низкой кросс-реактивностью с неканцерогенными ПАУ и эндогенными структурно схожими соединениями.
-
Смоделировать структуру Fab фрагмента полученного мАТ и определить расположение активного центра связывания соединений группы ПАУ.
-
При помощи технологии фагового дисплея получить рекомбинантные клоны бактериофагов, содержащие пептид, специфически взаимодействующий с AT к БП.
4. Изучить иммунологические свойства пептида-мимотопа БП.
Научная новизна. Впервые в России получено мАТ к БП (мАТ В2).
По своим характеристикам мАТ В2 не уступает зарубежным аналогам, а по специфичности к БП даже превосходит. Полученное мАТ В2 обладает
высокой кросс-реактивностью к бенз[а]антрацену (БА), вероятному канцерогену для человека, и низким аффинитетом к неканцерогенным структурно схожим веществам.
Определены нуклеотидные последовательности ДНК, кодирующие вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепей мАТ В2, транслированы в аминокислотные последовательности, на основе которых построена модель Fab фрагмента мАТ В2. При помощи молекулярного моделирования определена структура активного центра мАТ В2 и сила его связывания с рядом химических соединений группы ПАУ.
На основе полученных моно- и поликлональных AT к БП при помощи технологии фагового дисплея впервые удалось получить пептид-мимотоп химических канцерогенов группы ПАУ. Полученный пептид-мимотоп обладает способностью специфически связываться с мАТ В2 и моноспецифическими поликлональными AT к БП и БА.
Пептид-мимотоп БП в составе рШ белка бактериофага обладает иммуногенными свойствами - способностью индуцировать синтез AT к БП при иммунизации животных.
Научно-практическая значимость работы. Предложенный подход получения пептида-мимотопа химических канцерогенов группы ПАУ, способного индуцировать антиканцерогенный иммунный ответ, может быть использован в поиске пептидов-мимотопов других низкомолекулярных органических соединений, представляющих опасность для здоровья человека и животных (например, пестицидов).
Полученный пептид-мимотоп БП и БА может быть использован при разработке принципиально новой группы иммунопрепаратов антиканцерогенных вакцин, а также при создании новых диагностических тест-систем на основе иммуно-ферментного анализа (ИФА) для определения антиканцерогенных AT. Замена в таких диагностических системах конъюгатов канцероген-белок на пептид-мимотоп исключит работу с потенциально опасными реагентами.
На полученный в данной работе пептид-мимотоп БП и БА получен патент РФ.
Апробация работы. Результаты работы доложены на III Международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (г. Новосибирск 2-8 сентября 2007 г), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (г. Новосибирск 11-15 мая 2008 г.), V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (г. Москва 19-22 мая 2008 г.), Ш Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине» (г. Троицк 3-6 июня 2008 г.), V Северном социально-экологическом конгрессе (г. Москва 21-22 апреля 2009 г.), Международной научно-практической конференции «Новые идеи и решения молодых исследователей в развитии АПК» (1-е место) (г. Волгоград 13-15 мая 2009 г.), научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (г. Новый свет, Крым, Украина, 25-30 мая 2009 г.), научной конференции, посвященной 25-летию Института химической биологии и фундаментальной
медицины СО РАН «Химическая биология - Фундаментальные проблемы бионанотехнологии» (г. Новосибирск, 10 - 14 июня 2009 г.).
Апробация диссертации состоялась 11 ноября 2009 г. на научном семинаре ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах перечня ВАК и 1 патент РФ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы, содержащий ссылки на 14 отечественных и 142 иностранных источников. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 36 рисунками.
