Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Структурно-функциональная характеристика аденовируса CELO 12
1.1.1. Общая характеристика аденовируса CELO 12
1.1.2. Структурно-функциональная организация генома аденовируса CELO 14
1.1.3. Структурные особенности вируса CELO 21
1.2. Эукариотические векторы на основе генома аденовируса птиц CELO 23
1.3. Опухолевый супрессор р53 26
1.3.1 Структурно-функциональная характеристика р53 26
1.3.2. Биологическая роль гена р53 27
1.3.3. Активация белка р53 29
1.3.4. Мишени белка р53 30
1.3.5. Применение р53 в генной терапии 31
1.4. Аденовирусные векторы, экспрессирующие ген опухолевого супрессора человека р53 33
Глава 2 Материалы и методы 36
2.1. Материалы 36
2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы 36
2.1.2. Клеточные линии 36
2.1.3. Плазмидные векторы 37
2.1.4. Ферменты и другие реактивы 37
2.1.5. Животные 38
2.2. Методы 38
2.2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК 38
2.2.2. Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК 39
2.2.3. Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазам 39
2.2.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле 40
2.2.5. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля 40
2.2.6. Лигирование фрагментов ДНК 41
2.2.7. Трансформация клеток Е. coli 41
2.2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 41
2.2.9. Полимеразная цепная реакция 42
2.2.10. Синтез дезоксиолигонуклеотидов 43
2.2.11. Трансфекция клеток линии 293 или LMH для получения рекомбинантных аденовирусов 43
2.2.12. Накопление вирусов 44
2.2.13. Очистка и концентрирование аденовирусов 44
2.2.14. Титрование вирусов 45
2.2.15. Выделение вирионной ДНК 46
2.2.16. Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом 46
2.2.17. Определение авктивности секретируемой щелочной фосфатазы 47
2.2.18. Определение экспрессии /?-галактозидазы in vitro и в подкожных трансплантатах опухолей 48
2.2.19. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН (PAGE - SDS) .48
2.2.20. Иммуноблотинг (WESTERN BLOT IMMUNOASSAY) 49
2.2.21. Иммуноферментный анализ (ELISA) 49
Глава 3 Результаты исследований 51
3.1. Конструирование рекомбинантных аденовирусов на основе генома CELO и генома аденовируса человека 5 серотипа 51
3.2. Трансдукция клеточных культур 54
3.2.1. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы in ovo 57
3.3. Исследование векторной системы CELO in vivo 60
3.3.1. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы в пермиссивной модели 60
3.3.2. Экспрессия секретируемой щелочной фосфатазы в непермиссивных моделях 62
3.4. Исследование векторной системы CELO, как геннотерапевтического агента 67
3.4.1. Исследование влияния гуморального иммунного ответа на уровень экспрессии целевых трансгенов при внутриопухолевых инъекциях вируса CELO 67
3.4.2. Детекция экспрессии гена р53 в составе генома вектора CELO in vitro 71
3.4.3. Экспрессия гена p53 в составе генома вектора CELO in vivo 74
3.4.4. Ингибирование роста подкожных трансплантатах опухолей вирусом CELO-p53 76
Глава 4 Обсуждение результатов 79
Выводы 90
Список литературы 92
- Структурно-функциональная организация генома аденовируса CELO
- Аденовирусные векторы, экспрессирующие ген опухолевого супрессора человека р53
- Трансдукция клеточных культур
- Ингибирование роста подкожных трансплантатах опухолей вирусом CELO-p53
Введение к работе
Актуальность проблемы. Аденовирусы, наряду с другими ДНК-содержащими вирусами, представляют собой широко используемую модель в молекулярно-биологических, биомедицинскнх и ветеринарных исследованиях. Это обусловлено рядом особенностей их структуры и цикла развития.
Экспрессию аденовирусных генов осуществляет ферментативный аппарат клетки-хозяина, что позволило эффективно использовать аденовирусы для изучения фундаментальных механизмов транскрипции н трансляции.
На поздних стадиях инфекции происходит селективный синтез вирусных белков, в то время как трансляция мРНК клетки-хозяина блокируется. Это делает аденовирус идеальной моделью для экспрессии чужеродных генов, встроенных в вирусный геном. С другой стороны, трансформирующие, а в ряде случаев, онкогенные потенции аденовирусов, обусловленные активностью ранних вирусных генов, позволяют использовать их в качестве ценного инструмента для изучения путей молекулярных взаимодействий продуктов ранних вирусных генов с регуляторними элементами клеточного цикла.
Накоплены обширные знания о возможностях применения аденовирусов человека в качестве векторов для лечения заболеваний человека и животных. Масштабные научные исследования и наличие значительного количества точек практического приложения аденовирусных векторов, обусловлены целым рядом их биологических свойств. Широкая тропность, высокая пакующая емкость и способность расти в высоком титре, определили преимущество аденовирусов над большинством других вирусных векторов.
Значительное распространение получили аденовирусные векторы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа (Ад5). Наряду с неоспоримыми преимуществами этих векторов существует ряд недостатков, среди которых значимыми являются их иммуногенность и наличие у большинства людей предсущесгвующего иммунного ответа.
Активация иммунной системы на введение вирусного вектора существенно ограничивает время экспрессии целевых генов в организме человека, что в свою очередь отрицательно влияет на эффективность генной терапии. В связи с этим, многих исследователей привлекают возможности создания векторов на основе аденовирусов животных и гггнц.
Новой и перспективной представляется векторная система на основе аденовируса птиц 1 серотипа (CELO). Вирус неспособен [ичтяицирпяятьг» и i^yjyav млекопитающих.
обладает повышенной пакующей емкостью и большей і гизичесхотг,'с^бшьностьЬ по
МОСК. CO;1^,;o-^j г; „узд
'сравнению с Ад5. Иммунная система человека несснснбилизироваш х вирусу, что позволяет предположить эффективное применение векторов на основе CELO (отдельно или последовательно с Ад5) для увеличения периода экспрессии целевых генов в организме человека.
Важным достоинством CELO является его способность к высокопродуктивной ннфекшш в куриных эмбрионах. Это делает процесс накопления вируса технологичным к экономически привлекательным.
Сфукгурно-функинональная организация элементов капсида (пептонов) CELO позволяет их направленную модификацию для повышения тропности вируса по отношению к определенным типам клеток, что может быть значимо для практического применения вектора
В настоящее время опубликвано незначительное количество работ, посвященных изучению биологии вируса CELO и, практически отсутствуют экспериментальные данные характеризующие "поведение" рскомбинанпшх вирусов in vivo. В связи с чем, исследование основных характеристик (иммуногенности, эффективности доставки целевых генов, времени экспрессии и др.) векторной системы CELO в различных организмах представляет самостоятельный научный интерес.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось изучение векторной системы CELO в различных животных моделях, с использованием генов SEAP и р53.
В процессе работы предстояло решить следующие задачи: 1 .Получение рекомбинайтиих аденовирусов, несущих ген SEAP или р53 под контролем CMV-промотора в сайте делении несущественной области генома CELO.
-
Получение рекомбннантных аденовирусов, несущих ген SEAP или р53 под контролем CMV-промотора в месте делении фрагмента EI области аденовируса человека 5 серотипа.
-
Сравнение эффективности векторных систем на основе Ад5 и CELO путем трансдукцин различных культур клеток.
-
Изучение кинетики накопления трансгенов на модельном примере SEAP в аллонтоисе куриного эмбриона, в зависимости от количества ияокулированных частиц вируса С ELO-SEAP.
-
Изучение экспрессии целевых генов, встроенных в геном вируса CELO, в организме пермиссивных и непермисенвных животных.
-
Определение функциональной активности гена р53, встроенного в геном CELO in vitro и in vivo,
-
Изучение возможности кнгибировання опухолевого роста вектором CELO, экспрессируюшим ген опухолевого супрессора р5Э,
Научная новизна. В результате проведенной работы впервые получены рекомбкнантные векторы CELO-SEAP н CELO-p53. Путем трансдукции различных клеточных культур определена эффективность вектора CELO-SEAP, в сравнении с аналогичным вектором на основе Ад5.
Впервые была изучена кинетика накопления трансгенов, встроенных в геном CELO, в аллонтоисе куриных эмбрионов.
Впервые показана принципиальная возможность детекции экспрессии трансгена (SEAP), встроенного в геном CELO, в сыворотке крови животных, при различных путях введения вектора CELO-SEAP.
Определено время гкреистенцин экспрессии трансгена (SEAP) при многократных внутрнопухолевых инъекциях CELO-SEAP, и влияние на уровень экспрессии трансгена гуморального иммунного ответа.
В ходе работы была показана эффективная экспрессия и функциональная активность гена р53, встроенного в геном CELO, в различных линиях опухолевых клеток.
Впервые показано ингибирование роста опухолей вектором CELO-pS3.
Практическая значимость. Работа представляет не только научный интерес, но и в перспективе может иметь практическое приложение. Векторы на основе CELO могут быть использованы для создания средств профилактики различных заболеваний и в качестве терапевтических агентов для коррекции повреждении в геноме клеток млекопитающих.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы. Результаты работы представлены на 10 международной конференции "СПИД, РАК и Родственные проблемы".
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения; обзора литературы;
экспериментальной части; результатов и их обсуждения; выводов; списка цитируемой литературы, включающего 137 библиографических ссылок. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 2 таблицами.
Структурно-функциональная организация генома аденовируса CELO
Геном CELO, как и геном Ад млекопитающих содержит инвертированные концевые повторы (ИКП), которые несколько короче, чем ИКП аденовирусов млекопитающих. С 5 -концом каждой цепи ДНК через фосфат цитозина ковалентно связан через фосфат гуанозина терминальный белок (ТВ) [28, 113].
Наибольшая гомология между вирусом CELO и другими представителями семейства Adenoviridae была обнаружена при анализе эволюционно консервативных генов структурных вирусных белков и генов, ответственных за репликацию вирусной ДНК.
Общая организация генома CELO представлена в таблице 1.
Анализ структуры ранних областей CELO, ответственных за взаимодействие с клеткой-хозяином, показал очевидные различия их организации с организацией ранних областей аденовирусов человека и млекопитающих [13, 14].
Примерно 5 тысяч пар оснований (т.п.о.) левого плеча генома и 15 т.п.о. правого почти полностью лишены гомологии с геномами Ад млекопитающих (см рис. 1) [28].
Область Е1 Ад млекопитающих локализуется на левом плече генома и кодирует гены, ответственные за развитие и поддержание трансформированного фенотипа клеток [113] . В геноме CELO область, подобная Е1 области Ад5 или других представителей рода Mastadenovirus не идентифицирована. На месте предполагаемой Е1 области CELO Chiocca и др. были обнаружены несколько открытых рамок считывания (ОРС), функции которых еще не установлены (см рис. 1).
Однако, в правой части генома CELO найдены ОРС, кодирующие белки, сходные по выполняемым функциям с белками Е1 области Ад млекопитающих [27, 74].
Белок GAM-1 является функциональным, но не структурным аналогом клеточного белка Вс1-2, который предотвращает развитие программируемой клеточной смерти (апоптоза) [27].
Наряду с антиапоптической функцией, GAM-1 и белок, кодируемый ОРС22, обладают ElA-подобной активностью. Они способствуют высвобождению транскрипционного фактора E2F и, следовательно, усилению экспрессии вирусных генов [74].
Кроме этого, GAM-1 усиливает экспрессию белков теплового шока hsp70, hsp40, hsp27 (и незначительно hsc70, hsp90), что возможно существенно для правильного синтеза вирусных белков и сборки капсидов [45].
В последней работе, посвященной исследованию функции белка GAM-1, перечисленные активности объясняются его способностью инактивировать деацетилазу гистонов 1 (HDAC) [26] .
Фенотипически делеция GAM-1 проявляется в снижении продуктивности вирусной инфекции в 104-10б раз.
Е2 область вируса CELO начинается с позиции 23292 нуклеотида и транскрибирутся с 1-цепи ДНК [101]. Функционирование этой области происходит как на ранних, так и на поздних стадиях инфекции. Она кодирует белки, ответственные за осуществление процесса репликации вирусной ДНК - терминальный белок, ДНК-связывающий белок, вирусную ДНК-полимеразу [113].
ДНК-связывающий белок (ДСБ) вируса CELO имеет четко выраженную гомологию с ДСБ аденовирусов человека. Функция этого белка заключается в связывании оцДНК, что возможно, является основой для ее элонгации [103].
Гены CELO, кодирующие ДНК-полимеразу и терминальный белок локализуются в позициях сходных с расположением этих генов у Ад2 и Ад5 [28].
Вирусная ДНК-полимераза обладает 5 -3 полимеразной и 3 -5 экзонуклеазной (корректирующей) активностью. Во время полимеризации формируется комплекс полимеразы с претерминальным белком. Этот комплекс связывается с участком начала репликации (origin) и при участии ДСБ осуществляет процесс полимеризации [103] (см. табл. 1).
ЕЗ область Ад5 человека локализована между геном pVIII и геном фибера. Она имеет размер около 2,5 т.п.о. Эта область ответственна за репрессирование цитотоксического иммунного ответа, возникающего в организме хозяина в ответ на вирусную инфекцию [127]. В геноме CELO эта область не идентифицирована. Участок генома между генами pVIII и фибера очень мал. Его размер от стоп-кодона pVIII до инициирующего кодона первого фибера составляет 476 п.о. В этой области локализуются две маленькие рамки считывания, не имеющие существенной гомологии ни с одним из известных ЕЗ-генов [28] .
По мнению Chiocca и др., данная область не требуется вирусу CELO для успешного протекания репликативного цикла, так как в курином эмбрионе не происходит развития цитотоксического иммунного ответа.
При попытке идентифицировать область Е4 в составе генома CELO, была обнаружена группа ОРС, локализующихся на 1-цепи между позициями 36000 и 31000 п.о. Расположение этой группы сходно с расположением Е4 области Ад млекопитающих, но с дополнительными 8 т.п.о. с правого края.
Однако, гомология этой группы с Е4 областью Ад человека полностью отсутствует [28].
ОРС 1 Е4 области Ад2 кодирует белок гомологичный дУТФазе, но с отсутствующей пирофосфатазнои активностью [75] . В составе генома CELO найден аналогичный ген в позиции 1999 п.о., и в отличие от своего аналога, продукт этого гена обладает невысокой пирофосфатазнои активностью [28] .
Таким образом, можно сказать, что вирус CELO имеет отличную от аденовирусов млекопитающих организацию ранних областей, за исключением организации Е2-области.
По мнению Chiocca и др., в процессе эволюции в геноме CELO произошла реаранжировка ранних областей вокруг центральной части генома. Примерами этой перегруппировки могут служить антиапоптические гены CELO (GAM-1, orf22) и ген дУТФ-азы [28].
Поздние гены CELO начинают экспрессироваться после репликации вирусной ДНК. Структурная организация этой области внутри семейства Adenoviruses имеет выраженное сходство и гомологию (см. табл. 1) [13, 79, 113].
Однако в геноме CELO есть две характерные структурные особенности. Геном CELO лишен гена самого большого белка сердцевины pV (41 кДа) . Именно с этим фактом связывают необычно высокую пакующую емкость вируса CELO.
Второй особенностью организации генома CELO является наличие двух генов, кодирующих фиберы [57] . Аналогичной структурной особенностью организации генов фиберов обладают Ад человека 40 и 41 серотипа. Но, в отличие от CELO, у Ад4 0 и Ад41 каждый ген фибера имеет свой сайт полиаденилирования [28].
Аденовирусные векторы, экспрессирующие ген опухолевого супрессора человека р53
Проведено большое количество исследований способности аденовирусов, экспрессирующих ген р53, блокировать рост злокачественных новообразований. Противоопухолевая активность гена р53 показана на опухолях мочевого пузыря [68], мышечной ткани [96], меланомах [31], опухолях простаты [35, 41], В-клеточных лимфомах [23], опухолях пищевода [115], щитовидной железы [89], легких [119, 129], сквамозно-клеточной карциноме шеи и головы [32, 33, 34, 91], опухолях груди [100], мозга [10, 17] и др.
Эффект ингибирования роста в случае использования аденовирусного вектора, экспрессирующего ген р53, специфично направлен на опухолевые клетки, в то время как нормальные клетки остаются интактными [137]. Кроме того, вирусопосредованная доставка гена р53 оказывает противопухолевое воздействие вне зависимости от р53-статуса клетки [33, 54].
Способность р53 активироваться в ответ на разрывы в цепи ДНК широко используется в комбинированном подходе [133] . Суть такого подхода состоит в инъецировании аденовирусного вектора в опухоль с последующим применением ДНК-повреждающих агентов [53, 93] .
В настоящее время в финальной стадии клинических испытаний находятся два аденовирусных вектора, экспрессирующих ген р53 - INGN 201 и SCH58500. INGN 201 протестирован уже более чем на 550 пациентах и полностью прошел 1 и 2 фазу клинических испытаний [33, 92, 119] (на пациентах с крупноклеточным раком легких и сквамозно-клеточной карциномой шеи и головы).
Результаты исследований показали, что INGN 201 не обладает побочными эффектами, которые свойственны традиционным методам терапии. Токсичность препаратов вектора не обнаружена для максимальной из использованных доз - 2,5Х1012 физических частиц вируса [33].
Результаты первой фазы клинических испытаний дали следующие результаты.
Из 33 обработанных опухолей, образованных сквамозно-клеточной карциномой шеи и головы, 2 опухоли регрессировали частично (более чем на 50% от начального размера) и 1 опухоль регрессировала полностью [131]. Испытания вектора на пациентах с крупноклеточным раком легкого показали активность INGN 201 (частичную регрессию опухолей) в четырех случаях из 52.
Применение аденовирусного вектора INGN 201 во второй стадии клинических испытаний (106 пациентов) вызывало частичную регрессию 11 и полную б опухолей. 82 из обработанных опухолей стабилизировались на 3-7 месяцев [33] .
Комбинированное с радиотерапией применение INGN 201 вызывало полную или частичную регрессию опухолей у 11 из 17 пациентов. В биопсиях 9 из 11 пациентов, взятых через три месяца после обработки, выжившие опухолевые клетки не обнаруживались [131].
Среди предварительных результатов третьей фазы клинических испытаний, можно отметить увеличение медианы выживаемости у больных с неоперабельными формами сквамозно-клеточной карциномы шеи и головы на 2,5 месяца, по сравнению с больными получавшими метотрексат [59].
Кроме того, исследованиями было определено, что прирост вирусспецифических антител при многократных инъекциях не предотвращал экспрессии р53 в опухолях [131] .
Следует однако отметить, что основная нагрузка по элиминации внутриклеточных агентов, подобных вирусам, лежит на цитотоксических лимфоцитах. Активация последних может существенно ограничивать время экспрессии трансгенов [135]. И, по-видимому, прирост уровня вирусспецифических антител не находится в прямой зависимости со скоростью элиминации экзогенного р53 из организма.
Кроме этого, методы определения экспрессии р53 in vivo не являются количественными и не позволяют достоверно оценивать остаточный уровень р53.
Возможно, одним из способов эффективного поддержания экспрессии р53, будет сочетание инъекций вирусных векторов, обладающих разными антигенными свойствами.
Трансдукция клеточных культур
Для исследования кинетики накопления трансгенов in vitro, рекомбинантными вирусами CELO-SEAP и Afl5-SEAP был трансдуцирован ряд клеточных культур (рис. 4) . По литературным данным, уровень трансдукции культур клеток человека рекомбинантными вирусами CELO сравним с данными по трансдукции для Ад5 [85] . Это может объясняться тем, что длинный фибер CELO способен взаимодействовать с CAR (coxsakie-adenovirus receptor) [130] .
CAR является высокоаффинным рецептором для Ад человека подгруппы С. Первичное взаимодействие пентона Ад5 с CAR и вторичное с интегринами через последовательность RGD опосредуют интернализацию и эндоцитоз вируса [130]. Похожий механизм, возможно, реализуется при проникновении вируса CELO в клетки человека. Однако следует отметить, что вторичное взаимодействие вируса с интегринами не может быть опосредовано консенсусом RGD, так как данная аминокислотная последовательность отсутствует в составе основания пентона CELO.
В наших экспериментах наибольший уровень экспрессии SEAP (до ЗООмЕд) наблюдался в пермиссивных как для Ад5, так и для вируса CELO, культурах клеток (293 и LMH соответственно). Высокий уровень экспрессии в этих клетках объясняется возможностью репликации вирусов. Культуры клеток А54 9 и Н1299 не способны поддерживать репликацию вирусов CELO и Ад5. Уровень экспрессии SEAP в этих культурах не превышал 120 мЕд/мл для CELO и 180 мЕд/мл для Ад5 (рис. 4).
При трансдукции линии клеток В16 (меланома мыши) уровень экспрессии составил 3,4 мЕд/мл (для CEL0-SEAP) и 2,9 мЕд/мл (для Afl5-SEAP).
Мы предполагаем, что низкий уровень трансдукции клеток меланомы связан с тем, что на поверхности меланоцитов мыши отсутствуют рецепторы, которые используют для проникновения Ад5 и CELO.
В ходе проведенного эксперимента мы варьировали множественности инфекции CEL0-SEAP от 10 до 1000 БОЕ на клетку. Наибольший уровень экспрессии секретируемой щелочной фосфатазы наблюдался при использовании множественностеи инфекции от 100 до 500 БОЕ на клетку. Эти данные полностью воспроизводились в аналогичных экспериментах по трансдукции культур клеток вирусом CELO-GFP.
Повышение соотношения клетка/инфекционная вирусная частица до 1/1000 вело к возникновению цитотоксического эффекта и снижению уровня экспрессии секретируемой щелочной фосфатазы в культуральной среде.
Клетки А549, 293, Н1299, LMH были трансдуцированы вирусами CEL0-SEAP и Ад5-БЕАР. Множественность инфекции составляла 100 БОЕ на клетку. Уровень активности SEAP определялся по скорости конверсии п-нитрофенилфосфата. Данные по каждой точке являются результатом трех независимых экспериментов. Отклонения в измерениях не превышали 3%.
Ингибирование роста подкожных трансплантатах опухолей вирусом CELO-p53
На этом этапе работы нами была изучена способность рекомбинантного аденовируса CELO-p53 вызывать замедление роста опухолей аденокарциномы человека A431/wafIConA у голых мышей линии D2&I при многократных внутриопухолевых инъекциях.
Клетки линии A431/waflConA прививались 8-недельным самкам мышей подкожно из расчета 5х105 клеток на инъекцию. В каждой группе было по б сформированных опухолей. Опухоли объемом приблизительно 200 мкл на 19 день были инъецированы препаратами вирусов в количестве 5x10і1 физических частиц вируса/инъекцию. Инъекции вирусов проводили через день. Всего группы получали по 4 инъекции. Контрольные группы были инъецированы PBS и рекомбинантным вирусом CELO-GFP. Объем опухолей оценивали как произведение длины, ширины и 1/2ширины. Эффективное проникновение вектора в клетки A4 31/waflConA оценивали по экспрессии белка GFP, после внутриопухолевой инъекции рекомбинантного вируса CELO-GFP (см. рис 14). Замедление роста опухолей в группе, получавшей CELO-p53 (по отношению контрольным группам) наблюдалось после первой инъекции. При этом 3 опухоли из б частично регрессировали после второй инъекции. Средний объем опухолей (на последний день эксперимента) в группе мышей, получавших инъекции CELO-р53 был в 2,6 раза меньше по отношению к группе получавшей CELO-GFP ив 6,ft раз меньше по отношению к группе, получавшей инъекции PBS. Измерения продолжались до достижения размера опухоли 2,5 мл, после чего мыши считались погибшими.
Данная работа выполнялась совместно с к.б.н. Ильинской Г.В. (лаборатория цитогенетики РОНЦ)
