Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 11
2. Литературный обзор
2.1 Особенности метаболизма молликут 14
2.2 Реконструкции карт метаболизма исследуемых организмов 20
2.3 Основные методы, используемые для анализа метаболитов бактерий
2.3.1 Тушение метаболизма и экстракция метаболитов 28
2.3.2 Методы разделения и анализа метаболитов
2.3.2.1 Газовая хроматография 34
2.3.2.2 Капиллярный электрофорез 35
2.3.2.3 Жидкостная хроматография 35
2.3.2.4 Выбор оптимальных условий проведения хроматографического разделения метаболитов 42
2.3.3 Детектирование и идентификация метаболитов 47
2.4 Обработка данных и интерпретация результатов анализа метаболитов 51
2.4.1 Обработка полученных данных 51
2.4.2 Способы интерпретации полученных результатов 56
2.5 Оценка адаптационных возможностей бактерий с применением метаболомного анализа
2.5.1 Применение качественного анализа метаболитов 59
2.5.2 Применение количественного анализа метаболитов 61
2.6 Перспективы метаболомики 64
3. Материалы и методы исследования 68
3.1 Штамм бактерий и условия культивирования 68
3.2 Определение устойчивости культуры к кислотному и осмотическому воздействию
3.2.1 Определение устойчивости культуры к кислотному воздействию 69
3.2.2 Определение устойчивости культуры к осмотическому воздействию...
3.3 Химические реактивы 70
3.4 Экстракция метаболитов 71
3.5 Инструменты и ВЭЖХ-МС параметры 72
3.6 Идентификация метаболитов и программное обеспечение 73
3.7 Сравнительный анализ метаболомов S. melliferum, М. gallisepticum и А. laidlawii 73
3.8 Выравнивание аминокислотных последовательностей 75
4. Результаты и обсуждение 76
4.1 Анализ метаболома бактерий A laidlawii, S. melliferum иМ gallisepticum.. 76
4.2 Реконструкция метаболизма S. melliferum, М. gallisepticum nA.laidlawii
4.2.1 Удаление реакций из первичной схемы метаболизма 81
4.2.2 Реакции, приводящие к образованию «мертвых концов» в схеме метаболизма 82
4.2.3 Заполнение пробелов в схеме метаболизма 83
4.2.4 Выявленные особенности метаболизма молликут
4.3 Пентозофосфатный путь в клетках молликут 85
4.4 Составление списков возможных внутриклеточных метаболитов исследуемых видов молликут 88
4.5 Детектирование метаболитов трех видов молликут с помощью метода ВЭЖХ-МС/МС 89
4.6 Идентификация метаболитов бактерий A. laidlawii, S. melliferum u М. gallisepticum 93 4.7 Сравнительный количественный анализ метаболомов трех видов М.
gallisepticum, A. laidlawii и S. melliferum 99
4.8 Накопление метаболитов относительно компонентов отдельных метаболических путей S. melliferum, М. gallisepticum иА. laidlawii 103
4.9 Влияние аминокислотных замен на активность ферментов
4.10 Исследование адаптации молликут к кислотному воздействию 113
4.11 Исследование адаптации молликут к осмотическому воздействию
5. Заключение 126
6. Выводы 127
7. Благодарности 129
8. Список литературы
- Тушение метаболизма и экстракция метаболитов
- Обработка данных и интерпретация результатов анализа метаболитов
- Определение устойчивости культуры к кислотному воздействию
- Реакции, приводящие к образованию «мертвых концов» в схеме метаболизма
Тушение метаболизма и экстракция метаболитов
Важным этапом системного анализа микроорганизма является реконструкция его метаболической карты, то есть сбор и визуализация всех потенциальных биохимических процессов клетки. Процесс моделирования метаболических карт может приводить к важным результатам уже на этапе разработки. Например, в работе группы Л. Серрано при реконструкции метаболической карты М. pneumoniae наблюдались несоответствия между моделью, составленной согласно аннотации генома, и экспериментальными результатами, полученными ранее. Такие несоответствия были разрешены с помощью сопоставления последовательности аминокислот ферментов, анализа литературы и уточнения полученной модели [16]. В работе автора было экспериментально показано, что нуклеозид цитидин является необходимым и достаточным компонентом питательной среды, для того, чтобы синтезировать все пиримидиновые нуклеотиды в клетке (ЦТФ, УТФ, ТТФ) [3]. Данные о метаболизме других видов микоплазм и первоначальные расчеты предполагали, что урацил может также служить предшественником для синтеза всех пиримидиновых нуклеотидов за счет реакции перехода УТФ в ЦТФ, катализируемой ЦТФ-синтазой [44]. Проведенные эксперименты показали, что наличие урацила в качестве единственного пиримидинового нуклеозида в питательной среде является не достаточным для культивирования молликут [3]. Поиск в геноме М. pneumoniae гена, кодирующего гомолог фермента ЦТФ-синтазы в других микоплазмах, в Е. coli и Lactococcus lactis, не дал никаких результатов. Тогда с помощью проведения реконструкции метаболизма, авторам удалось определить, что пиримидиновый метаболизм М. pneumoniae уникально отличается от других микоплазм отсутствием реакции перехода УТФ в ЦТФ, катализируемой ЦТФ-синтазой, и что цитидин является необходимым субстратом для культивирования этого организма [16].
Кроме возможности получить важные сведения о метаболизме организма на этапе разработки схемы метаболизма, реконструкция служит для сортировки отдельных белков в группы (относящиеся к одному метаболическому пути или белковому комплексу) и позволяет улучшить функциональную аннотацию генов [45]. Кроме того, реконструкция метаболизма обеспечивает платформу для визуализации и анализа любых «омиксных» данных.
Существует два основных подхода к реконструкции карт метаболизма. Один из двух основных алгоритмов реконструкции направлен на составление схемы метаболизма исходя из первоначальных данных аннотирования генома и последующее уточнение наличия ферментативных реакций. Второй алгоритм, который наиболее часто используются исследователями, состоит из первоначального уточнения функций ферментов и последующей реконструкции метаболических путей.
Наиболее информативным является первый алгоритм, заключающийся в построении схемы на основе первичной аннотации, так как он включает все возможные реакции, катализируемые ферментами [45]. Такой алгоритм состоит из следующих шагов: 1) создание метаболической схемы на основе автоматической аннотации; 2) проверка назначенных согласно аннотации реакций, включающая поиск ферментативных «пробелов» в метаболических путях; поиск аннотированных ферментов, способных катализировать реакции, соответствующие «пробелам» в схеме; проверку возможности утилизации или выведения всех конечных продуктов; описание транспортной системы, ответственной за импорт необходимых субстратов.
Начальный этап построения единой схемы метаболических реакций в первом алгоритме реконструкций проводится на основании аннотации генов организма. Почти все доступные последовательности генома в настоящее время систематически обработаны с помощью автоматизированных программ, которые идентифицируют кодирующие последовательности и функционально аннотируют гены. Исходя из данных функциональной аннотации генов, предполагаемым ферментам присваивают соответствующие катализируемые ими реакции. Интернет ресурсы, содержащие различные варианты биохимических данных, способствуют упрощению процедуры первичной реконструкции метаболизма. Существует два типа баз данных, (БД) содержащих необходимую информацию. Первый тип - фермент - ориентированные БД, которые предоставляют информацию о функциях ферментов, например BRENDA [46], SwissProt [47]. С помощью информации, предоставленной такими базами выявляются данные о дополнительных активностях аннотированных ферментов и их способности катализировать различные биохимические превращения в метаболическом пути. Другой тип БД - базы метаболических путей, содержащие описание биохимии метаболических процессов, например ЕсоСус, описывающая метаболизм кишечной палочки [48] или UM-BDD база данных, описывающая пути катаболизма у разных видов бактерий [49]. Такие базы данных позволяют выяснить все биохимические реакции, в которых участвует тот или иной метаболит и определить взаимосвязь между реакциями. Реконструкцию схемы метаболизма также можно проводить, используя уже имеющиеся реконструкции родственных организмов. Часто реакции группируются в метаболические пути или модули, которые сохраняются в нескольких организмах. Однако, несмотря на секвенирование и аннотацию геномов многочисленных микроорганизмов, функции многих генов остаются неизвестными и, наоборот, многие преобразования катализируются неизвестными ферментами. Кроме того, не всегда идентифицируются гены, соответствующие экспериментально охарактеризованным ферментам. Все это представляет собой значительное препятствие для создания точных моделей метаболизма, основанных на данных протеогеномной аннотации.
Второй этап реконструкции, заключающийся в уточнении полученной первичной реконструкции, является наиболее трудоемким. Существуют несколько минимальных требований к детализации, необходимой для реконструкции полной модели метаболизма бактерий.
Во-первых, метаболические пути должны быть представлены в соответствии с особенностями физиологии исследуемого организма. Например, первоначальная реконструкция метаболизма Lactobacillus plantarum предполагала, что сукцинил-КоА является субстратом для биосинтеза метионина в реакции, катализируемой сукцинилтрансферазой [50]. Экспериментально было показано, что клетки L. plantarum способны синтезировать метионин. Однако сукцинил-КоА не может быть синтезирован в клетках этого организма из-за неполной представленности ферментов цикла Кребса (цикла биохимических реакций, в процессе которых образуются основные предшественники биосинтеза). Это указывало на наличие противоречия между экспериментальными данными и данными первичной реконструкции, проведенной для этого организма при проведении аннотации генома. Анализ субстратной специфичности фермента сукцинилтрансферазы и его ортологов у других организмов показал, что ацетил-КоА может также выступать в роли субстрата для синтеза метионина [50]. Клетки L. plantarum способны синтезировать ацетил-КоА. Выявление подобных несоответствий, которые могут быть идентифицированы во всей метаболической сети, требует хороших знаний физиологии микроорганизма.
Обработка данных и интерпретация результатов анализа метаболитов
Обращенно-фазоеая хроматография (ОФХ) - это метод жидкостной хроматографии, в котором используют сорбенты, содержащие неполярные, как правило, длинные алкильные группы (С 18, С8, СЗ), и полярные растворители (например, водно-метанольные, водно-ацетонитрильные смеси). В методе ОФХ анализируемые вещества удерживаются на поверхности сорбента за счет размеров их молекул, дипольного момента, поляризуемости и гидрофобных свойств неполярной части молекулы [107]. В этом методе сорбция компонентов смеси происходит за счет сильного взаимного притяжения полярных молекул растворителя и вытеснения менее полярных молекул анализируемой смеси из полярной среды. При использовании метода ОФХ поверхность неподвижной фазы связывает вытесненные молекулы аналитов, ориентированные к ней гидрофобной частью и удерживает их слабыми дисперсионными силами. Применение обращено-фазовой хроматографии в качестве стандартного метода разделения полярных и неполярных метаболитов, несомненно, оправдано. Однако, обращенно-фазовая хроматография применима для разделения лишь высокомолекулярных слабозаряженных соединений, тогда так сильнозаряженные соединения (например: производные углеводов, нуклеотиды и компоненты цикла трикарбоновых кислот и др.) и низкомолекулярные слабозаряженные соединения не удерживаются на используемых сорбентах [108]. Большинство метаболитов являются сильно заряженными (как отрицательно, так и положительно) низкомолекулярными гидрофильными соединениями, поэтому обращено-фазовая хроматография не всегда применима к анализу метаболома.
Ион-парная хроматография - метод жидкостной хроматографии, в котором удерживание анализируемого иона обеспечивается динамическим модифицированием сорбента с помощью добавления ион-парного агента (модификатора) в подвижную фазу. В этом методе используется обращеннофазовый сорбент, который модифицируется группами, обладающими ионообменными свойствами. Например, для разделения оснований в качестве модификатора используют алкилсульфат натрия, в таком количестве, чтобы рН поддерживался в диапазоне от 2 до 5. Для разделения аналитов с кислотными свойствами применяют соли тетра-алкиламмония (фосфат тетрабутиламмония, бромид цетилтриметиламмония и др.). Таким образом, метод ион-парной хроматографии позволяет провести разделение как положительно, так и отрицательно заряженных соединений на неполярном сорбенте. Основным недостатком ион-парной хроматографии является выраженная зависимость воспроизводимости результатов от стабильности системы и практически необратимое загрязнение всех частей хроматографа модификатором. Поэтому, несмотря на существование публикаций, в которых описывается применение ион-парной хроматографии при анализе метаболитов, этот метод не получил широкого распространения в метаболомике [109].
Нормально-фазовая хроматография (НФХ) - это вариант жидкостной хроматографии, в котором подвижная фаза менее полярна, чем неподвижная, а основной фактор, определяющий удерживание - это взаимодействие аналитов с заряженными активными центрами сорбента. Разделение методом нормально-фазовой хроматографии осуществляется в результате взаимодействия вещества с полярными сорбентами, такими как силикагель или и оксид алюминия, имеющие на поверхности активные центры. В качестве элюента в нормально-фазовой хроматографии используют неполярные растворители, такие как н-гексан, н-гептан, изооктан с небольшой добавкой метанола, этанола или изопропилового спирта (1-10%). В основе сорбции на поверхности заряженного сорбента лежит специфическое взаимодействие между полярной поверхностью сорбента и полярными (или способными поляризоваться) группами молекул аналита. К таким взаимодействиям относят диполь-дипольное взаимодействие между постоянными или индуцированными диполями и образование водородной связи. Возможным и достаточно частым в практической работе является проявление необратимой сорбции компонентов смеси на сорбенте, которая может привести к значительному повышению времени удерживания, резкому снижению эффективности разделения веществ и появлению продуктов деградации сорбента. Практическое использование нормально-фазовой хроматографии крайне затруднено из-за низких относительных содержаний воды, содержащейся в растворителях, которая взаимодействует с адсорбционными центрами сорбента.
Гидрофильная хроматография (hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC) успешно применяется для разделения полярных, слабокислых или слабоосновных образцов [ПО, 111]. Этот метод можно охарактеризовать как нормально-фазовую хроматографию на полярных колонках в водных элюентах с добавлением органических растворителей (обычно используют ацетонитрил) [103]. Отличительной особенностью этого метода является возможность использования разнообразных сорбентов для разделения полярных веществ: может быть использован как немодифицированный силикагель, так и колонки на основе силикагеля, модифицированного амино-, амидо- , циано- , карбамат- , диол- и полиоловыми группами, а также цвиттерионные (сульфобетаиновые или холинатные, получившие особое распространение в последние годы) и другие полярные стационарные фазы, химически связанные с носителем из силикагеля (рисунок 1). В гидрофильной хроматографии используются как положительно заряженные (сепарирующая фаза колонки состоит из амино-пропилированного силикагеля), так и отрицательно заряженные разделительные сорбенты (колонки на основе немодифицированного силикагеля, полиоловые сорбенты) [112].
Также в гидрофильной хроматографии могут быть применены незаряженные хроматографические сорбенты, механизм удерживания аналита на которых заключается в образовании водородных связей. Например: циано -(водород связывает акцептор и не связывает донор) и амидные (водород связывается как с акцептором, так и с донором) силикагели. Некоторые полярные сорбенты демонстрируют гидрофобные свойства, которые позволяют разделить метаболиты, проявляющие слабые гидрофобные свойства наравне с полярностью [113].
Определение устойчивости культуры к кислотному воздействию
Попарное сравнение масс-спектрометрических метаболомных данных трех видов молликут между собой, а также сравнение метаболомов клеток одного вида, культивированных в оптимальных условиях и в условиях воздействия (кислотное и осмотическое) проводили с использованием онлайн сервиса XCMS [5]. Сервис XCMS включает предварительную обработку данных масс-спектрометрического анализа метаболитов, в том числе, этапы обнаружения масс-спектрометрических пиков веществ, фильтрации шумового сигнала в спектрах, нелинейной коррекции времени выхода веществ, сопоставления интегральных ионных интенсивностей сигнала между разными образцами и группами сравнения, обнаружение статистически достоверных отличий в двух группах данных и визуализацию результатов.
Для выделения масс-спектрометрических пиков, соответствующих ионам аналитов, в сервисе XCMS суммарный трехмерный (m/z, интенсивность, время удерживания) спектр делится на слои с интервалом 0.1 m/z, и каждый слой обрабатывается с учетом временных хроматографических характеристик и интенсивности сигнала в каждой точке хроматограммы. Определяется максимальное значение МС-сигнала в слое и временные границы изменения сигнала в одном слое. Обнаружение временных границ хроматографических пиков проводится с использованием второй производной функции Гаусса в качестве модели. Далее анализ данных сервисом XCMS включает этап отбора пиков аналитов по соотношению сигнал-шум. Рекомендованное наиболее эффективное значение соотношения сигнал/шум для отбора -10 [5].
После обнаружения сигналов аналитов в спектрах индивидуальных образцов данные соотносятся между разными образцами в группе повторов. Для коррекции времени выхода веществ используется сигнал анализируемого вещества с максимальной интенсивностью среди всех образцов. Коррекция времени выхода проводится с помощью отбора из выделенных ранее сигналов группы пиков, стабильно детектируемых во всех образцах. Такие сигналы используются в качестве временных стандартов. Алгоритм вычисляет среднее время удерживания вещества для каждой группы и отклонение от среднего времени для каждого образца в одной группе. На основе этих данных строится профиль отклонений времени удерживания. Полученный профиль отклонений используется для нелинейной коррекции времени удерживания исходных данных. Далее проводится вычисление характеристики сигналов (интегральная интенсивность пика), с использованием которой проводиться дальнейший статистический анализ данных. Для определения сигналов метаболитов, интегральная интенсивность которых значительно отличается в группах сравнения (например, контроль и опыт), проводился статистический анализ с использованием t-теста Уэлча (t-тест Уэлча позволяет учесть отличия в дисперсиях двух групп); отличия в метаболомах ранжировались по уровню значимости. Отличия в интегральной интенсивности сигналов между двумя группами МС-данных считались достоверными при уровне значимости (р-значение) не более 0,05. Следует отметить, что при обработке данных с помощью сервиса XCMS не поводилось нормализации интенсивности пиков, поэтому мы провели дополнительную количественную оценку изменения интегральной интенсивности сигналов, соответствующих значимым отличиям, с помощью нормализации площади хроматографического пика на суммарный ионный ток. Заключительным этапом анализа метаболома с помощью сервиса XCMS является визуализация результатов.
В соответствии с результатами анализа метаболомных данных были выбраны ферменты, для которых был проведен поиск аминокислотных замен в активных центрах. Мы сравнили последовательности активных центров выбранных ферментов у S. melliferum, М. gallisepticum, A. laidlawii, используя последовательности их гомологов в клетках E.coli и В. subtilis в качестве эталона при помощи алгоритма ClustalW, доступного на онлайн-ресурсе http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/. Мы использовали гомологичные белки из других организмов, если кристаллические структуры ферментов Е. coli или В. subtilis не определены. Для анализа аминокислотных замен в активных центрах анализируемых белков мы использовали базу данных PDB 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 4.1 Анализ метаболома бактерий A. laidlawii, S. melliferum и М. sallisevticum
Разработанный нами алгоритм анализа метаболома микоплазм включал следующие шаги: реконструкция карт метаболизма и составление списков возможных внутриклеточных метаболитов; анализ и детектирование метаболитов с помощью метода ВЭЖХ-МС/МС; обработка данных и интерпретация результатов.
Реконструкция метаболизма обеспечивает платформу для визуализации и анализа метаболомных данных. Мы выбрали наиболее информативный алгоритм реконструкции, заключающийся в построении схемы на основе первичной аннотации и последующем уточнении ферментативных реакций вручную. Полученная реконструкция позволяет составить списки возможных внутриклеточных метаболитов для обработки результатов анализа метаболома и визуализировать результаты метаболомного анализа для выявления механизмов регуляции в клетке. В результате обработки данных, полученных при анализе метаболома, мы получили список детектированных пиков. Каждому пику соответствует значение m/z иона вещества, которое мы сопоставили с соответствующими теоретическими значениями m/z метаболитов - провели идентификацию МС-пиков. Для идентификации пиков в спектре мы составили базу данных, которая содержит информацию о структуре веществ, точную массу молекулы и идентификационный номер для каждого метаболита. Для интерпретации визуализации полученных данных мы использовали реконструированные схемы метаболизма, позволяющие увидеть метаболические пути, их взаимосвязь и ферменты, катализирующие реакции. Также мы использовали базы данных KEGG и ЕсоСус, содержащие подробную информацию о каждом элементе метаболического пути, включая точную массу метаболита и его структуру [180]. Для визуализации полученных данных мы нанесли детектированные метаболиты на реконструкцию метаболома, что позволило увидеть каскады изменений и их взаимосвязь и сопоставить метаболомные результаты с различиями в репертуаре ферментов.
Реконструкция метаболизма позволяет визуализировать данные метаболомного анализа и составить списки метаболитов, входящих в состав клеток исследуемых видов молликут. В нашей работе был выбран алгоритм реконструкции, заключающийся в построении схемы метаболизма на основе первичной протеогеномнои аннотации и последующего уточнения наличия ферментативных реакций в схеме [45]. Для того, чтобы построить первичную метаболическую карту в соответствии с аннотированными ферментами для каждого вида, мы сопоставили результаты протеогеномнои аннотации трех исследуемых видов, опубликованные в базе данных UniprotKB [23, 175, 181] с общими метаболическими схемами из базы данных Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes [180]. Затем была составлена общая схема метаболизма для трех видов и проведено уточнение первичной реконструкции. Уточнение схемы метаболизма включает удаление реакций, которые не являются частью метаболических путей и приводят к образованию «мертвых концов»; поиск «пробелов» в метаболических путях; поиск аннотированных ферментов, способных катализировать реакции, соответствующие пробелам в схеме; проверку возможности утилизации или выведения всех конечных продуктов в клетке. Конечный результат представляет собой карты метаболизма трех видов молликут без «пробелов», изолированных реакций, или неполных метаболических циклов (см. рисунок 4-6). Полученные схемы метаболизма были дополнены с учетом данных метаболомного анализа.
Реакции, приводящие к образованию «мертвых концов» в схеме метаболизма
Фермент аденин фосфорибозилтрансфераза (Apt) катализирует перенос фосфорибозила с фосфорибозилпирофосфата на аденин с образованием АМФ и неорганического пирофосфата. По отношению к последовательности аденин фосфорибозилтрансферазы Apt в Е. coli HPRTECOLI аргинин в положении 29 (первый сайт связывания аденин фосфорибозилтрансферазы с АМФ) в белке М. gallisepticum Q7NBS4MYCGA заменен на тирозин R29Y, а во втором сайте связывания обнаруженная замена G132A (глицин на аланин) (см. Приложение 2). Поскольку кристаллическая структура фермента Apt для Е. coli и других бактерий в настоящее время не определена, мы использовали в качестве образца для выравнивания структуру фермента Leishmania donovani, однако сравнивали последовательность с гомологом из Е. coli. Интересно, что замена R29Y наблюдается в N-концевой части активного центра, необходимой для связывания AMP. При этом в метаболомном модуле М. gallisepticum определен максимум в виде аденина, который является субстратом для Q7NBS4MYCGA. Можно предположить, что одна из таких мутаций снижает активность связывания фермента. У S. melliferum определен максимум в виде пары аденин-АМФ, в отличие от М. gallisepticum и A. laidlawii, что косвенно указывает на увеличенную активность фермента L5VS29SPIME. Мы обнаружили две замены в активных центрах этого фермента: L27I и Т13IS (см. Приложение 2). Мы предполагаем, что одна из этих замен или обе замены могут быть связаны с усилением активности фермента и выработкой большего количества продукта.
Фермент Fba катализирует процесс расщепления фруктозо-бисфосфата с образованием глицерон-фосфата и глицеральдегид-3-фосфата. За утилизацию глицеральдегид-3-фосфата отвечает фермент глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (GapN или Gap). Поэтому накопление глицеральдегид-3-фосфата в М. gallisepticum и S. melliferum может быть следствием повышения активности фермента Fba или снижения активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. В последовательности фермента фруктозо-бисфосфат альдолаза (Fba) по отношению к Bacillus anthracis мы определили замену аминокислот V50A в Q7NAJ0MYCGA и G9XY54SPIME в М. gallisepticum и S. melliferum (см. Приложение 2). Мы не обнаружили замен в последовательностях Gap и GapN бактерий М. gallisepticum и S. melliferum, соответственно накопление глицеральдегид-3-фосфата не может быть вызвано слабой активностью утилизирующих белков и указывает на усиливающий активность характер мутаций в белке Fba.
Анализ накоплений метаболитов показал, что пиримидиновый модуль в клетках S. melliferum содержит следующие максимумы УМФ и ЦМФ, в клетках A. laidlawii -уридин и цитидин, а в клетках М. gallisepticum отсутствуют максимумы. Фермент уридинкиназа катализирует реакции фосфорилирования цитидина и уридина с образованием мононуклеотидов и ответственен за образование УМФ и ЦМФ. За накопление УМФ и ЦМФ может отвечать также фермент уридилаткиназа (РугН), синтезирующий УДФ и ЦДФ из монофосфатов. Данные указывают на повышающий активность фермента характер влияния аминокислотных замен в уридинкиназе или снижающий активность характер влияния аминокислотных замен в уридилаткиназе S. melliferum. Мы обнаружили (отностительно Т. thermophilus) мутации A16G в сайтах связывания субстрата в ферменте Q7NB32MYCGA бактерии М. gallisepticum и Y159F в ферменте G9Y068SPIME бактерии S. melliferum (см. Приложение 2). Мы обнаружили (отноститеьлно В. subtilis) мутации в сайтах связывания субстрата уридилаткиназы: для A. laidlawii - N137S в ферменте A9NHC4ACHLI и для S. melliferum - N137Q замену в ферменте G9XZS5SPIME. Так как мутации обнаружены и в ферменте, ответственном за расход УМФ, и в синтезирующем УМФ ферменте, сложно точно определить характер влияния этих мутаций в S. melliferum.
Мы определили накопление рибозо-5-фосфата в клетках A. laidlawii и множество замен в сайте связывания АТФ рибозо-фосфат-пирофосфокиназы во всех трех видах относительно структуры PrsA Е. colt R107A в Q7NAR0MYCGA, S108G в Q7NAR0MYCGA и G9XZ29SPIME; а также две замены в петле связывания фосфорибозил-пирофосфата M222I и L218M фермента A9NE81ACHLI (см. Приложение 2). Мутации PrsA, по-видимому, снижают связываемость с субстратами и активность протекания реакции в клетках М. gallisepticum и S. melliferum, а мутации в сайте связывания PrsA с фосфо-рибозил-пирофосфатом в A. laidlawii не влияют на активность. В сайте связывания субстрата транскетолазы G9Y039SPIME в клетках S. melliferum мы идентифицировали мутацию S384A (по отношению к последовательности Е. coli), однако трудно судить о ее характере, так как данных о накоплении метаболитов в этих клетках не имеется. Мы обнаружили мутации (отноститеьлно В. subtilis) в сайтах связывания с субстратом тими дин киназы (Tdk): в ферменте A9NEC0ACHLI A. laidlawii - V89A, С148Т, C183S, и Н186А и в ферменте G9XYA3SPIME S. melliferum- Н186С (см. Приложение 2). Тимидин накапливается только в клетках A. laidlawii, поэтому можно предположить снижение активности тимидин киназы A9NEC0ACHLI из-за многочисленных замен.
