Введение к работе
Актуальность проблемы.
В настоящее время аденовирусы (Ад) хорошо изучены в качестве этиологических агентов различных инфекционных заболеваний человека и животных. Они являются удобной моделью для многочисленных исследований в молекулярной биологии, включая изучение сплайсинга мРНК, репликации ДНК, транскрипции и клеточной трансформации. Ад широко применяются в качестве векторов для транзиентной экспрессии генов в клетках млекопитающих in vivo и in vitro. Исследуется применение векторов на основе Ад человека и животных в качестве живых рекомбинантных вакцин для ветеринарии и медицины, а также для генной терапии.
Использование векторов на основе генома Ад человека в настоящее время имеет ряд ограничении: предсуществуюишй гуморальный И клеточный иммунный ответ организма человека на данные аденовирусы, ограниченный спектр клеток, в которые Лд человека эффективно проникают, размер вставки чужеродного генетического материала для аденовирусных векторов первого поколения составляет не более 7,5 т.н.п., а также серьезным ограничение является экономический фактор, так как нарашивание препаративных количеств Ад человека в культуре клеток является трудоемким и дорогостоящим процессом. В связи с этим возможность создания нозых векторных систем на основе геномов аденовирусов животных, в первую очередь птиц, вызывает большой интерес многих исследователей.
В последние годы были осуществлены попытки создания вееторов на оснойє па базе генома аденовируса птиц CELO. Преимуществами векторов на основе CELO являются отсутствие первичного иммупною ответа в организме млекопитающих, непермиесивноеть клеток человека и животных для этого вируса, большая пакующая емкость и более высокая физическая стабильность внрионов CELO, чем Ад млекопитающих.
Способность аденовируса птиц CELO размножаться в куриных эмбрионах делает его привлекательным объектом для и пользования в ка^ёстВе.^екгоаа, так
пользования в качестве .векгода,
г:ЛУ1: .. ...;. - I с..<-,Д |
У-
Мое, с."/;.. -,:.'. -і ViAvMum I
как это значительно повышает технологичность процесса получения препаративных количеств рекомбинантных вирусов CELO,
Результаты исследований, проведенных в ряде лабораторий мира, позволяют предположить что вектор на основе аденовируса CELO может быть многофункциональным и имеет хорошие перспективы использования для создания живых маркированных вакцин для птицеводства, а качестве генно-инженерных субъединичных вакцин для применения в ветернарнн и медицине, а Также в генной терапии опухолей.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось разработка технологии конструирования векторов ш основе генома аденовирусов птиц CELO для доставки в клетки млекопитающих целевых генов и использование этой технологии для получения рекомбинантных аденовирусов CEI.O, содержащих гены рибозимов, направленных на ингнбнрование репродукции вируса гриппа А.
В процессе работы предстояло решить следующие задачи:
-
Разработать методику конструирования рекомбинантных аденовирусов на основе генома аденовируса іггиц CELO, основанную на гомологичной рекомбинации фрагментов вирусного генома в клетках LMH.
-
Исследовать способность аденовирусного вектора CELO обеспечивать доставку и эффективную экспрессию репортерных генов в клеточные культуры различного видового и тканевого происхождения, а также в клетки тканей лабораторных животных in vivo,
Ъ. Получить решмбинантные аденовирусы іггиц CELO, несущие гены фуккци опально го и дефектного рибозимов, направленных на расщепление мРНК гена PBI вируса гршша Л, Исследовать экспрессию генов рибозимов и их биологическую аетивность в культуре клеток. Научная новизна и практическая значимость.
Мы впервые применили для получения рекомбинантных аденовирусов CELO мегод гомологичной рекомбинации в культуре клеток, используемый для создания рекомбиначткых Ад человека.
Впервые нами была показана трансдукция рекомбинантным аденовирусом птиц CELO-GFP культур клеток человека линий HI299, НерЗВ и культур клеток животных линий MDBK.,MDCK,COSl,RAT2, В16.
При проведении экспериментов ш vivo впервые показано, что при введении рскомбнпаїтюго аденовируса CELO-GFP в хвостовую вену мыши экспрессии белка GFP наблюдалась в клетках печени; кроме того впервые показана транедукция клеток опухоли В16 меланом ы у мыши при вкуїриолухолевом введении рс комби на итого вируса CELO-GFP.
Впервые получены рекомбннаншыс аденовирусы птиц CELO, несущие гены функционального и дефектного рнбозимов, направленных на расщепление мРНК гена РВ1 вируса гриппа А, под контролем промотора цитомегаловируса человека. Показана экспрессия рнбозимов в клеткам линии Л549, инфициро ванных полученными рекомбикзнтнымн аденовирусами, и ннгпбированис репродукции вируса гриппа Л в этой линии клеток.
Работа представляет не только научный, но и практический интерес. Рекомбинантные аденовирусы CELO имеют хорошие перспективы использования в качестве живых или субъединичных рскомбннатных вакцин для ветеринарии (в первую очередь для птицеводства) и медицины.
При наращивании рекомбинантных аденовирусов CELO в куриных эмбрионах одновременно происходит накапливание секретируемых продуктов экспрессии целевых трансгенов в аллаїгтоисной жидкости. После соответствующей очистки они могут быть использованы для создания диагностику мов, а также для вакцинации.
Весьма перспективно может оказагьен применение этого вектора в генной терапии, особенно в генной терапии рака.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка литературы, включающего 18()
библиографических ссылок. Работа изложена на U5 машинописных страницах, включая 3 таблицы н 24 рисунков.
