Рестриктирующие компоненты системы хозяйской специфичности ДНК бактерий коли-дизентерийной группы Упорова Татьяна Марковна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА I. Обзор литературы 11

1. Биологические, энзимологические и генетические аспекты GXC у прокариот 11

1.1. GKC: обнаружение, свойства, распространение, функции 11

1.2. Номенклатура и классификация ферментов СХС 14

1.2.1. Ферменты П класса 15

1.2.2. Изомерия рестриктаз и метилаз 19

1.2.3. Ферменты I класса 21

1.2.4. Ферменты Ш класса 25

1.3. Генетические детерминанты СХС 26

1.3.1. Хромосомные СХС 27

1.3.2. Профаговые СХС 29

1.3.3. Плазмидные СХС 30

1.3.4. Распространение R -факторов в сем. Enterobacteriaceae 33

1.4. Заключение 35

2. Методы выделения и очистки специфических эндонуклеаз 36

2.1. Разрушение клеток ч 36

2.2. Удаление нуклеиновых кислот и балластных белков 38

2.3. Гельфильтрация 39

2.4. Ионообменная хроматография 43

2.5. Аффинная хроматография 45

2.6. Гидрофобная хроматография 50

2.7. Заключение 52

ГЛАВА 2. Материалы и методы 55

1. Материалы 55

2. Методы 56

ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 63

1. Объект исследования 63

1.1. Постановка проблемы и выбор объекта исследования 63

1.2. Культивирование штаммов-продуцентов рест-риктаз 65

2. Рестриктирующий компонент СХС Есо СК 68

2.1. Выделение и очистка рестриктазы Есо СК 68

2.2. Субстратная специфичность КЕСО ОК 8

2.3. Физическое картирование ДНК фага И 83

3. Рестриктирующий компонент СЕКС Sso 47 86

3.1. Выделение и очистка 86

3.1.1. Идентификация суммарной рестрикти-рующей активности аффинной хроматографией на голубой сефарозе . 86

3.1.2. Ионообменная хроматография 91

3.1.3. Очистка HSso и гидрофобной хроматографией на фенил-сефарозе 98

3.1.4. Изоэлектрофокусирование на амфолинах 102

3.1.5. Исследование ферментных препаратов ESSO I И Есо EI МеТОДОМ ЭЛеКТрО-

фореза в ПААГ 114

3.2. Свойства рестрикгирующих эндонуклеаз из штамма s.sonnei 47 И5

3.3. Специфичность RSso I и ESso II 122

3.3.1. Субстратная специфичность 123

3.3.2. Изучение первичной структуры участков узнавания RSso їй RSso и 126

3.4. Использование рестриктаз из s.sonnei 4-7 в генной инженерии 137

ГЛАВА 4. Обсуждение І45

Выводы 161

Список литературы 163

• GKC: обнаружение, свойства, распространение, функции
• Аффинная хроматография
• Культивирование штаммов-продуцентов рест-риктаз
• Изоэлектрофокусирование на амфолинах

Введение к работе

Одним из важнейших факторов, оказавших непосредственное влияние на стремительное развитие современной биологии, явилось открытие и изучение феномена GXC. Выделение ферментов рестрикции и модификации, составляющих энзимологическую основу СХС, позволило принципиально изменить методологические подходы к решению многих как фундаментальных, так и практических задач.

С точки зрения фундаментальных исследований, ферменты рестрикции-модификации представляют удобную модель для изучения механизма узнавания белковыми молекулами специфических последовательностей нуклеотидов в ДНК, что является основой большинства важнейших биологических процессов, таких как регуляция экспрессии генетической информации, регуляции действия стероидных гормонов в эукариотах и т.д. Модифицирующие метилазы могут быть использованы для введения естественной биологической метки в молекулы ДНЕ и создания таким образом молекулярных "зондов" клетки, что необходимо при изучении процессов, происходящих in vivo.

На сегодняшний день из двух составляющих СХС наибольшее практическое применение нашли рестриктазы. Необычайно широко использование рестриктирующих эндонуклеаз в генной инженерии и других областях молекулярной биологии, связанных с определением первичной структуры ДНК, рестрикционным анализом, выделением регуляторних областей геномов и индивидуальных генов и созданием гибридных молекул с последующей их экспрессией в гетерологич-ных условиях. Без проводимых на молекулярном уровне исследований микробной клетки невозможно современное развитие медицинской микробиологии, которое имеет своей целью создание биотехнологическими методами искусственных вакцин и других лекарственных средств.

В связи с вышесказанным, задача обнаружения и идентификации новых СХС приобрела большой практический смысл, т.к. новые системы рестрикции-модификации предоставляют исследователям возможность расширить арсенал ферментов, необходимых для осуществления насущных практических задач.

Цель и задачи работы

Объектом данного исследования служили бактерии коли-дизен-терийной группы, содержащие СХС: штамм е.соіі ск , содержащий СХС Есо СК, идентифицированную ранее /217/ и штамм Shigella soimei 47 , в котором GXC Sso 47 была обнаружена нами совместно с М.й.Тедиашвили /19/. Предметом исследования являлась энзимо-логическая основа СКС и, в частности, рестриктирующий компонент этих систем.

Цель работы состояла в биохимической идентификации, выделении, изучении специфичности и свойств ферментов рестрикции из е.соіі ок и s.sonnei 47, а также подбор оптимальных условий для их использования в генной инженерии и биотехнологии.

Для достижения поставленной в работе цели необходимо было решить следующие задачи:

1. разработать индивидуальные методы очистки для каждого фермента - рациональные, технологичные и пригодные для передачи в производство;

2. изучить субстратную и сайт-специфичность ферментов рестрикции, используя различные подходы, как то: характер фрагментации тесторных ДНК с построением физической карты ДНК фага Л для ЕЕсо ок и прямое определение нуклеотидной последовательности

в сайте узнавания;

3) изучить структуру фрагментов рестрикции и оптимальные
условия ферментативной реакции;

4) в случае рестриктирующего компонента СХС из штамма s.sonnei 47 - изучить возможность выделения рестриктаз(ы) из непатогенного продуцента.

Научная новизна

В настоящей работе впервые проведено детальное биохимическое исследование рестриктирующих компонентов трех новых СХС: Eco ск, Sso 47 I и Sso 47 II. Для REco ок разработана схема получения особо чистого препарата фермента, пригодного для исследования тонкой структуры ДНК. С помощью полученного препарата ЕЕсо ок впервые проведено физическое картирование ДНК фага Л и изучена субстратная специфичность фермента по отношению к тесторным ДНК. На основании полученных результатов показано, что фермент не имеет аналогов и является уникальным по характеру фрагментации тесторных ДНК.

Впервые в дизентерийном штамме идентифицирована рестрикти-рующая активность, которая представлена двумя рестриктазами RSso I и RSso II , соответствующими двум СХС. Использование метода изоэлектрофокусирования на амфолинах при выделении RSso і позволило впервые получить RSso і , а также его изошизомер Eco RI в состоянии, свободном от мелкощепящей, так называемой "штриховой" активности. Выделение в чистом виде рестриктирующей эндонуклеазы RSso її позволило установить, что sso и характеризуется новой специфичностью гидролиза ДНК, что делает ее отличной от ранее изученных ферментов рестрикции.

Практическая ценность

В результате проведенных исследований разработаны рациональные методы получения трех препаратов специфических эндонук-леаз - Есо ок, Sso I и Sso II, пригодных для тонких структурных исследований различных геномов. Из этих ферментов Eco СК

- 10 -и Sso и не описаны в литературе, a sso і является изошизоме-ром рестриктазы Есо ri . Ферменты Sso і и Есо RI выделены по новой, разработанной нами схеме; полученные препараты отличаются уникальной чистотой от фирменных препаратов Есо ri , полученных по стандартным схемам.

По материалам наших исследований на способ получения REco СК оформлено МРТУ, на основании которого налажено мелкосерийное производство этого фермента в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова МЗ СССР.

На способ получения REco ск получено авторское свидетельство.

В настоящее время производство REco ск внедрено в НПО "Биохимреактив" в г.Спайне.

Разработан способ получения фермента RSso її из непатогенного продуцента Е.соїі .

- II -

ІЯАВА І ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

І. Биологические, энзимологические и генетические аспекты СХС .у прокариот

І.І. ОСС^обнаруженивд. свойства^ даспдостанение функции

Одним из важнейших естественных защитных барьеров у большинства бактерий служит система хозяйской специфичности ДНК* История обнаружения СХС у бактерий подробно рассматривается в большом количестве обзоров и проблемных статей /2,27,29,35,36, 37,122,153,155,172/. В связи с этим мы остановимся на рассмот-рении лишь основных этапов исследования этой проблемы. Впервые СХС были идентифицированы как биологический феномен и целенаправленно исследованы в начале 50-х годов /61,140,141/. Авторы провели анализ взаимодействий фаг-клетка и продемонстрировали вариабельность в способности роста фага Я на клетках е.соіі К и С при перекрестном титровании его на этих штаммах. Было показано, что эффективность роста фага зависит от его последнего хозяина, и на этом основании высказано предположение, что в основе явления ограничения, или защиты, и модификации фаговой ДНК лежат существующие в клетке определенные механизмы. Интенсивные исследования СХС позволили Арберу к середине 60-х годов доказать, что основой модификации является метилирование, а основой рестрикции - гидролиз ДНК /38,176/. Была принята осново-полагающая концепция двухкомпонентной ферментной системы - энзи-мологической основы СХС, представленной рестриктирующей эндонук-леазой и модифицирующей метилазой. Эндонуклеаза узнает специфи-

ческую последовательность оснований в молекуле ДНК, состоящую из 3-7 нуклеотидов и представляющую собой так называемый сайт узнавания, и затем осуществляет разрыв цепи ДНК в этом участке молекулы, гидролизуя ФДЭ связи между нуклеотидами. Фермент модификации узнает тот же самый сайт и метилирует один из его нуклеотидов таким образом, что ДНК оказывается защищенной от.действия собственного фермента рестрикции соответствующей специфической модификацией. При этом любая чужеродная ДНК может стать объектом рестрикции данного типа, т.к. она не защищена соответствующей модификацией. В результате проведенных Меселсоном /152/ биохимических экспериментов были выделены первые рестрик-тирующие эндонуклеазы Есо К и Есо В из штаммов E.coli к и Е.со-И в _# с этого времени началось интенсивное изучение биохимии СХС. Интерес к СХС еще более усилился после выделения Смитом фермента рестрикции П класса /200/, определения узнаваемой этим ферментом нуклеотидной последовательности /128/ и использования его для анализа ДНК /81/. В 1972 г. посредством соединения фрагментов ДНК, полученных в результате действия рестриктазы Есо ж, была получена первая рекомбинантная ДНК /151/. Далее последовало бурное развитие генной инженерии благодаря интенсивному использованию ферментов рестрикции и поиску и выделению новых рестриктаз и их источников, а соответственно, и новых СХС.

Обзор литературы, отражающей проблемы, связанные с СХС, показывает, что системы рестрикции-модификации ДНК (r⁺m⁺) широко распространены в царстве прокариот /36,172/. К 1971 году СХС были обнаружены у представителей 8-ми родов микроорганизмов, включая как грам-положителыше - Bacillus, Streptococcus , так И грам-отрицательные бактерии - Salmonella, Escherichia. На основании этих данных Бойер /68/ постулировал общность механиз-

- ІЗ -ма рестрикции-модификации у прокариот. В настоящее время присутствие СХС обнаружено, преимущественно с помощью биологических тестов, у представителей уже 38 родов бактерий, в том чис-

*

ле у таких высокопатогенных микроорганизмов, как возбудители чумы /6/, дифтерии /119/, дизентерии /8,19/. Из этих родов микроорганизмов наиболее продуктивен род Haemophilus : из 29 штаммов этого рода выделено 22 фермента рестрикции /172/. Довольно много специфических эндонуклеаз предоставили исследователям представители семейства Enterobacteriaceae: Escherichia, Salmonella, Proteus, Providencia, Enterobacter и другие /174,221/. Однако СХС, которым соответствуют выделенные ферменты рестрикции, не всегда всесторонне охарактеризованы как в отношении модифицирующего компонента системы, так и генетического детерминирования.

СХС с г⁺ и т⁺ системами обнаружены пока только у бактерий и фагов. В то же время сайт-специфические эндонуклеазы обнаружены и у сине-зеленых водорослей, также входящих в царство прокариот /84,120,121,124/» Вопрос о присутствии соответствующих модифицирующих метилаз у сине-зеленых водорослей не изучен. Специфические эндонуклеазы найдены и в ряде эукариотических клеток: у хламидомонады и тетрахимены /52/, в семенниках зеленой мартышки /70/, в культуре клеток BHK-I2 китайского хомячка /71,

82,204/.

СХС у прокариот следует рассматривать, как видо- и даже штаммоспецифические системы, защищающие клетку от внедрения в нее чужеродной генетической информации в виде вирусной, плазмид-ной или бактериальной ДНК. Одновременно о. защитной функцией система специфической рестрикции обеспечивает клетку материалом для рекомбинации, что для прокариот, лишенных регулярного полового

- 14 -процесса, весьма важно с эволюционной точки зрения. Полученные Чаш? и Коэн /74/ экспериментальные результаты позволили сделать заключение, что по крайней мере некоторые ферменты рестрикции образуют вместе с ДНК-лигазой клетки систему, осуществляющую сайт-специфическую рекомбинацию. Эти данные позволили авторам предположить, что эндонуклеазы рестрикции играют важную роль в эволюции плазмид, а возможно и хромосомного генетического материала. С другой стороны, системы рестрикции-модификации являются важным фактором половой изоляции и залогом существования вида как дискретной генетической единицы.

1.2. Номенклатуа_и_классифрацляJ^epMєніхш_СХС_ Для обозначения рестриктаз и метилаз принята номенклатура, предложенная Смитом и Натансом в 1973 г. /199/. Согласно этим авторам, ферменты GKC обозначают в соответствии с названием вида микроорганизма, из которого фермент выделен. Например, принадлежность к E.coli обозначается как Есо. Если один вид (штамм) бактерии содержит несколько ферментов рестрикции и модификации, то последние дополнительно обозначаются римскими цифрами, например, 2та і, Хтаїї.Если ферменты выделяют из разных штаммов одного вида, то к названию добавляется обозначение штамма, например, Есо В. При этом рестриктаза из этого штамма обозначается ЕЕсо в , а метилаза - М Есо В. Эта же номенклатура применительно к GKC е.соіі в будет выглядеть таким образом:

^ЕЕсоВ ^{и М}ЕсоВ"

Классификация ферментов GXC представляет собой в основном классификацию, основанную на свойствах рестриктаз и лишь по аналогии распространяемую на метилазы. Бойер /68/ предложил деление рестриктаз на 2 класса. В основу классификации положены три фактора: каталитические свойства фермента, включашщй прост-

- 15 -ранственные отношения между сайтом узнавания и местом гидролиза ФДЭ связи; потребность в кофакторах для проявления активности; структура молекулы фермента. Классификация Бойера в основном сохранилась до настоящего времени. Единственная корректива, внесенная новыми экспериментальными данными в эту общепринятую классификацию, состоит в выделении из I класса ферментов отдельной Ш-ей группы (см. ниже).

I.2.I. Ферменты П класса. В самой многочисленной и наиболее широко используемой группе ферментов П класса рестриктазы гидролизуют ФДЭ связи в пределах сайта узнавания, либо, что встречается реже, как мьо и, Xga і и некоторые другие, - на строго фиксированном расстоянии от сайта, не превышающем, как правило, 8-Ю нуклеотидов /174/. В результате исчерпывающего гидролиза образуется стабильный набор дискретных фрагментов. На этом свойстве основано использование ферментов рестрикции П класса для рестрикционного анализа ДНК и получения индивидуальных генов для клонирования /159,172,174,195/. Сайты узнавания ферментов П класса представляют собой симметричные (с осью симметрии 2-го порядка) или несимметричные 3-7-членные последовательности нуклеотидов /164,174,197/. Так, например, рестрик-таза Bam НІ узнает палиндром S^^ITATI^.^' , а фермент Mstn гидролизует несимметричную последовательность S^^INArF..^'. Модификационное метилирование во всех случаях происходит в сайте узнавания. Например, МЕсо зхп метилирует второй цитозиновый остаток в сайте узнавания 5^,...IЩ()IT...З^,. Рестриктазы и ме-тияазы представляют собой белки, различные по свойствам и мол.

2+

массе. Единственным их кофактором является Mg , а в случае метилаз необходимо также присутствие донора метильных групп sam . Показано, что присутствие Mg²⁺ необходимо на стадии

гидролиза ДНК ферментом рестрикции и необязательно при связывании с субстратом /104,117,219/. Установлено /219/, что рестрик-таза Есо ее , например, присутствует в растворе в форме мономера с мол.массой 29 000 Д, а при добавлении субстрата димери-зуется. Для Есо ее, Bst 1/76/, Bam ЕЕ /198/ показано, что каталитической активностью обладают димерные молекулы. Относительно активности тетрамерных форм, также присутствующих в препаратах этих рестриктаз, однозначного ответа пока нет /180/. Однако по последним данным /218/, две субъединицы тетрамерной молекулы ЕЕсо ее взаимодействуют с сайтом узнавания фермента и гидро-лизуют его, а другие две субъединицы или же совсем не связываются с молекулой субстрата, либо взаимодействуют с пониженной специфичностью. Данные о субъединичном строении молекул рестриктаз согласуются с предложенной гипотетической моделью механизма рестрикции симметричных сайтов: гидролиз ДНК осуществляют две идентичные субъединицы рестриктазы, которые располагаются симметрично относительно оси 2-го порядка и производят разрывы в противоположных цепях /197/. В подтверждение этой модели было показано, что комплекс ЕЕсо ЕЕ с участком узнавания обладает симметрией 2-го порядка /138/. При этом молекула фермента при связывании с участком узнавания располагается в обеих бороздах спирали ДНК.

Метилаза Есо ЕЕ активна в форме мономера /178/, и как предполагают авторы, механизм взаимодействия месо ei _с участком узнавания в молекуле ДНК отличается от такового для ЕЕсо ЕЕ.

При гидролизе ДНК специфическими эндонуклеазами могут образоваться три типа фрагментов: I) фрагменты с "тупыми" концами, когда разрыв ФДЭ связи происходит непосредственно по оси симметрии сайта, как, например, имеет место при действии рестриктазы

Bal і: 5'...ТГГ*ІЩА...З*; 2) фрагменты с выступающими односпи-ралышми, так называемыми "липкими" 5'-концами, характерные для большинства рестриктаз, например, Kftm ж , гидролизующей последовательность 5'... ГАТЦ...З'; 3) фрагменты с "липкими" З'-концами, образующимися, например, при действии RPst І на участок 5'...ЦТГЦА Г...З'. Причем разрыв всегда происходит с образованием 5'-фосфорильной и З'-тидрокеильной группы, Рест-риктазы П класса различаются по механизму гидролиза ДНК /89/» Так, для рестриктаз Есо ні и Hind Ш показано, что разрыв в противоположных цепях молекулы ДНК в сайте узнавания происходит поочередно и представляет собой две независимые реакции /III, 156,180/. Рестриктазы Sal і и Ват ке, наоборот, гидролизугот обе цепи одновременно /III/. При низких температурах у рестриктаз Есо HI И Bam КЕ ПРОИСХОДИТ ДИССОЦИЭЦИЯ СВЯЗИ фЄрМЄНТ-Суб-

страт после образования каждого "ника" /156,179,198/. В целом, для наиболее хорошо изученной рестриктазы Есо RI доказана относительно медленная оборачиваемость фермента, составляющая около 0,72 мин""¹ при 30С. При 37С число оборотов равно 4-м двойным разрывам ФДЭ связи в минуту, что соответствует \ , равной Ю""⁹М /156,183/. Предполагается, что остальные рестрик-тазы П класса ведут себя аналогичным образом.

Многочисленные исследования, выполненные на REco ri , свидетельствуют, что хотя возможность гидролиза ДНК этим ферментом однозначно определяется наличием сайта узнавания 5'...Г ААТТЦ... 3', тем не менее скорость гидролиза данного сайта узнавания зависит от его ближайшего нуклеотидного окружения и локальной третичной структуры этого участка ДНК /59,126,131,183,212/. Аналогично, для RPst і показано, что устойчивость сайту 5'...ЦТГЦА Г ...3* придает его ГЦ-окружение /40/. Изучение кинетики связыва-

олиго ния КЕсо юс с различными синтетическими нуклеотидами показало, что молекула касо ri прочно связывается с нуклеотидной последовательностью, содержащей участок узнавания фермента. При этом фермент взаимодействует в общей сложности с 10-ю пуриновими остатками, расположенными как непосредственно в сайте узнавания, так и примыкающими к последнему /138/.

Для некоторых рестриктаз П класса продемонстрировано изменение их специфичности в зависимости от условий реакции, а именно: при понижении ионной силы среды, повышении рН до 8,5 , повышении концентрации глицерина, замене ионов 1% * на Mn²⁺ . В этих условиях ферменты узнают и гидролизуют в молекуле ДНК так называемые вторичные сайты. Известно, что подобным свойством обладает целый ряд рестриктаз, в частности Есо ri, Bst і, Bsu RI и Bam HE/76,100,101,116,118,146,207,228/. Причем, если вторичные сайты для Bam шпредставляют собой нуклеотидные последовательности с вырожденностью одного из 4-х внутренних нук-леотидов канонического сайта - 5'...Г ГАТІЩ...З', то для остальных рестриктаз изменение специфичности объясняется узнаванием более короткой нуклеотидной последовательности, которая является внутренней областью сайта узнавания. Так, сайт 5'...Г\ААТТЦ

...3* э узнаваемый Есо ri , для Есо ri¹ трансформируется в

J т

последовательность 5'... ААТТ...З'. Bsu Ri^x вместо последовательности 5'...IT ОД...3* гидролизует динуклеотид Г'Ц. Изменение специфичности фермента Bst І в соответствующих условиях проявляется иначе, чем у Ват НЕ , хотя Bst I и является изоши-зомером последнего, и выражается в узнавании, так же как и у

т т

Есо ш. и Bsu ri^x , более короткого участка, соответствующего внутренней области сайта узнавания. Подобную релаксацию специфичности рестриктирующих ферментов в присутствии глицерина

- 19 -Кларк /76/ объясняет тем, что в этих условиях ослабевают гидрофобные взаимодействия, которым приписывают решающую роль в процессе узнавания субстрата рестриктирующими ферментами. По мнению большинства авторов /66,7^,100,156/ каноническая и мелко-щепящая активности являются свойствами одной и той же белковой молекулы, т.к. I) эти активности нельзя разделить даже при многостадийной процедуре очистки, 2) очищенный до гомогенного состояния препарат рестриктазы также обладает мелкощепящей активностью. Другая группа авторов придерживается другой точки зрения /91/ и' считает, что "штриховая" активность в случае, по крайней мере Eco RI фермента, является второй активностью с иной , а не релаксированной канонической специфичностью.

Предпринимаются попытки исследовать активные центры ферментов рестрикции. Показано, что добавление ингибиторов сульфгид-рильных групп, в частности, ПХМБ, не влияет на действие рестриктаз Eco RI, sal GI,Bgl И и Нра II; наоборот, у Hind III,SstI, Bam HI, Pvui отмечена четкая зависимость активности от сохранения нативного состояния SH-групп в их молекуле /158/. Для ЕЕсо RI показано, что модификация в каждой субъединице лишь одной карбоксильной группы при обработке водорастворимым карбоди-имидом приводит к инактивации фермента, т.к. затрагивает, по-видимому, активный центр фермента /137/.

1.2.2. Изомерия рестриктаз и метилаз. Для рестриктаз П-го класса характерно явление изошизомерии. Существует целый ряд ферментов рестрикции, выделенных из различных источников, которые узнают и гидролизуют ДНК в пределах одной и той же последовательности нуклеотидов. Такие ферменты по предложению Робертса /172/ были названы изошизомерами. "Истинные" изошизомеры гидролизуют одинаковую последовательность и в одних и тех же точках.

Так, например, ферменты Нар II, Нра II, Мпо I вносят идентич-

1 ный разрыв в последовательность 5Ч..Ц ЦТГ...З'. Однако среди

изошизомеров иногда встречаются случаи ложной изошизомерии, когда ферменты узнают одну и ту же последовательность, но гидроли-зуют ее в разных точках. Примером такого вида изошизомеров служат рестриктазы Sma I и йпа I. В случае RSaa I сайт узнавания гидролизуется следующим образом 5'...Ц ІЩИТ...З' с образованием фрагментов, несущих 5»-концевой односпиральный тетранук-

леотид. RSma І гидролизует ту же последовательность по оси сим-

1 метрии 5Ч..ЦЦЦ^ТНТ...З' с образованием "тупых" концов. Наличие

большого числа изошизомеров /174/ предоставляет исследователям возможность выбора наиболее оптимального штамма-продуцента. Так, существует группа изошизомеров фермента Нае III , узнающих одну и ту же последовательность 5'...ТГЩ..*3'. В этой группе наиболее продуктивным из 6 различных источников фермента с указанной специфичностью является H.aegyptius , который содержит столь высокое количество фермента, что RHae III, выделенного из 10 г пасты, оказывается достаточно для гидролиза 10 г ДНК /172/.

Аналогично изошизомерии рестриктаз, для метилаз также было обнаружено явление изомерии, причем как истинной, так и ложной. Так, метилаза цитозина, кодируемая геном mec , защищает от рестрикции Есо Еіі-типа фаг Л , выращенный в клетках E.coli KI2 /144,145/, E.coli мне 600 /3/, а также на клетках E.coli, несущих Rll-плазмиду, т.к. ген тес присутствует во всех перечисленных культурах. При этом метилирование затрагивает один и

* д тот же, а именно второй цитидиловый остаток в сайте 5'...1Щ(ж)1Т

...3'. При изучении метилаз цитозина из клеток E.coli окНиколь-ской И.И. с соавт. /85/ была обнаружена метилаза, которая узнает такую же последовательность нуклеотидов, что и метилаза RII-

-21-типа, но метилирует в ней 5'-концевой цитозин, не обеспечивая защиты от RII рестрикции. На основании этих результатов авторами был сделан вывод о явлении изомерии метилаз и введен термин "изометимерия" /16/.

1.2.3. Ферменты I класса. В соответствии с принципами, положенными в основу классификации ферментов рестрикции, к I классу относятся рестриктазы Есо В, Есо К и, возможно, Есо А /68, 139,172/. Эти ферменты узнают специфические нуклеотидные последовательности, но неспецифичны в отношении места гидролиза; разрывы, осуществляемые этими ферментами, расположены в молекуле ДНК на неопределенном расстоянии от сайта узнавания. Для фермента REco к, имеющего 5 сайтов узнавания на ДНК фага Л , идентифицировано три области преимущественного гидролиза этой ДНК, которые расположены в участках, соответствующих 25, 45-54 и 81-90 единицам физической карты ДНК фага Л и имеют протяженность в 3-4 килобаза /233/. Область, соответствующая 91-100 единицам физической карты этой ДНК, гидролизуется REco к с весьма низкой эффективностью. При этом 2/3 генома фага А вообще практически не чувствительны к рестрикции Есо К типа. На основании этих данных Юань /233/ делает вывод, что хотя гидролиз ДНК ферментом Есо К и нельзя считать специфическим, однако все же он не является и абсолютно случайным. Продукты гидролиза ДНК ферментами I класса имеют гетерогенный характер, что обусловливает непригодность этих рестриктаз для генно-инженерных целей.

Показано, что ферменты I класса представляют собой сложные высокомолекулярные комплексы, молекулярный вес которых составляет 300-400 КД. Месельсон с соавт. /152/, первыми выделившие рест-риктазу из штамма в.ооїі к, на очищенном в 5000 раз препарате фермента показали, что REco к проявляет активность в присутст-

- гг -

вий кофакторов: АТФ, sam и ионов Щ²* . Идентичные свойства были продемонстрированы для МЕсо к /36,169/.

Поскольку гидролиз ДНК рестриктазами I класса происходит на неопределенном расстоянии от участка узнавания, то ДНК после рестрикции сохраняет способность к метилированию одноименной метилазой, что свидетельствует о сохранении сайта узнавания. Этот результат полностью противоположен тому, который наблюдается для ферментов СХС П класса: воздействие рестриктазы делает невозможным последующее метилирование ДНК.

Сайты узнавания для ферментов рестрикции-модификации Есо К и Есо В систем имеют сходную структурную организацию и резко отличаются от таковых для ферментов П класса /182,222/. Узнаваемые последовательности для обоих ферментов несимметричны и содержат по два домена, один из которых состоит из 3, а другой -из 4-х специфических нуклеотидов. В обеих системах I класса домены разделены последовательностью вырожденных нуклеотидов, которая в случае Есо В состоит из 8 пар оснований /182/, а в случае Есо К - из 6 /222/. На основании данных по структуре сайтов узнавания для Есо К и Есо В систем Юань /233/ делает вывод о расположении доменов на одной стороне спирали ДНК, что определяет асимметричный характер взаимодействия фермента с молекулой субстрата. Данные о структурном сходстве узнаваемых Есо К и Есо В ферментами последовательностей, рассмотренные в совокупности с результатами генетических и функциональных экспериментов, на которых мы остановимся ниже, подтверждают вывод о родственности этих систем и обусловливают сходство механизма действия этих ферментов.

Долгое время вопрос о механизме действия оставался нерешенным. Анализ накопленных данных позволил дать подробный раз-

бор механизма реакций рестрикции и метилирования, осуществляемых ферментами I класса и объяснить роль кофакторов в этих реакциях /233/. Гидролиз ДНК ферментами Есо К и Есо В происходит в несколько этапов. В первую очередь фермент взаимодействует с SAM , который является аллостерическим эффектором реакции /108, 110,234/- Молекула фермента имеет, по крайней мере, три участка для связывания sam . Следующим важным этапом реакции рестрикции является активация молекулы фермента. Было показано, что мутация узнающей субъединицы препятствует активации /109/. В результате образуется специфический фермент - субстратный комплекс. Характерно, что такие комплексы образуются как с немодифициро-ванной, так и модифицированной ДНК, но они могут быть дифференцированы на основании их стабильности: период полужизни для комплекса с модифицированной ДНК составляет 6 мин., с ^модифицированной - 22,5 мин. /157/* Следующий этап реакции представляет собой взаимодействие специфического фермент-субстратного комплекса с АТФ. С помощью электронной микроскопии показано, что в присутствии АТФ фермент отделяется от модифицированной ДНК /62/. В случае немодифицированной ДНК, АТФ способствует трансформации активированного фермента в другую, так называемую Есо К⁺ (Есо В⁺) форму. Последняя характеризуется тем, что она освобождается от SAM и, в отличие от специфического комплекса, имеет меньшие размеры, возможно, в связи с утратой одной или более субъединиц. По всей вероятности, именно этим объясняется отсутствие оборачиваемости рестриктаз I класса /90,110,134/. Предпоследним этапом реакции рестрикции является транслокация молекулы субстрата ферментом /235/ до тех пор, пока не будет достигнуто место гидроли-за. Таковым по гипотезе авторов является второй, значительно более короткий участок в молекуле ДНК. Таким образом, ферменты 1-го

- 24 -класса должны взаимодействовать с ДНК в двух различных сайтах -узнавания и рестрикции. При контакте с сайтом гидролиза молекула фермента вносит одиночный разрыв в одну из цепей ДНК /139/. Вслед за этим за счет доказанной экзонуклеазной активности ферм-мента Есо В образуются короткие "бреши" в ДНК, при встрече фермента с которыми транслокация прекращается /129/. Это служит сигналом для присоединения к связанной молекуле фермента второй молекулы, которая завершает реакцию рестрикции, гидролизуя про-, тивоположную цепь. На основании предложенной модели удалось объяснить характерное свойство фрагментов рестрикции ферментов 1-го класса: 5'-концевые нуклеотиды фрагментов, не поддающиеся, как известно, стандартной процедуре фосфорилирования^ /172/, оказываются эффективно защищенными от действия полинуклеотидкиназы 3* односпиральными протяженными участками, которые образуются в результате формирования "брешей" в процессе рестрикции. Фермент вслед за разрывом ДНК превращается в эффективную АТФ-азу /36,172, 177/. Такая конверсия фермента согласуется с данными об исчезновении нуклеолитической активности фермента.

Механизм реакции модификации также можно подразделить на несколько стадий, первые три из которых являются общими с механизмом рестрикции /233/. Ферменты МЕсо К и МЕсо В по окончании реакции присутствуют в активной форме, что свидетельствуют об оборачиваемости М Есо К и М Есо В. При воздействии метилаз К и В типов на неметилированную ДНК время одного оборота фермента крайне медленное (7 часов), тогда как метилазы этого класса метилируют в течение нескольких минут гетеродуплексную ДНК, у которой одна цепь уже была метилирована по данному типу хозяйской специфичности, - т.е. этот процесс происходит со скоростью, сравнимой со скоростью гидролиза ДНК рестриктазой /90,134,184/« Дна-

- 25 -логичный механизм действия ферментов рестрикции-модификации I класса, вероятно, имеет место и in vivo , что подтверждается биологическими данными /163/, свидетельствующими о значительном падении рестрикции у клеток, массированно зараженных немодифи-цированным фагом. По мнению Кан с соавт. /222/ причины аномальных особенностей ферментов I класса заложены в природе их сайтов узнавания, которые резко отличаются от таковых для ферментов П класса. Различный механизм действия этих ферментов может иметь определенный биологический смысл, который авторы видят в том, что рестриктазы I класса, возможно, могут участвовать в некоторых клеточных функциях, отличных от функции деградации чужеродной ДНК.

1.2*4. Ферменты Ш класса. К Ш классу ферментов СХС относятся Eco PI, Eco PI5, Hinf III и Hine 1/127,165,174/- По структурно-функциональным свойствам эти ферменты являются промежуточными между I и П классами. Они состоят из двух субъединиц (рестриктирующей и метилирующей), осуществляющих и гидролиз ФДЭ связей, и введение метильной группы одновременно /171,233/. Молекулярный вес ферментов Ш класса составляет в среднем около 200 кД. Большая субъединица ответственна за рестриктирующую активность, меньшая осуществляет метилирование. Ферменты Ш класса гидролизуют ДНК в присутствии ионов Mg²⁺ и АТФ, метилируют немодифицированную ДНК в присутствии SAM ; АТФ лишь стимулирует реакцию метилирования. Для ферментов Ш класса показана очень слабая АТФ-азная активность по сравнению с рестриктазами I класса. В отличие от последних, ферменты Ш класса расщепляют ДНК на строго фиксированном расстоянии от сайта узнавания, обычно не превышающем 30 нуклеотидных пар. В результате образуется стабильный набор фрагментов, постоянный для данной ДНК, хотя гидро-

- 26 -лиз редко доходит до конца из-за сопутствующего метилирования. Характерно, что ферменты Ш класса метилируют лишь одну цепь ДНК, что определяется структурой их сайтов узнавания. Последние представляют собой 5- или 6-членные несимметричные последовательности нуклеотидов /86,113/. В процессе репликации генома модифицирующая субъединица становится частью реплицирующегося комплекса и защищает вновь синтезированную ДНК от действия эндогенной ре-стриктазы /233/.

Изложенные выше сведения о ферментах рестрикции и модификации ограничены в основном данными, имеющими прямое отношение к биохимии этих ферментов. Однако наиболее полно СКС могут быть охарактеризованы лишь при комплексном подходе к их изучению, включающем наряду с биохимическим, также и генетический аспект проблемы СКС.

1.3. Гене тиче ские__детерминанты GXC

Как было отмечено в предыдущем разделе, СКС обнаружены у широкого круга микроорганизмов. Однако в качестве объектов пристального генетического исследования систем рестрикции-модификации были использованы различные штаммы E.coli . По этой причине, а также потому, что объектом нашего исследования также является данная группа микроорганизмов, мы остановимся более подробно на генетических аспектах СКС и взаимоотношениях на этой основе внутри сем. Enterobacteriaceae . У наиболее известных колийных СКС Есо К, Есо В, Есо А рестрикция и модификация контролируются хромосомными генами, СКС Есо PI и Есо PI5 контролируются профагами PI и PI5, существующими в клетках E.coli ЕЕ и E.coli PI 5 в виде плазмид; трансмиссивные плазмиды, определяющие резистентность к антибиотикам и фертильность бактериальных клеток, контролируют СКС Есо EI , Есо EII , а Также Есо Kill и Есо RV-ТИПЭ /17,23/.

- 27 -I.3.I. Хромосомные СХС. Генетические исследования СХС Е. coli К и В /37,39,69/, Salmonella typhimurium /196/ ПОЗВОЛИЛИ подробно охарактеризовать механизм рестрикции и модификации в хромосомных СХС, Указанные системы на основании свойств соответствующих ферментов отнесены к I классу. В каждой системе были получены мутантные фенотипы ІГМ* , а также одноступенчатые мутанты Е"М~. Последнее обстоятельство свидетельствует о том, что генетические детерминанты R и м должны локализоваться в одном участке хромосомы, т.к. только в этом случае могут быть затронуты мутацией оба признака. Комплементационный анализ подтвердил этот вывод. Путем генетической комплементации между мутантами по Rj _{и в} и Mg _{и в} было показано, что по крайней мере три гена: hsdM, hsdE и hsdS отвечают за механизм рестрикции-модификации у Есо К и Есо В систем /67/. Кластер hsd генов Есо В и Есо К СХС локализован в гомологичной области между thr и ріі локусами /39,67,78,135,220/. Аллельное расположение этих генов в хромосоме штаммов Е.соїі В и К продемонстрировано в экспериментах по функциональной комплементации /37,69,109/. Было установлено, что гибридный фермент с узнающей и модифицирующей субъединицами Есо К типа и рестриктирующей субъединицей Есо В типа ведет себя как полноценный фермент Есо К и имеет фенотип ^Ек ^мк ^Таким образом, источником специфичности СХС К и В является, как и следовало ожидать, узнающая субъединица hsds /36, 69,102/. Аналогичные результаты получены с рекомбинантным фагом Д , несущим гены hsdS_E и hsdM_z . При лизогенизации этим фагом хозяина Е.соїі К12, дефектного по гену nsdsj , с фенотипом ^RK ^ » образуется нормальная СХС К-типа /215/. Поскольку кластер генов СХС не является необходимым для жизнедеятельности клетки, то эти гены могут полностью или частично элиминироваться

- 28 -или передаваться другим штаммам. Меродиплоиды, несущие гены GXG В и К типов, проявляют рестриктирующий эффект слабее, чем каждая система в отдельности. Это определяется антагонистическим действием их узнающих субъединиц: гибрид, имеющий две различные узнающие субъединицы, энзиматически не функционален /68/. Последние исследования хромосомных СХС проводились с использованием приемов генной инженерии /186/. В фаге Я был клонирован локус bsd штамма E.coli к. С помощью комплементационных тестов был установлен порядок расположения генов в этом локусе: hsdR , hsdM , hsdS . Авторы показали, что экспрессия этих генов идет под контролем двух промоторов, один из которых ответственен за транскрипцию генов hsdM и hsdS , а второй - за транскрипцию hsdR . Именно поэтому молекула метилазы состоит из 2-х субъединиц, кодируемых генами hsdM и hsdS и не содержит продукта гена hsdR. Рестриктаза Есо К заключает в себе продукты всех трех генов. Авторами была продемонстрирована высокая степень гомологии ДНК, несущей гены hsdM, R и s из штаммов E.coli К, с ДНК из штамма E.coli в. При этом никакой гомологии не наблюдалось с ДНК штамма E.coli О , в котором отсутствует система модификации-рестрикции.

Действительно, эксперименты по анализу структуры молекул Есо В и Есо К ферментов, обладающих рестриктирующей активностью, позволили установить идентичность их строения. Молекулы указанных ферментов состоят из трех субъединиц, являющихся продуктами трех hsd. генов. Продукт гена hsdR_B - субъединица «^ , которая осуществляет рестрикцию; ее мол.масса составляет 135 КД. Узнавание определяется субъединицей , которая является продуктом гена hsdS_B и имеет мол.массу 55 КД. За модификацию по Есо В-ти-пу ответственна субъединица/, мол.масса которой составляет 60

- 29 -КД /36/, Очищенный фермент Есо В гетерогенен и представлен двумя популяциями молекул с различным соотношением входящих в их состав субъединиц: 1:2:1 и 1:1:1. Пока не установлено, эндонук-леаза или метилаза ответственны за модификацию ДНК in vivo По мнению Юань /233/, в стандартных условиях обе реакции могут осуществляться молекулой эндонуклеазы, но, учитывая наличие двух промоторов в hsd локусе, можно предположить, что метилаза синтезируется независимо в определенных физиологических условиях. Так как Есо К и Есо В генетически и функционально родственны, а их узнающие пептиды и структура молекул ферментов также очень схожи / 186/, то многие авторы придерживаются мнения, что К и В системы развились из общего предка /35,36,172/.

Несколько бактериальных штаммов, родственных B.coli KI2 и В, обладают СХС с генетическими детерминантами в той же области бактериальной хромосомы, где и hsdg и hsdg . Это замечание относится к GKC E.coli I5A /57,58/ и некоторых штаммов Salmonella /220/. Некоторые из этих систем могут быть аллельными для К и В систем и формировать с последними семейство функционально и структурно полностью родственных ферментов /36/.

1.3.2. Профаговые GKC. К профаговым СХС относятся системы

*

Есо PI и Есо PI5. Ранее было показано, что их генетические детерминанты, входящие в состав фагового PI генома или родственных плазмид PI5, являются аллельными /36,175/. Были клонированы hsd области PI и PI5 и встроены в плазмиду per 322 /125/. Авторы показали, что указанные локусы в обоих случаях состоят из двух цистронов: один ответственен за рестрикцию (hs

^{- зо -}

В случае дефекта в той части гена, которая ответственна за узнавание, фенотип полученных фагов был в"м~, при повреждении части гена, кодирующей фермент модификации - R*M" . Существование г⁺т"" мутантов возможно, т.к. фаговая инфекция может развиваться не только по лизогенному, но и по литическому пути, при котором такие мутанты сохраняют свою жизнеспособность. Еомплементационный анализ мутантов продемонстрировал внутрицистронную комплементацию генов hsdMS И и PI5. Причем области гомологии были расположены ближе к концам генов, а внутренняя области в 1,2 килобаза оказалась негомологичной /233/. Эта область ответственна за GKC. Наоборот, гены рестрикции обнаружили высокую степень гомологии, которая была фланкирована участками частичной гомологии. Гены hsdMS и hs

1.3.3. Плазмидные СХС. Плазмиды, контролирующие лекарственную устойчивость бактерий, или R-факторы, по способности подавлять функции фактора фертильности F были подразделены на 2 группы: fi"*R и fiHR , обозначенные соответственно ее и rii /94/. Впервые указание на присутствие СХС, контролируемых R -факторами, было получено в генетических экспериментах /31,95,224, 230/. В 1966 г. Ватанабе удалось продемонстрировать фрагментарную структуру продуктов гидролиза немодифицированной ДНК фага Ц экстрактом из Ril-содержащих клеток /95/. Полученные данные резко отличались от картины фрагментации ДНК ферментами рестрикции I класса и свидетельствовали о различии между рестриктазами, генетически детерминируемыми R -факторами и уже известной к тому времени рестриктазой Hind ш/200/,с одной стороны и рестриктазами Есо В и Есо К - с другой. Этот факт послужил отправной точкой для начала исследований йошимори /231/ по генетическому

- ЗІ -

анализу ЕМ мутантов и биохимической характеристике двух рест-риктаз, контролируемых El и RII плазмидами. Изучение генетики СКС ri типа было сопряжено с трудностями получения природного источника Еі-систеш /57,231,232/. Выделенный RI-изолят оказался весьма нестабильным и в процессе работы с ним утратил несколько селективных маркеров. Это обстоятельство привело к тому, что был сконструирован искусственный штамм-продуцент CSC RI -типа - штамм E.coli RY13 /231/. Было показано, что Eco RI и Есо Eli системы не родственны ни между собой, ни с какой-либо другой известной колийной GXC /58,231/. Далее путем генетических экспериментов с RI-, вії- и гибридными штаммами было продемонстрировано коренное отличие СКС, детерминируемых плазмидами, от хромосомных СКС I класса В и К-типа. Во-первых, был установлен кооперативный эффект действия ні и Rll типа рестрикции в гибридном штамме, в отличие от комплементарного взаимодействия систем Есо В и Есо К. Во-вторых, оказалось невозможным, в отличие от систем I класса, получить одноступенчатые мутанты с фенотипом r"V" , а были выделены лишь мутанты с фенотипом 1^ ; *&іЧш:^# ^^тот $^{акт П03Б0ЛИЛ} сделать вывод о структурном различии системы генетического контроля RI и RII СКС и З^х-цист-ронного типа кодирования СКС Есо В и Есо К. Была показана дискретность энзиматической системы плазмидных СКС, которая, соответственно двум генам, была представлена двумя ферментами: рест-риктирующей эндонуклеазой и модифицирующей метилазой, которые не имели общих субъединиц и относились ко П классу ферментов СКС. Ниже изложены данные, подтверждающие генетическую дискретность СКС ні и RII типа, которые были получены в экспериментах по изучению тонкой структуры их генетических детерминант.

Ньюман с соавт. /88/ определили нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК, содержащего гены рестрикции и модификации системы Есо ее. Последовательность ДНК, кодирующая ЕЕсо RI , содержит информацию для синтеза полипептида длиной в 277 аминокислотных остатков. Молекулярная масса молекулы рестриктазы Есо ні составляет 31063 Д. Ген метилазы кодирует полипептид из 326 аминокислот с мол.массой 38048 Д. Гены исследованных белков не перекрываются и разделены межцистронным участком длиной 29 нуклеотидов. Как внутри каждого гена, так и между ними обнаружены участки гомологии. Однако уровни структурной организации соответствующих белков различны. По мнению авторов, полученные данные свидетельствуют о независимом эволюционном происхождении ферментов рестрикции и модификации П класса.

В экспериментах на плазмиде из » относящейся к кіі типу, было установлено взаимное расположение генов R-м системы Есо RII и генов устойчивости к антибиотикам /112/. Впервые на Есо вії системе было показано, что модификация у бактерий может быть связана не только с аденином, но и с цитозином /112,114, 115,188/. Такая модификация контролируется геном mec . Аналогичный ген присутствует также в геноме клеток Е.саііКІ2 /115/, что обусловливает метилирование по цитозину последовательностей 5'...im(Y)rr...3' в бактериальной ДНК и обеспечивает устойчи-вость к рестрикции RII типа. Однако экспрессия хромосомного гена тес в клетках E.coli К12 происходит слабее по сравнению с этим же геном в составе плазмиды, в результате чего ДНК E.coli KI2 "недометилирована" по сравнению с ДНК тех клеток, где присутствует плазмида N3 /144,145/. По всей вероятности, это связано также с "дозой гена": в случае системы rii количество генов, а значит, эффективность метилирования возрастают соответ-

- 33 -ственно числу копий плазмиды N3 . В случае хромосомной локализации гена тес подобная амплификация исключена.

Изучение генетического контроля GXC имеет важное практическое значение в связи с целесообразностью в ряде случаев переноса генов R-м в клетки другого хозяина и их клонирования и амплификации. Успешный эксперимент такого типа проведен с геном dam⁺ фага Т4, кодирующим адениновую метилазу /189/, с генами системы модификации-рестрикции Нра II из H.parainfluenzae , которые были встроены в плазмиду PBR 322/143/. В ряде случаев, когда в клетке продуцируется несколько рестриктаз, их трудно бывает разделить при очистке. Тогда перспективным может быть получение штамма, мутантного по одной из рестриктаз. Таким генетическим приемом удалось разделить рестриктазы Bgl їй Bgl и/83/. Методами генной инженерии на основе плазмидных векторов были сконструированы рекомбинантные плазмиды, несущие гены модификации и рестрикции Eco RII /II/. В результате усиления транскрипции с промоторов синтез ферментов Eco RII с клонированного фрагмента увеличился в несколько десятков раз. Подобные эксперименты открывают возможности получения суперпродуцентов ферментов модификации и/или рестрикции.

1.3.4. Распространение R-факторов в сем. Enterobacteria -сеае . Обнаружение плазмидных GXC явилось следствием открытия японскими исследователями у штаммов Shigella устойчивости одновременно к нескольким лекарственным препаратам, детерминированной трансмиссивными Е-плазмидами /224/» Эта работа стала важным этапом в изучении как нового, плазмидного типа GKC, так и качественно нового свойства R-факторов, которые, помимо лекарственной устойчивости и других функционально важных параметров, могут детерминировать различные GXC, и . обеспечивать

реципиентной клетке селективное преимущество в виде надежной системы защиты.

Для семейства энтеробактерий в целом характерно распространение в -факторов /75/. Возможно, это явилось одной из причин того, что детерминирование СХС Е -факторами впервые было установлено у представителей сем. Enterobacteriaceae /210,231/. Помимо E.coli, СХС, детерминированная R-фактором, была обнаружена у штамма Salmonella panama /107/. Тесная связь СХС с Е -факторами была обнаружена и у дизентерийных бактерий. Было показано, что в ряде случаев R-плазмиды, циркулирующие среди диких штаммов Shigella , могут нести гены рестрикции-модификации. Так, некоторые Е-плазмиды обусловливали рестриктирующую активность в отношении специфических фагов Shigella flexneri /214/ Для Е-факторов была показана гомология некоторых участков их молекулы с областями Е -фактора, ответственными за перенос генетического материала в реципиентную клетку /92,93/. Этот факт однозначно свидетельствует о возможности независимой миграции R -плазмид, в том числе и несущих СХС, в условиях естественного ценоза. В эволюционном отношении пересечение видовых и родовых барьеров плазмидами выгодно клеткам бактерий, т.к. за счет приобретения новых плазмид осуществляется обогащение генофонда популяции. Причем при возможности такого переноса часто нельзя решить, кто в действительности является исходным хозяином данной плазмиды и даже вообще, имеет ли эта плазмида бактериальное происхождение /4/. Результаты проведенных экспериментов, а также данные, полученные в естественных условиях, подтвердили возможность передачи Е-плазмид в сем. Enterobacteriaceae как между представителями одного рода, так и, преодолевая межродовые барьеры, между представителями разных родов. В частности, доказана

- 35 -возможность передачи R-плазмид Shigella представителям рода Escherichia /34,162,208,209/. Отмечается и обратный процесс, когда непагогенный штамм E.coli , содержащий фонд R -факторов, передает его патогенному штамму в процессе инфекции, т.е. in vivo /32,33/.

Многими авторами отмечаются родственные эволюционные отношения родов внутри сем. Enterobacteriaceae , в частности Escherichia и Shigella /28/. Не исключено, что данные о различиях или однотипности R -факторов, циркулирующих среди представителей этого семейства и, в частности, контролируемых ими GXC, могут оказаться дополнительным критерием при установлении путей эволюции как непатогенных, так и патогенных штаммов в сем. Enterobacteriaceae.

ІЖЗаключение^

Таким образом, детальное изучение энзимологических основ СХС привело к выделению нового класса ферментов - модифицирующих метилаз и рестриктирующих эндонуклеаз. Эти ферменты позволили исследователям приступить к разрешению целого ряда фундаментальных и практических задач. Наибольшее практическое применение на сегодняшний день нашли рестриктазы. Обнаружение и использование этих ферментов способствовало бурному развитию молекулярной биологии и генной инженерии.

Все области применения рестриктаз требуют использования чистых ферментных препаратов, свободных от интерферирующих активностей нуклеолитического и протеолитического действия. Последнее в свою очередь зависит от уровня развития методологического базиса, на котором строится решение проблемы получения чистых ферментов. Во П разделе "Обзора литературы" мы остановимся на рассмотрении методов, которые позволяют получать ферменты рестрикции требуемой степени чистоты.

2. Методы выделения и очистки специфических эндонуклеаз

2-й раздел "Обзора литературы" включает описание и анализ методов, применяемых при очистке рестриктаз. Перечень методических приемов, которыми пользуются экспериментаторы при решении этой задачи, исключительно обширен. В связи с этим изложить все сведения, предоставляемые литературой по этой проблеме, не представляется возможным. Поэтому при работе с литературным материалом мы обращали основное внимание на работы последних лет, в которых рассмотрены наиболее перспективные современные методы, а также классические методы белковой химии, которые в силу своей универсальности широко применяются и сегодня и стали уже классическими и при выделении ферментов рестрикции. Одновременно мы пытались создать общее представление об очистке этих ферментов как о процессе, включающем несколько обязательных этапов, лишь при осуществлении которых возможно добиться поставленной цели.

2.1. Разр2^ш1ние_клеток. Известно, что практически все рест-риктазы - внутриклеточные ферменты и локализуются в клетке в периплазматическом пространстве и/или на клеточной мембране/147/. Поэтому первым этапом при выделении и очистке рестриктаз является разрушение клеток, которое сопряжено с большими трудностями ввиду наличия у бактерий очень прочной клеточной стенки. Существует несколько физических способов деструкции микробной клеточной стенки, из которых при выделении рестриктаз наиболее распространенным является гидродинамическое разрушение с помощью ультразвука / 5,14,22,44,51,53,55,79/. В основе механизма разрушения ультразвуком лежит фактор высокочастотного изменения давления в суспензии клеток, которое сопровождается выделением значительно-

го количества тепла. Так как повышение температуры может привести к инактивации фермента, то разрушение клеток ультразвуком, как и любым другим методом, проводят при температуре не выше +4С. Для достижения наиболее полной экстракции рестриктирующей активности из клеток в процессе разрушения Нетесов с соавт, предложили вести разрушение клеток в присутствии неионного детергента тритона Х-100 /15/. Добавление детергента в процессе разрушения клеточной массы и выделения фермента приводит к повышению выхода фермента Есо ее в 4,5 раза. Эти результаты согласуются с данными о связи рестриктаз с клеточной мембраной /147/. В присутствии тритона эта связь ослабляется, вследствие чего происходит эффективное отделение молекул фермента от обломков цитоплаз-матической мембраны.

Другими физическими методами, которые иногда используются для разрушения микробных клеток при выделении рестриктаз, является гидродинамическое разрушение с помощью высокого давления в специальных френч-прессах /43/ или растирание с алюминиевым порошком /226/. Поскольку эти методы предусматривают многократную экстракцию фермента из разрушенных клеток и фермент не удается получить в достаточно высокой концентрации на стадии разрушения, то широкого распространения такие приемы не получили.

Довольно часто разрушение микробных клеток осуществляется методом осмотического шока /60,201/. Этот метод оказался особенно актуальным при прямом скрининге бактериальных штаммов на присутствие в них эндонуклеаз рестрикции. Именно в подвергнутых осмотическому шоку клетках Erovidencia stuartii, Klebsiella pneumoniae, Moraxella glueidi /201/ были впервые обнаружены рестриктазы Pst і, Крп і и Mgl і.

Разрушение микробных клеток значительно упрощается, если

- 38 -их предварительно обработать ферментами, переваривающими клеточ- ную стенку бактерий, например, лизоцимом /47,193/. Для грамполо-жительных бактерий подобная процедура обработки клеток лизоцимом, как, например, в случае выделения рестриктаз Ват Ш /227/, Sal I /193/, или обработка лизостафином при выделении рестриктазы Sau заі /49/ вообще является характерной предварительной стадией при любом способе разрушения.

Эффективным для некоторых продуцентов рестриктаз оказался метод разрушения микробных клеток путем обработки органическими растворителями, в частности, толуолом /20/. При повреждении ли-пидного компонента клеточной стенки молекулы рестриктаз выходят из клетки через образовавшиеся "бреши" и бывают менее загрязнены клеточными белками, чем в результате полного разрушения клетки.

Стадия разрушения микробных клеток является исключительно важным, критическим этапом в процессе выделения рестриктаз, т.к. окончательный выход фермента зависит, помимо прочих факторов, и от эффективности извлечения фермента в результате разрушения . Идеальным считается такой зонификат, который содержит максимальное количество извлеченного из клеток активного фермента.

2.2. Уд^ление_н^клеиновых__кислот и балластных__белков. Стандартным исходным препаратом при выделении рестриктаз является грубый экстракт, который представляет собой надосадочную жидкость после центрифугирования зонификата при 105 000 g Нуклеиновые кислоты из грубого экстракта должны быть удалены в первую очередь. Это очевидно, т.к. собственные нуклеиновые кислоты штамма-продуцента могут неспецифически сорбировать молекулы рестриктаз. Присутствие большого количества балластных белков также может существенно затруднять очистку фермента. Существует

- 39 -несколько способов удаления нуклеиновых кислот и балластных белков. Стандартная схема подготовки грубого экстракта к последующему выделению фермента предполагает достаточно полное, но не исчерпывающее, осаждение нуклеиновых кислот СС /53,54,190,211/ и высаливание белков СА. Процедура осаждения белков СА часто осуществляется фракционно с целью отделения белковой фракции, содержащей основную массу энзиматической активности, от балластных белков /51/,

Другой способ удаления нуклеиновых кислот с помощью PEI отмечается многими авторами как более мягкий и эффективный по сравнению с осаждением СС /65,117,166/, В условиях низкой ионной силы с нуклеиновыми кислотами соосаждаются и некоторые белки, включая рестриктазы. Для REco RI было показано, что элюция фермента из такого преципитата позволяет получить фермент достаточной степени чистоты /48,65/. Другие ферменты не всегда могут быть экстрагированы из РЕІ-осадка в активной форме /166/, В таких случаях осаждение PEI проводилось в условиях повышенной ионной силы, фермент оставался в растворе, его активность сохранялась. Последующее освобождение от PEI и концентрирование белка осуществлялось СА, как описано выше.

Первым рациональным методом, позволившим объединить описанные процедуры обработки грубого экстракта в одну стадию колоночной хроматографии и тем самым качественно модифицировать схему выделения и очистки рестриктаз, стал метод гельфильтрации на молекулярных ситах,

2,3. Гельфильтрацияд Метод проникающей хроматографии, или гельфильтрации, в основе которого лежит принцип разделения молекул по размеру, может быть успешно использован при выделении и очистке рестриктаз. Для этих целей применяется преимущественно

- 40 -биогель A-0,5m, значительно реже сефадексы от G25 до G200 , сефароза 2В, сефакрил S200. Однако то модифицирующее начало, которое привнесла процедура гельфильтрации в стандартную схему выделения ферментов рестрикции /200/, связано с возможностью использования биогеля А-0,5m на первой стадии сразу после разрушения клеток и осаждения клеточных обломков при 105 000 g Благодаря этому метод гельфильтрации грубого экстракта на биогеле а-0,5m позволил исключить из схемы выделения рестриктаз две трудоемкие процедуры, а именно: удаление нуклеиновых кислот и высаливание белков. Как показывает обзор большого количества работ, касающихся очистки рестриктаз, метод гельфильтрации на биогеле А-0,5 m используется на первой стадии очистки многих ферментов рестрикции как непосредственго из грубого экстракта /44,50,64,103,130,132/, так и после предварительного фракциони-рования СА /45/.

Практически для всех рестриктаз, полученных методом гельфильтрации на биогеле А-0,5 ш, отмечается высокая стабильность, которая свидетельствует о практически полном отсутствии протеаз в препаратах ферментов. Однако на этой стадии очистки препараты рестриктаз в значительной степени загрязнены неспецифическими нуклеазами и фосфатазами, необходимость освобождения от которых предполагает дальнейшую очистку полученных ферментов. Исключение составляет лишь несколько рестриктаз, в частности, Sal I , для которой было показано, что фракционирования на биогеле А-0,5 m достаточно для получения препарата, пригодного для физического картирования ДНК / 14/.

В некоторых случаях использование гельфильтрации оказалось весьма эффективным для разделения эндонуклеаз рестрикции из одного штамма-продуцента. На первой стадии фракционирования на

- 41 -A-0,5m грубого экстракта из клеток Haemophilus parainfluenzae удалось разделить две рестриктазы из этого штамма: Нра I и Нра П. Рестриктаза Нра П элюировалась в интервале 0,67-0,73V колонки, неспецифические нуклеазы - 0,8-0,97, а Нра I - 0,9-0,95V/192/. Причем полученный препарат Нра П был свободен от примесей неспецифических эндонуклеаз. Хроматография на биогеле А-0,5т оказалась решающей стадией при разделении рестриктаз Dpn і и Dpn її /132./, Ионообменная хроматография не обеспечивала разрешения этих активностей ввиду их близких ионообменных свойств, а разделить их по размеру не вызывало затруднений, т.к. молекулярная масса молекул Dpn I и Dpn II составляет соответственно 20 000 и 70 000 дальтон. Полученный препарат Dpn II был загрязнен примесями неспецифических нуклеаз и требовал еще одной стадии очистки на анионообменнике ДЕ-52, тогда как Dpn і уже после одной стадии хроматографии на биогеле был свободен от примесей интерферирующих активностей. Лишь с помощью фракционирования на биогеле А-0,5т удалось отдифференцировать друг от друга специфические эндонуклеазы Pvu I и Pvu II из Proteus vulgaris /221/.

Естественно, что столь высокая разрешающая способность гельфильтрации не является универсальным свойством биогеля по отношению ко всем эндонуклеазам рестрикции. Так, фракционирование на А-0,5т оказалось неэффективным для разделения рестриктаз Fnu DI , Fnu DII и Fnu Dili ИЗ КЛЄТОК Fusobacterium nuc-leatum /206/. Кроме того, условия хроматографии на биогеле, а именно, высокая концентрация соли в рабочем буфере, в ряде случаев оказывают ингибирующее действие на активность некоторых рестриктаз, чувствительных к высокой ионной силе среды /206/. К недостаткам метода гельфильтрации можно отнести также невысокую

удельную активность получаемых ферментов, что вызывает иногда необходимость высаливания белка во фракциях, содержащих фермент, в частности, Нае II с целью концентрирования его перед дальнейшей очисткой /51/. Однако за счет удаления ингибиторов рестрик-таз при гельфильтрации на биогеле А-0,5т нередко, наоборот, наблюдается активация фермента /56/.

Из других видов молекулярных сит для очистки рестриктаз успешно использовался на первой стадии сефакрил S200 /55,64/» Было показано, что фракционирование на сефакриле рестриктаз oaui и Оаи п, а также Всі і в сочетании с ионообменной хроматографией позволяет как разделить ферменты из одного штамма, так и достигнуть эффективной очистки от неспецифической нуклеазной и фосфатазной активности.

Иногда при выделении и очистке рестриктаз используют другие виды молекулярных сит: ультрагель АсА-44 /25/, сефарозы, в частности, 2В /150/ и сефадексы. Определенной системы в выборе марки сефадекса применительно к очистке рестриктаз, по-видимому, не существует, за исключением тех случаев, когда выбор сефадекса диктуется его стандартным предназначением. Например, для обес-соливания препарата белка на первой стадии очистки Hinf ш использовали сефадекс G25 , а сефадекс G200 применили на последней стадии выделения этого фермента с целью определения его мол.массы /127/. Для очистки рестриктазы Есо ее различные авторы использовали в качестве одной из завершающих стадий гель-фильтрацию на сефадексах gioo или G150. В обоих случаях фермент был получен в гомогенном состоянии /5,183/ (см.таблицу I).

Хотя одностадийная очистка рестриктаз методом гельфильтрации практически никогда не позволяет получить очищенный от интерферирующих активностей препарат фермента, однако большое зна-

- 43-чение этого метода для быстрого получения высоко стабильных ферментов рестрикции и разделения схожих в конформационном отношении белков, обусловливают широкое использование этого метода для выделения различных рестриктаз* Последующая очистка специфических эндонуклеаз осуществляется на основании структурных и конформационных различий молекул ферментов с использованием методов ионообменной, гидрофобной и аффинной хроматографии»

2.4. Ионообменная_хОматография.. Метод ионообменной хроматографии, как классический метод белковой химии, был взят за основу при очистке рестриктаз, начиная с выделения первых ферментов рестрикции П класса /200,231/. Однако и на сегодняшний день стадия катионообменной хроматографии на ФЦ и,несколько реже - анионообменная хроматография на ДЕАЕ-целлюлозе, практически всегда остаются основными звеньями в той сложной последовательности процедур, которые в совокупности и составляют схему получения исчерпывающе очищенных от интерферирующих примесей препаратов рестриктаз Eco BI (таблица I), Оаи I, Оаи II, Ват НГ, Scr PI, Bvu I и т.д. /12,42,50,51,60,103,117,149,203,221/. Подобная стабильность выбора обменников определяется тем обстоятельством, что для ДНК-связывающих белков, в том числе рестриктаз, отмечено высокое сродство именно к ФЦ, т.к. помимо ионообменных свойств белковой молекулы фермента, эффективность взаимодействия фермента с обменником определяется наличием доступных для молекул рестриктаз фосфатных групп.

Выделение рестриктаз по классической схеме с использованием хроматографии на ФЦ обычно проводилось в несколько стадий. Нуклеиновые кислоты удаляли из грубого экстракта осаждением СС, клеточные белки дробно фракционировали высаливанием СА, полученную обогащенную рестриктирующей активностью фракцию подвер-

гали диализу и лишь затем фракционировали на ионообменнике. Во многих случаях этих процедур было достаточно для получения ферментов, в частности Есо El, Hind ш, пригодных для физического картирования ДНК /51,200,232/. Аналогичные результаты были получены и при одностадийной очистке специфических эндонук-леаз, например, Xba I, Scr бт, Еса і на ДЕАЕ-целлголозе /185,203, 236/. Для того, чтобы получить препарат рестриктазы, исчерпывающе очищенный по ионообменным свойствам молекул фермента, схема очистки нередко объединяла в себе оба вида ионообменной хроматографии. Комплексное использование катионо- и анионообменной хроматографии при очистке ферментов рестрикции оказалось более эффективным, чем фракционирование одним из этих методов для ферментов Еса I /185/, Scr Pi /203/ и некоторых других. Однако в большинстве случаев эндонуклеазы рестрикции, прошедшие обе стадии ионообменной хроматографии, еще были загрязнены неспецифическими нуклеазами и фосфатазами и нуждались в дополнительной очистке. Попытки дополнительно очистить фермент путем рехромато-графии на тех же обменниках приводили к большим потерям активности /98/.

Усовершенствовать и более рационально проводить процедуру хроматографии на фосфоцеллюлозе позволил метод, который получил широкое распространение в последние годы /49/. Этот метод включает фракционирование на подготовленной особым, более простым способом фосфоцеллюлозе, непосредственно грубого экстракта.Так как в ряде случаев специфические и неспецифические нуклеазы характеризуются близкими ионообменными свойствами и не отделяются друг от друга в полной мере при очистке на ионообменниках, исследователи бывают вынуждены вести фракционирование в ходе ионообменной хроматографии в условиях пологого градиента большими

объемами элюирующего буфера. Это обстоятельство приводит к получению разбавленного фермента, нуждающегося в последующем концентрировании. Поэтому последующую очистку и концентрирование фракций, содержащих ферментативную активность, авторы проводили на ГАП'е. Эффективность этого метода была продемонстрирована для рестриктаз Есо ее, Bam HI, Bgll и т.д., всего для 16 ферментов. Для исчерпывающей очистки рестриктаз Есо Ell, Hga I, Нра II и Bam НЕ в качестве 3-ей стадии была успешно применена хроматография еще на одном катионообменнике - Bio Rex 70.

Иногда для очистки рестриктаз используют сорбенты, сочетающие свойства ионообменников и молекулярных сит, такие как ДЕАЕ-сефадекс, ДЕАЕ-сефацель. Сорбенты с такими смешанными свойствами могут оказаться полезными тогда, когда неэффективны ни гель-фильтрация, ни ионообменная хроматография в отдельности, как в случае рестриктаз Fnu DI и Fnu. DII /206/.

Как любой метод, ионообменная хроматография в применении к очистке рестриктаз имеет свои положительные и отрицательные стороны. И хотя, как правило, очистка рестриктаз только на ионо-обменниках оказывается неэффективной, однако присутствие этой стадии в развернутой схеме очистки часто бывает необходимым, поскольку использование такого важного свойства белковой молекулы, как способность к ионным взаимодействиям, может стать органичным слагаемым успеха всего процесса очистки в целом.

2.5. Аф^инная__хоматография^ Если на первых этапах работы при очистке рестриктаз исследователи придерживались неких стандартов, принимая за основу процедуру очистки, описанную Смитом /200/ и основанную на классической ионообменной хроматографии, то затем по мере увеличения количества выделенных рестриктаз и углубления знаний об этих ферментах, методы работы с ними стали

- цв -менее каноническими и более вариабельными. Этот процесс сопровождался широким внедрением в лабораторную практику как уже известных, не всегда находивших себе широкого применения, так и совершенно новых видов сорбентов, использование которых способствовало совершенствованию технологии выделения особо чистых препаратов рестриктаз. Принципиально новым направлением в развитии методов выделения рестриктаз стала хроматография по биологическому сродству, или аффинная хроматография. Этот метод моделирует специфическое взаимодействие "фермент-субстрат", чем определяется высокая разрешающая способность и концентрирующий эффект аффинной хроматографии.

Группа аффинных сорбентов чрезвычайно разнообразна в силу существования широкого спектра лигандов, способных имитировать отдельные свойства или структурные компоненты естественного субстрата для рестриктаз. Иногда в качестве лиганда используется непосредственно нативная или денатурированная ДНК, как в случае ДНК-целлюлозы и ее модификаций на основе агарозы и акриламида /44,127,172,180/. Причем, как показали многочисленные эксперименты, рестриктазы взаимодействуют не только с двуспиральной ДНК, но также и с односпиральной. Так, рестриктирующая эндонук-леаза ВвеІ из штамма B.breve /47/ была очищена на двуспиральной ДНК-целлюлозе, Hinf ill- на двуспиральной ДНК-агарозе /127/. Наоборот, для Eco EI/I80/ позитивные результаты были получены при хроматографии на денатурированной ДНК-целлюлозе. Использование этого метода для очистки ферментов Bsuee иЕсо EI (таблица I) /180/ на завершающей стадии позволили довести препараты ферментов до гомогенного состояния. Приведенные примеры однозначно свидетельствуют в пользу аффинной хроматографии, которая основана на использовании естественной биологической функции рестриктаз.

- 47 -В 1977 г, был описан метод аффинной хроматографии ферментов рестрикции на гепарин-сефарозе. Предпосылкой использования этого метода было обнаруженное сильное сродство гепарина к белкам, действующим на ДНК /63/. Объяснение этому явлению заложено в химической структуре гепарина, который является аналогом ДШ по двум критериям: во-первых, гепарин, как и ДНК, является полианионом; во-вторых, структурно гепарин аналогичен сахаро-фосфат-ной цепи ДНК, фосфатные группы которой заменены у гепарина суль-фогруппами. Была предложена упрощенная одностадийная схема быстрой и качественной очистки рестриктаз на гепарин-агарозе с предварительным осаждением нуклеиновых кислот PEI /63/. Авторы про-демонстрировали успешное применение такой схемы для 16 ферментов рестрикции, причем некоторые рестриктазы были получены в состоянии, свободном от интерферирующих активностей, другие требовали дополнительной очистки на ДЕАЕ-целлюлозе. Большим преимуществом хроматографии на гепарин-агарозе оказалась возможность разделения специфических эндонуклеаз из одного штамма, отличающихся близкими ионообменными свойствами, в связи с чем их не удавалось разделить с помощью ионообменной хроматографии» Так, в результате фракционирования на гепарине были успешно разделены рестриктазы Bgll и Bgl И , Нра I и Нра П, TaqI и Taq. II, Hind її и Hind щ. При нанесении на колонку с гепарин-агаро-зой грубого экстракта из клеток Neisseria cinerea был получен фермент їїсі I, свободный от неспецифических нуклеаз, с колоссальным выходом: 40 000 ед.активности на I г сырой пасты /46/« Присутствие стадии хроматографии на гепарин-агарозе в схеме очистки ферментов рестрикции ВЪе1/47/, Ben I /22/, Bgl I /14/ и других обеспечило получение особо чистых препаратов этих ферментов и, соответственно, их пригодность для использования в

экспериментах по исследованию тонкой структуры ДНК и в генной инженерии.

В 1978 г. две группы исследователей сообщили о новом способе очистки рестриктаз методом аффинной хроматографии на голубой сефарозе, где в качестве лиганда был использован полиароматический краситель Oibacron blue F3GA /56,99/. Предпосылкой успешного использования этого сорбента при выделении рестриктаз послужили данные о том, что для ферментов, имеющих участки связывания с нуклеотидами, имеет место специфическое аффинное сродство к голубому декстрану, содержащему указанный краситель /213» 225/. Было установлено, что хромофоры, входящие в состав красителя, содержат отрицательно заряженные сульфогруппы, которые могут имитировать фосфатные группы ДНК, что важно для "узнавания" лиганда ферментом, и/или обеспечивать связывание фермента с лигандом за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий /56,72/. Бакси с соавт. продемонстрировали очистку на голубой сефарозе четырех рестриктаз Ват ЕЕ, Pal I, Zho и Bgl I /56/. Другая группа применила этот сорбент для очистки Hinf ш, Xba I, Pst I /99/. Большим преимуществом метода оказались простота и рациональность его использования для очистки ферментов рестрикции. Хроматография на голубой сефарозе позволяет быстро в малых объемах из небольших количеств биомассы выделять ферменты рестрикции. Избирательный способ разделения рестриктаз на голубой сефарозе, основанный на биоспецифических взаимодействиях, обусловливает универсальность этого метода в отношении различных ферментов рестрикции, что подтверждается изложенными выше данными. Подобное сочетание факторов простоты и универсальности, объединенных в одной процедуре, позволяет использовать этот метод для тестирования большого количества штаммов на наличие спе-

- 49 -цифической эндонуклеазной активности. Использование на I стадии очистки голубой сефарозы или биогеля А-0,5т имеет ряд принципиальных различий. В последнем случае происходит освобождение грубого экстракта преимущественно от нуклеиновых кислот, а эффективной очистки от балластных белков достичь не удается /54/» Фракционирование грубого экстракта на голубой сефарозе объединяет, по крайней мере, два, обычно последовательных, события: освобождение грубого экстракта от нуклеиновых кислот и непосредственно фракционирование ферментативной активности в среднем с 30-кратной очисткой ее от балластных белков, в том числе и от неспецифических нуклеаз /56/,

Помимо голубой сефарозы существует еще несколько видов аффинных сорбентов, которые содержат в качестве лигандов иные, чем Oibacron blue, полиароматические красители. Это так называемые "красная", "зеленая" и "желтая" сефарозы. Оцнако потенциал полиароматических лигандов для аффинной хроматографии этим не исчерпывается. Подтверждением служит синтез нового сорбента -фолат-сефарозы /10/, где в качестве лиганда к сефарозе ковалентно привязана фолиевая кислота. Структурное сходство фолиевой кислоты с полиароматическими красителями обеспечивает специфическое взаимодействие фермента с сорбентом. Эффективность хроматографии на фолат-сефарозе была продемонстрирована при очистке рестриктазы Есо ш. (таблица I). Одностадийное фракционирование грубого экстракта из клеток E.coli RY13 на фолат-сефарозе позволило получить очищенный фермент с удельной активностью в два раза выше по сравнению с Есо El , очищенным на голубой сефарозе. Таким образом, на основании изложенного фактического материала можно сделать вывод, что применение аффинной хроматографии является высокоэффективным, универсальным методом для очист-

- 50 -ки всех специфических эндонуклеаз, а метод фракционирования на голубой сефарозе открывает уникальную возможность прямого биохимического скрининга специфических эндонуклеаз в различных объектах,

2*6, Гидрофобная хроматога_фия. Принцип метода гидрофобной хроматографии заложен в индивидуальности химической структуры белковых молекул и состоит в том, что нековалентные гидрофобные участки, расположенные на их поверхности, участвуют в нековалент-ных взаимодействиях с гидрофобными лигандами, связанными с нерастворимым носителем /161/. Впервые уникальность гидрофобных свойств рестриктирующих эндонуклеаз была продемонстрирована при очистке их на сорбентах, представляющих собой аминоалкильные производные агарозы (сефарозы) с заместителями с длиной цепи от 3 до 7 атомов углерода /172,191/. Так, со -аминопентиясефароза была успешно использована при очистке рестриктаз Hhal/53/, Xba 1/236/, Sal I /41/, Bam ЕЕ /227/, аминогексилсефароза была применена при очистке Xho її /12/. В ряде случаев весьма эффективным было использование для очистки рестриктаз фенил-сефарозы. Этот сорбент обладает ярко выраженными гидрофобными свойствами и исключительно высокой емкостью, что придает ему способность разделять биомолекулы по степени гидрофобности и концентрировать их в процессе элюции. Взаимодействие рестриктаз с фенил-сефарозой носит совершенно иной характер по сравнению с другими сорбентами. Об этом свидетельствуют условия сорбции и элюции ферментов: возрастание ионной силы раствора увеличивает силу гидрофобных взаимодействий, а следовательно, способствует сорбции, а элюция проводится при понижении ионной силы и повышении полярности буфера или даже введении детергента /10/.

Высокая разрешающая способность метода была продемонстрирована при очистке на фенил-сефарозе рестриктаз Bgl I /136/, Bgl II, Eco RI /10/, Eco CK /9/. Полученные препараты специфических эндонуклеаз после одностадийной очистки на фенил-сефарозе были пригодны для физического картирования ДНК, в случае использования фенил-сефарозы на 2-ой или 3-еи стадии очистки, ферменты могли быть использованы для определения узнаваемой последовательности в молекуле ДНК и для экспериментов по клонированию, т.к. были исчерпывающе очищены от примесей неспецифических 5'- и У -экзонуклеаз и фосфатаз. Результаты очистки на фенил-сефарозе рестриктирующих эндонуклеаз Bgl II и Есо ЕЕ свидетельствуют о том, что при соответствующем подборе условий сорбции и элюции удается получить 3-5-кратное увеличение удельной активности этих ферментов даже после предварительной хроматографии на более специфичных сорбентах /10/,

Обычно при элюировании ферментов с фенил-сефарозы в качестве полярного агента используется глицерин. Большинство ферментов элюируется при низкой ионной силе и концентрации глицерина 50 /9,10,136/. Поэтому оптимальным вариантом очистки с применением фенил-сефарозы является использование этого сорбента на последней стадии, что обеспечивает получение фермента в концентрированном виде и позволяет избежать стадии стабилизирующего диализа против 50^ глицерина. Это несомненно одно из наиболее важных достоинств метода, поскольку процедура диализа, особенно концентрирующего, нередко приводит к снижению специфической активности, возможно, в силу нарушения оптимального естественного соотношения концентраций ди- и тетрамерных форм молекул фермента в полученном препарате /106,200/. Результаты очистки рестриктаз на гидрофобных сорбентах свидетельствуют о том, что

- 52 -эти ферменты обладают выраженными гидрофобными свойствами и могут быть очищены с учетом степени гидрофобности молекулы фермента,

2.7. Заключение

На основании изложенных выше данных можно с уверенностью сказать, что универсального метода очистки ферментов рестрикции не существует. Перечисленные выше методы являются наиболее распространенными и перспективными при выделении специфических эн-донуклеаз. По мере того, как расширяется арсенал средств и способов очистки ферментов рестрикции, разнообразнее и совершеннее становятся приемы работы по их выделению. Каждый автор выбирает, или чаще создает новую индивидуальную схему очистки фермента, исходя из биологических свойств объекта, свойств фермента и тех материальных возможностей, которыми он располагает. На примере наиболее распространенной и хорошо изученной рестриктазы Eco El, которая используется во всех лабораториях, работающих в области молекулярной биологии, мы продемонстрируем несколько схем очистки этого фермента, чтобы показать, сколь разнообразны могут быть подходы к решению одной конкретной задачи (таблица I).

Таблица I

Методы выделения и очистки специфической эндонуклеазы Eco RI

и№ JИспользованные j Обменники и пп последовательно j сорбенты {процедуры

(Характеристика t полученного {препарата

Ссылка

I. I. Высаливание белка

2. Анионообменная хроматография

ДЕ-52

фермент свободен /151/ от неспецифических нуклеаз

Таблица I (продолжение)

!

3. Катионообмен- ФЦ РП
ная хромато
графия

4. Концентриро- сухой сефадекс вание G-25

5. Градиентное глицерин 10-25^ центрифугирование

СА ФЦ PII

П. I. Высаливание белка

2. Катионообменная
хроматография

3. Катионообменная КМ~целлюлоза
- хроматография

4» Гельфильтрация сефадекс G-100

5, Концентрирова- р_ДП
ниє ^1ЛІі

гомогенный препарат

/183/

6. Катионообменная хроматография ФЦ РІІ

7. Концентрирование 50 глицерин

Таблица I (продолжение)

!

У. I,

3.

4.

Катионообменная хроматография

Очистка и концентрирование

Концентрирование

Стабилизация

ФЦ PII

Фермент пригоден для физического картирования, секвенирования и молекулярного ПЭГ клонирования 5% глицерин Фрагментов

/W

УШ. А. I, Аффинная хро- голубая

. матография сефароза

2. Гидрофобная фенил-
хроматография сефароза

Фермент пригоден для всех видов генно-инженерных работ. Высокая удельная активность

/10/

Б. I. Аффинная хро- фолат-матография сефароза

ІЯАВА П МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ

I. Материалы

1.1. Бактериальные штаммы. В работе были использованы бак
териальные штаммы шигелл Shigella soimei 47 и Shigella stutze-
ri 2 из Тбилисского института вакцин и сывороток им. И.И.Мечни
кова МЗ СССР, колийные штаммы Е.соїі ск, Е.соїі в, E.coli V ,

E.coli EY13, E.coli С-боо - из музея Института медицинской эн-зимологии АМН СССР, E.coli БВЮ1 - из музея Института вирусологии АМН СССР.

Бактериофаги ДД-серии и ТЗ - из музея Тбилисского института вакцин и сывороток, фаг Л - из музея Института вирусологии АМН СССР.

2. Субстраты. ДНК фага Л и PBR-322 выделены нами. ДНК плазмиды pSH 12 предоставлена Е.А.Скрипкиным, ДНК вирусов животных предоставлены Народицким B.C.

3. Ферменты. РНК-аза - препарат фирмы "Serva" , проназа -препарат фирмы "Oalbiochem" , щелочная фосфатаза - препарат фирмы "Sigma", полинуклеотидкиназа фага Т4 - препарат фирмы "Miles" , лизоцим - фирмы "Reanal" , ДНК-лигаза фага Т4 - производства СКТБ БАВ Главмикробиопрома (Новосибирск). Рестриктирую-щие эндонуклеазы: Есо ei, Sal і предоставлены Б.С.Народицким, Sma I, Kpn I, Bfepi препараты фирмы "Miles" , Bsp El - препарат фирмы "Bochringer Mannheim".

4. Обменники, адсорбенты, реактивы: биогель А-0,5 m -препарат фирмы "Bio-Rad" , ФЦ PII - фирмы "Whatman", фенил-се-фароза, голубая сефароза - препараты фирмы "Pharmacia" , ДНК-целлюлоза - фирмы "РЬ-Biochemicais" , гепарин-сефароза синтезирована нами.

- 56 -В работе использовались: агароза фирмы "Bio-Rad", акрил-амид, метиленбисакриламид, и,я,я»,и*- тетраметилэтилендиашга и персульфат натрия фирмы "Reanal" и "Serva", СА, трис-НС1, СС, сахароза, тритон Х-100, сефароза 4В - фирмы "Sigma", глицерин, ЭДТА, хлорид цезия - фирмы "Serva", BISF - фирмы "Oalbio-chem" , соли - фирмы "Merck" и отечественного производства квалификации ^посч^п, f - Р-АТФ фирмы ".Amersham" , амфолиты -фирмы ЬКВ.

П. М е т о д ы

2.1. Выращивание бактериальной массы. Культивирование кле
ток E.coii ок осуществляли на полусинтетической среде до сере
дины экспоненциальной фазы роста /I/ или же на бульоне Хоттин-
гера до окончания фазы логарифмического роста. Бактериальную
массу клеток s.soimei 47 получали при выращивании на среде,
представляющей собой бульон Хоттингера или гидролизат казеина

с добавлением 2($ глюкозы. Культивирование проводили либо в ферментере модели Фразер (при выращивании E.coii <Ж)до 5-8х1Сг кл/мл, либо осуществляли непрерывное культивирование в установке FA-50 с рабочим объемом 30 л (для получения бактериальной массы S.soimei 47, а также E.coii OK).

5. Определение титра фага осуществляли по методу агаровых слоев /105/.

6. Передачу плазмидной ДНК осуществляли методом спот-скрещивания, используя в качестве реципиентного штамма E.coii f /I5ty_v

7. Колициногенную активность определяли согласно /97/.

8. Выделение и очистка плазмидной ДНК фенольным методом. Для идентификации и выделения плазмидной #НК по методу /205/

- 57 -клетки s.somiei 47 суспендировали в 0,25 М трис-HCI буфере рН 8,0 , содержащем 25$ сахарозы. Затем добавляли 0,5)5 раствор лизоцима до концентрации 0,3$ и инкубировали при 0С 5 минут. Действие лизоцима останавливали добавлением 0,25 М раствора ЭДТА. Лизис осуществляли в присутствии 1% sds . Основную массу хромосомной ДНК удаляли осаждением 5 М раствором NaOl. После центрифугирования при 18 000 об/мин в течение 30 минут надоеа-дочную жидкость, представляющую собой осветленный лизат исследуемых клеток, обрабатывали РНК-азой (100 мкг/мл) и проназой (200 мкг/мл). Депротеинизацию осветленного лизата проводили фе-нольной экстракцией. ДНК осаждали 2»5 объемами этанола. Плазмид-ную ДНК осаждали центрифугированием при 10 000 об/мин в течение I часа при -ЮС. Осадок растворяли в соответствующем объеме 0,01 М трис-НСІ рН 7,6.

2.6. Выделение и очистка плазмидной ДНК в градиенте OsOl . Для выделения ДНК РВК-322 , а также плазмид из штамма s.sonnei 47 использовали равновесное центрифугирование в градиенте OsOl /77/. Клетки, суспендированные в 25$ растворе сахарозы в 0,25 М трис-НСІ рН 8,0 , лизировали последовательным добавлением лизоцима, ЭДТА и лизирующей смеси. Последняя содержала 0,5$ дезокси-холата натрия, 1$ бридж-58, 0,05 М ЭДТА в 0,05 М трис-НСІ буфере рН 8,0. После лизиса клеток в смесь добавляли сухой CsCi (I г/мл) и ЭБ (700 мкг/мл), центрифугировали при 18 000 об/мин в течение I часа и доводили плотность раствора до 1,4010 сухим CsCL

Равновесное центрифугирование проводили на центрифуге L5-50 в течение 72 часов при 48 000 об/мин. Из препарата плазмидной ДНК ЭБ экстрагировали изоамиловым спиртом, CsCl удаляли диализом против 5 мМ трис-НСІ буфера рН 7,5.

7. Выделение ДНК фага Я осуществляли согласно /126/ методом фенол-детергентной экстракции.

8. Синтеэ гепарин-сефарозы проводили по методу /63/.

40 мл сефарозы 4В промывали 200 мл Н₂0 и суспендировали в 200 мл З М калий-фосфатного буфера рН 11,7. При постоянном перемешивании при 0С добавляли раствор BrCN в CH,CN (4 г в 4 мл). Через 30 минут активированную сефарозу отмывали 500 мл Н₂0 и добавляли 60 мл 0,5 % раствора гепарина в 0,1 Ш натрий-карбонатном буфере рН 9,0. После инкубации в течение 2 часов при 37С добавляли 10 мл 2 М раствора глицина для блокирования оставшихся активных групп. Через 2 часа сорбент промывали последовательно 10 объемами: Н₂0, 0,1 М натрий-карбонатного буфера рН 9,0 , 0,1 М натрий-ацетатного буфера рН 4,0 , Н₂0 и хранили в 0,25 М трис-HCI буфере рН 7,6 с 0,0]$ азида натрия при 4С. Выделение рестриктир.ующих эндон.уклеаз

2.9. Разрушение клеток и получение грубого экстракта прово
дили согласно стандартной процедуре /9,21/. Освобождение от нук
леиновых кислот и балластных белков осуществляли как осаждением
СС и СА, так и при хроматографии на биогеле А-0,5 m или голу
бой сефарозе.

10. Гельфильтрацию грубого экстракта на биогеле А-0,5 m проводили в колонке 2,5x100 см со скоростью 13 мл/час. Количество наносимого на колонку белка составляло 250-300 мг. В качестве рабочего буфера использовали 0,01 М трис-НСІ буфер рН 7,8 , содержащий 0,01 М МЭ, 0,2 тритона Х-100, I М ласі и Щ> глицерина. Объем фракций составлял 4 мл.

11. Аффинную хроматографию на гепарин-сефарозе осуществляли в колонке размером 0,6x5,0 см со скоростью 3 мл/час. Объем наносимого материала после гельфильтрации не превышал 20 мл.

- 59 -Рабочий буфер содержал 10 мМ трис-НСІ рН 7,65 , 5 мМ ЭДТА, 7 мМ МЭ, 100 мМ Nad , 0,1$ тритон Х-ЮО и 10$ глицерина. Для элюиро-вания белка использовали градиент NaCi от 0,1 М до 1,0 М, Объем градиента - 24 мл.

12. Аффинную хроматографию на денатурированной ДНК-целлюлозе проводили на колонке размером 0,6x10 см со скоростью 1,5 мл/час. Рабочий буфер такого же состава, как и для гепарин-сефарозы, но без тритона Х-ЮО. Фермент элюировали градиентом концентрации NaCi от 0,1 до 1,0 М. Объем градиента 12 мл.

13. Аффинную хроматографию на голубой сефарозе осуществляли согласно /56/. Грубый экстракт из 5 г клеток наносили на колонку с голубой сефарозой размером 0,9 х 6 см, уравновешенную 0,02 М трис-НСІ буфером рН 7,6 с 0,01 М Щ01₂ и 0,1 М МЭ. Объем колонки рассчитывали из соотношения: I г пасты на I мл сорбента. Белок элюировали линейным градиентом концентрации NaCi от 0 до 1,0 М. Объем градиента составлял 80 или 160 мл. Скорость фракционирования 10 мл/час. Объем фракций 5 мл.

14. Гидрофобную хроматографию на фенил-сефарозе осуществляли на колонке размером 0,6x2,0 см, уравновешенной 0,01 М калий' фосфатным буфером рН7,Зс7мММЭ, 1мМ ЭДТА и I М NaCl в случае очистки ЕЕсо ск или I М СА в случае выделения RSso її. Элюирование проводили комбинированным градиентом понижения концентрации соответствующей соли от I М до 0 и повышения концентрации полярного агента глицерина от 0 до 50$ при очистке Есо СЕ и тритона от 0,35$ до 0,6$ в случае очистки RSso II.

15. Катионообменную хроматографию на ФЦ PII проводили на колонке размером 1,2x20 см, уравновешенной 0,01 М калий-фосфатным буфером рН 7,3 , содержащим 7 мМ МЭ, I мМ ЭДТА, 0,1$ тритон Х-ЮО и 0,1 М HaCl. Скорость фракционирования 14 мл/час. Общий

- 60 -объем градиента 112 мл. Объем фракций 4 мл. Элюирование белка проводилось линейным градиентом концентрации NaCi от 0,1 до 1,0 М.

На всех этапах фракционирования определяли поглощение при 280 нм и наличие специфической активности при нанесении, промывке колонки и во фракциях градиента. Определение белка проводили по методу /168/.

16. Изоэлектрофокусирование проводили на колонках фирмы ькв объемом НО. и 440 мл. В качестве анодного буфера использовали 0,12 М Н,Р0^, содержащую 50^ сахарозы, в качестве катодного буфера - 0,25 Н ПаОН. Градиентный раствор представлял собой 1-2 раствор амфолитов с диапазоном рН 3,5-10,5 , содержащий 0,2% тритона Х-100, 7 мМ МЭ и глицерин, концентрация которого уменьшалась от катода (60$) к аноду (0$). ЙЭФ проводили при 4С в течение 48-64 часов при 800-1000 в. По окончании ЙЭФ собирали фракции объемом 3 мл, в которых добавлением I М Н^РО^ или IH NaOH подводили рН до значения 7,3. Далее в полученных фракциях тестировали рестриктазнуго активность.

17. Определение рестриктирующей активности осуществляли в инкубационной смеси объемом 30-50 мкл, содержащей I единицу активности фермента, I мкг ДНК и буферный раствор соответствующего состава (таблица 2). Время инкубации составляло 1-4 часа. Электрофорез продуктов реакции проводили согласно /192/.

18. Дигирование фрагментов ДНК проводили с использованием ДНК-лигазы фага Т4 в инкубационной смеси, содержащей 50 мМ трис-НСІ рН 7,6 , 5 мМ MfeCl₂ , I мМ МЭ, 50 мМ АТФ /96/. При ли-гировании фрагментов ДНК, имеющих "тупые" или "липкие" концы, концентрация ДНК составляла соответственно 200 мкг/мл или 100 мкг/мл. Аналогично, количество лигазы брали 2 или I единицу на

Таблица 2

Состав инкубационных сред для гидролиза ДНК различными рестриктазами

каждые 100 мкг ДНК. Реакцию вели при ПС в течение 10-15 часов и останавливали нагреванием инкубационной смеси при 65 в течение 5 минут.

2.19. Определение последовательности нуклеотидов в ДНК осуществляли, методом избирательной химической модификации азотистых оснований согласно /148/. В результате расщепления ДНК исследуемым ферментом полученные фрагменты обрабатывали последовательно щелочной фосфатазой и полинуклеотидкиназой фага Т4 /73, 87/. Меченые фрагменты подвергали рестриктазному гидролизу с

- 62 -целью получения пригодных для секвенирования фрагментов, содержащих радиоактивную метку лишь на одном конце.

Для частичной деградации азотистых оснований использовали следующие реакции: обработка ДНК 95$ гидразином для модификации Т и Ц, обработка ДНК 95$ гидразином в присутствии соли (4 М NaCi) для модификации Ц, метилирование Г с помощью диметилсульфата (10,7 М), обработка ДНК сильной щелочью (1,5 Н NaOH) при 90С для модификации А. Удаление модифицированных оснований из цепи ДНК осуществляли с помощью пиперидина (0,5 М). Разделение в денатурирующем (с 7 М мочевины) 8-20$ ПААГ фрагментов, полученных в результате 4-х видов модификаций, позволило определить чередование нуклеотидов в исследуемом участке.

2.20. Электрофорез белков проводили в денатурирующих условиях по методу /133/. По окончании фореза гели фиксировали в течение 10 минут в растворе, содержащем 5$ !ПХУ, 50$ этанол и 0,5$ формальдегид. Затем гели отмывали и проводили их окрашивание 100 мл раствора, содержащего 200 мкл 18 Н NaOH, 1,5 мл концентрированного аммиака и 4 мл 20$ азотнокислого серебра. После отмывки гели обрабатывали проявителем, 100 мл которого содержали по 0,1 мл 5$ раствора лимонной кислоты и 38$ формальдегида.

GKC: обнаружение, свойства, распространение, функции

Одним из важнейших естественных защитных барьеров у большинства бактерий служит система хозяйской специфичности ДНК История обнаружения СХС у бактерий подробно рассматривается в большом количестве обзоров и проблемных статей /2,27,29,35,36, 37,122,153,155,172/. В связи с этим мы остановимся на рассмот-рении лишь основных этапов исследования этой проблемы. Впервые СХС были идентифицированы как биологический феномен и целенаправленно исследованы в начале 50-х годов /61,140,141/. Авторы провели анализ взаимодействий фаг-клетка и продемонстрировали вариабельность в способности роста фага Я на клетках Е.СОІІ К и С при перекрестном титровании его на этих штаммах. Было показано, что эффективность роста фага зависит от его последнего хозяина, и на этом основании высказано предположение, что в основе явления ограничения, или защиты, и модификации фаговой ДНК лежат существующие в клетке определенные механизмы. Интенсивные исследования СХС позволили Арберу к середине 60-х годов доказать, что основой модификации является метилирование, а основой рестрикции - гидролиз ДНК /38,176/. Была принята осново-полагающая концепция двухкомпонентной ферментной системы - энзи-мологической основы СХС, представленной рестриктирующей эндонук-леазой и модифицирующей метилазой. Эндонуклеаза узнает специфическую последовательность оснований в молекуле ДНК, состоящую из 3-7 нуклеотидов и представляющую собой так называемый сайт узнавания, и затем осуществляет разрыв цепи ДНК в этом участке молекулы, гидролизуя ФДЭ связи между нуклеотидами. Фермент модификации узнает тот же самый сайт и метилирует один из его нуклеотидов таким образом, что ДНК оказывается защищенной от.действия собственного фермента рестрикции соответствующей специфической модификацией. При этом любая чужеродная ДНК может стать объектом рестрикции данного типа, т.к. она не защищена соответствующей модификацией. В результате проведенных Меселсоном /152/ биохимических экспериментов были выделены первые рестрик-тирующие эндонуклеазы Есо К и Есо В из штаммов E.coli к и Е.со-И в # с этого времени началось интенсивное изучение биохимии СХС. Интерес к СХС еще более усилился после выделения Смитом фермента рестрикции П класса /200/, определения узнаваемой этим ферментом нуклеотидной последовательности /128/ и использования его для анализа ДНК /81/. В 1972 г. посредством соединения фрагментов ДНК, полученных в результате действия рестриктазы Есо ж, была получена первая рекомбинантная ДНК /151/. Далее последовало бурное развитие генной инженерии благодаря интенсивному использованию ферментов рестрикции и поиску и выделению новых рестриктаз и их источников, а соответственно, и новых СХС.

Обзор литературы, отражающей проблемы, связанные с СХС, показывает, что системы рестрикции-модификации ДНК (r+m+) широко распространены в царстве прокариот /36,172/. К 1971 году СХС были обнаружены у представителей 8-ми родов микроорганизмов, включая как грам-положителыше - Bacillus, Streptococcus , так И грам-отрицательные бактерии - Salmonella, Escherichia. На основании этих данных Бойер /68/ постулировал общность механизма рестрикции-модификации у прокариот. В настоящее время присутствие СХС обнаружено, преимущественно с помощью биологических тестов, у представителей уже 38 родов бактерий, в том числе у таких высокопатогенных микроорганизмов, как возбудители чумы /6/, дифтерии /119/, дизентерии /8,19/. Из этих родов микроорганизмов наиболее продуктивен род Haemophilus : из 29 штаммов этого рода выделено 22 фермента рестрикции /172/. Довольно много специфических эндонуклеаз предоставили исследователям представители семейства Enterobacteriaceae: Escherichia, Salmonella, Proteus, Providencia, Enterobacter и другие /174,221/. Однако СХС, которым соответствуют выделенные ферменты рестрикции, не всегда всесторонне охарактеризованы как в отношении модифицирующего компонента системы, так и генетического детерминирования.

СХС с г+ и т+ системами обнаружены пока только у бактерий и фагов. В то же время сайт-специфические эндонуклеазы обнаружены и у сине-зеленых водорослей, также входящих в царство прокариот /84,120,121,124/» Вопрос о присутствии соответствующих модифицирующих метилаз у сине-зеленых водорослей не изучен. Специфические эндонуклеазы найдены и в ряде эукариотических клеток: у хламидомонады и тетрахимены /52/, в семенниках зеленой мартышки /70/, в культуре клеток BHK-I2 китайского хомячка /71, 82,204/.

СХС у прокариот следует рассматривать, как видо- и даже штаммоспецифические системы, защищающие клетку от внедрения в нее чужеродной генетической информации в виде вирусной, плазмид-ной или бактериальной ДНК. Одновременно о. защитной функцией система специфической рестрикции обеспечивает клетку материалом для рекомбинации, что для прокариот, лишенных регулярного полового процесса, весьма важно с эволюционной точки зрения. Полученные Чаш? и Коэн /74/ экспериментальные результаты позволили сделать заключение, что по крайней мере некоторые ферменты рестрикции образуют вместе с ДНК-лигазой клетки систему, осуществляющую сайт-специфическую рекомбинацию. Эти данные позволили авторам предположить, что эндонуклеазы рестрикции играют важную роль в эволюции плазмид, а возможно и хромосомного генетического материала. С другой стороны, системы рестрикции-модификации являются важным фактором половой изоляции и залогом существования вида как дискретной генетической единицы.

Аффинная хроматография

Группа аффинных сорбентов чрезвычайно разнообразна в силу существования широкого спектра лигандов, способных имитировать отдельные свойства или структурные компоненты естественного субстрата для рестриктаз. Иногда в качестве лиганда используется непосредственно нативная или денатурированная ДНК, как в случае ДНК-целлюлозы и ее модификаций на основе агарозы и акриламида /44,127,172,180/. Причем, как показали многочисленные эксперименты, рестриктазы взаимодействуют не только с двуспиральной ДНК, но также и с односпиральной. Так, рестриктирующая эндонук-леаза ВвеІ из штамма B.breve /47/ была очищена на двуспиральной ДНК-целлюлозе, Hinf ill- на двуспиральной ДНК-агарозе /127/. Наоборот, для Eco EI/I80/ позитивные результаты были получены при хроматографии на денатурированной ДНК-целлюлозе. Использование этого метода для очистки ферментов BSUEE иЕсо EI (таблица I) /180/ на завершающей стадии позволили довести препараты ферментов до гомогенного состояния. Приведенные примеры однозначно свидетельствуют в пользу аффинной хроматографии, которая основана на использовании естественной биологической функции рестриктаз.

В 1977 г, был описан метод аффинной хроматографии ферментов рестрикции на гепарин-сефарозе. Предпосылкой использования этого метода было обнаруженное сильное сродство гепарина к белкам, действующим на ДНК /63/. Объяснение этому явлению заложено в химической структуре гепарина, который является аналогом ДШ по двум критериям: во-первых, гепарин, как и ДНК, является полианионом; во-вторых, структурно гепарин аналогичен сахаро-фосфат-ной цепи ДНК, фосфатные группы которой заменены у гепарина суль-фогруппами. Была предложена упрощенная одностадийная схема быстрой и качественной очистки рестриктаз на гепарин-агарозе с предварительным осаждением нуклеиновых кислот PEI /63/. Авторы про-демонстрировали успешное применение такой схемы для 16 ферментов рестрикции, причем некоторые рестриктазы были получены в состоянии, свободном от интерферирующих активностей, другие требовали дополнительной очистки на ДЕАЕ-целлюлозе. Большим преимуществом хроматографии на гепарин-агарозе оказалась возможность разделения специфических эндонуклеаз из одного штамма, отличающихся близкими ионообменными свойствами, в связи с чем их не удавалось разделить с помощью ионообменной хроматографии» Так, в результате фракционирования на гепарине были успешно разделены рестриктазы Bgll и Bgl И , Нра I и Нра П, TaqI и Taq. II, Hind її и Hind щ. При нанесении на колонку с гепарин-агаро-зой грубого экстракта из клеток Neisseria cinerea был получен фермент їїсі I, свободный от неспецифических нуклеаз, с колоссальным выходом: 40 000 ед.активности на I г сырой пасты /46/« Присутствие стадии хроматографии на гепарин-агарозе в схеме очистки ферментов рестрикции ВЪе1/47/, Ben I /22/, Bgl I /14/ и других обеспечило получение особо чистых препаратов этих ферментов и, соответственно, их пригодность для использования в экспериментах по исследованию тонкой структуры ДНК и в генной инженерии.

В 1978 г. две группы исследователей сообщили о новом способе очистки рестриктаз методом аффинной хроматографии на голубой сефарозе, где в качестве лиганда был использован полиароматический краситель Oibacron blue F3GA /56,99/. Предпосылкой успешного использования этого сорбента при выделении рестриктаз послужили данные о том, что для ферментов, имеющих участки связывания с нуклеотидами, имеет место специфическое аффинное сродство к голубому декстрану, содержащему указанный краситель /213» 225/. Было установлено, что хромофоры, входящие в состав красителя, содержат отрицательно заряженные сульфогруппы, которые могут имитировать фосфатные группы ДНК, что важно для "узнавания" лиганда ферментом, и/или обеспечивать связывание фермента с лигандом за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий /56,72/. Бакси с соавт. продемонстрировали очистку на голубой сефарозе четырех рестриктаз Ват ЕЕ, Pal I, Zho и Bgl I /56/. Другая группа применила ЭТОТ сорбент для очистки Hinf ш, Xba I, Pst I /99/. Большим преимуществом метода оказались простота и рациональность его использования для очистки ферментов рестрикции. Хроматография на голубой сефарозе позволяет быстро в малых объемах из небольших количеств биомассы выделять ферменты рестрикции. Избирательный способ разделения рестриктаз на голубой сефарозе, основанный на биоспецифических взаимодействиях, обусловливает универсальность этого метода в отношении различных ферментов рестрикции, что подтверждается изложенными выше данными. Подобное сочетание факторов простоты и универсальности, объединенных в одной процедуре, позволяет использовать этот метод для тестирования большого количества штаммов на наличие спе - 49 -цифической эндонуклеазной активности. Использование на I стадии очистки голубой сефарозы или биогеля А-0,5т имеет ряд принципиальных различий. В последнем случае происходит освобождение грубого экстракта преимущественно от нуклеиновых кислот, а эффективной очистки от балластных белков достичь не удается /54/» Фракционирование грубого экстракта на голубой сефарозе объединяет, по крайней мере, два, обычно последовательных, события: освобождение грубого экстракта от нуклеиновых кислот и непосредственно фракционирование ферментативной активности в среднем с 30-кратной очисткой ее от балластных белков, в том числе и от неспецифических нуклеаз /56/,

Помимо голубой сефарозы существует еще несколько видов аффинных сорбентов, которые содержат в качестве лигандов иные, чем Oibacron blue, полиароматические красители. Это так называемые "красная", "зеленая" и "желтая" сефарозы. Оцнако потенциал полиароматических лигандов для аффинной хроматографии этим не исчерпывается. Подтверждением служит синтез нового сорбента -фолат-сефарозы /10/, где в качестве лиганда к сефарозе ковалентно привязана фолиевая кислота. Структурное сходство фолиевой кислоты с полиароматическими красителями обеспечивает специфическое взаимодействие фермента с сорбентом. Эффективность хроматографии на фолат-сефарозе была продемонстрирована при очистке рестриктазы Есо ш. (таблица I). Одностадийное фракционирование грубого экстракта из клеток E.coli RY13 на фолат-сефарозе позволило получить очищенный фермент с удельной активностью в два раза выше по сравнению с Есо El , очищенным на голубой сефарозе. Таким образом, на основании изложенного фактического материала можно сделать вывод, что применение аффинной хроматографии является высокоэффективным, универсальным методом для очист - 50 -ки всех специфических эндонуклеаз, а метод фракционирования на голубой сефарозе открывает уникальную возможность прямого биохимического скрининга специфических эндонуклеаз в различных объектах,

Гидрофобная хроматога_фия. Принцип метода гидрофобной хроматографии заложен в индивидуальности химической структуры белковых молекул и состоит в том, что нековалентные гидрофобные участки, расположенные на их поверхности, участвуют в нековалент-ных взаимодействиях с гидрофобными лигандами, связанными с нерастворимым носителем /161/. Впервые уникальность гидрофобных свойств рестриктирующих эндонуклеаз была продемонстрирована при очистке их на сорбентах, представляющих собой аминоалкильные производные агарозы (сефарозы) с заместителями с длиной цепи от 3 до 7 атомов углерода /172,191/. Так, со -аминопентиясефароза была успешно использована при очистке рестриктаз Hhal/53/, Xba 1/236/, Sal I /41/, Bam ЕЕ /227/, аминогексилсефароза была применена при очистке Xho її /12/.

Культивирование штаммов-продуцентов рест-риктаз

Так как процесс получения препаратов специфических эндо-нуклеаз включает, в первую очередь, выращивание биомассы штаммов-продуцентов, содержащих высокоактивные рестриктирующие ферменты, а затем уже выделение и очистку этих ферментов, то следующий этап биологической работы был связан с подбором оптимальных условий культивирования штаммов. Условия выращивания Е.СОІІ СК были отработаны ранее, поэтому выращивание этого штамма осуществляли согласно описанной методике /I/.

В связи с патогенностью s.sonnei 47 , эта часть эксперимента осуществлялась в лаборатории физиологии микроорганизмов Института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова МЗ СССР совместно с И.М.Грубер. Штамм s.sonnei 4-7 выращивали в ферментере с рабочим объемом 30 л. В результате проведенной серии предварительных экспериментов были подобраны следующие условия выращивания: I) перемешивание двухлопастной мешалкой - 800 об/мин; 2) поддержание парциального давления растворенного в среде кислорода на уровне 30-40$ от полного насыщения путем изменения объема подаваемого в ферментер воздуха (от I до 5 л/мин); 3) рН среда поддерживали на уровне 7,2 путем автоматической подачи 10/5 їТаОН ; 4) для продления фазы логарифмического роста клеток и, соответственно, увеличения выхода биомассы в среду дополнительно подавалась глюкоза до конечной концентрации 0,2%. Результаты культивирования s.sonnei 47 представлены в таблице 4. Максимальная удельная скорость роста (уИтах = 1,34 час"1)приходится на 3 часа выращивания. При этом интенсивный рост культуры удается продлить до 5 часов путем дополнительной подачи глюкозы. По истечении этого времени выращивания наблюдается замедление удельной скорости роста клеток, а начиная с 6-го часа наступает стационарная фаза роста культуры. Приведенные в таблице результаты титрования фага ДДШ с фенотипом "нулевого" штамма на клетках s.sonnei 47 , отобранных на трех стадиях выращивания, соответствующих разгару и окончанию экспоненциальной фазы и стационарной фазе роста, свидетельствуют о стабильной рестриктирующей способности клеток независимо от стадии выращивания. Выход биомассы к окончанию фазы логарифмического роста почти в два раза превысил таковой в период максимально интенсивного роста культуры, а к окончанию культивирования составил 38 г/л (см. таблицу 4). Однако посев культуры с целью определения числа жизнеспособных клеток показал, что число живых клеток уменьшается в процессе культивирования и в стационарной фазе составляет лишь 75% от общего числа клеток (таблица 4).

Этот факт обусловлен частичным автолизом культуры. Кроме того, для большинства штаммов-продуцентов рестриктаз показано, что к началу стационарной фазы в клетках заметно повышается содержание неспецифических нуклеаз /172/. В силу этих обстоятельств культивирование клеток прекращали с окончанием экспоненциальной фазы роста. Выход влажной биомассы составил 30 г/л. Полученную биомассу хранили при -20С и использовали для выделения рестриктирующих ферментов. Срок хранения биомассы без существенной потери специфической ферментативной активности составляет не менее двух лет.

Присутствие новых, отличных от известных колийных СХС Sso 47 и Eco СК послужило причиной целенаправленного осуществления работы по биохимическому изучению рестриктирующей активности в штаммах s.sonnei 47 и Е.соїі СК.

Поскольку биохимическая идентификация фермента, как правило, невозможна в грубом экстракте на фоне неспецифического нуклеазного гидролиза, то первостепенной задачей является освобождение клеточного экстракта наиболее простым и быстрым способом от балластного материала, интерферирующего специфическую активность. С решением этой задачи неразрывно связана проблема последующего выделения и очистки специфической эндонуклеазы, что сопряжено с немалыми методическими трудностями. Но независимо от того, насколько сложной окажется в конечном итоге схема очистки фермента, начальные этапы во всех схемах, как правило, идентичны и состоят из следующей последовательности процедур: дезинтеграции клеток штамма-продуцента и получения грубого экстракта, который, при необходимости, освобождается от нуклеиновых кислот и балластных белков последовательной обработкой СС и СА. Далее следуют одна или несколько стадий колоночной хроматографии, которые непосредственно позволяют осуществить биохимическую идентификацию, выделение и очистку ферментов рестрикции. Для решения этих задач нами были использованы аффинная, ионообменная, гидрофобная хроматография, гельфильтра-ция, а также изофокусирование на амфолинах. 2. Рестриктирующий компонент СХС Есо СК 2.1. Выделение и очистка рестриктазы Есо СК Большие трудности, связанные с выделением фермента Есо СК в особо чистом виде, были обусловлены высоким содержанием неспецифических нуклеаз в штамме-продуценте. Использование ионообменной хроматографии на ФЦ РІІ оказалось неэффективным в применении к данному ферменту, т.к. рестриктирующая активность была крайне нестабильна и тестировалась только в присутствии т-РНК - конкурентного ингибитора нуклеаз /7/.

Поэтому, в качестве первой стадии очистки при разработке схемы выделения свободного от нуклеаз ферментного препарата следовало подобрать такой обменник или адсорбент, который позволил бы в первую очередь добиться освобождения от основного количества балластного белкового материала, в том числе - от протеаз, и обеспечить достаточно высокий выход активного и стабильного фермента.

Изоэлектрофокусирование на амфолинах

В результате проведенных нами исследований метод гельфиль-трации мог бы быть рекомендован как промежуточный этап выделения ЕЕсо ск для получения и накопления стабильного, свободного от нуклеиновых кислот и в значительной степени от балластных белков, но недостаточно очищенного от нуклеаз ферментного препарата, предназначенного для дальнейшей очистки.

В качестве следующей стадии очистки Есо СК успешной оказалась процедура хроматографии на гепарин-сефарозе. Результаты фракционирования представлены на рис. 2. Как видно из рисунка, значительная часть неспецифических нуклеаз элюируется с сорбента при нанесении материала, а фермент прочно связывается с об-менником и элюируется градиентом концентрации Ша01 , при этом отдельные фракции фермента, а именно с б по 10, практически свободны от нуклеаз. На электрофореграмме (рис. 2-2) отчетливо видна фрагментация ДНК ферментом Есо СК, проведенная в отсутствие т-РНК. Суммарный же препарат всех активных фракций фермента еще загрязнен неспецифическими нуклеазами, хотя тоже может быть тестирован в отсутствие т-РНК. (рис. 2-3). Таким образом, в результате фракционирования на гепарин-сефарозе препарат фермента существенно освобождается, хотя и не в полной мере, от неспецифических нуклеаз.

Аналогичный препарат фермента после гель-фильтрации на биогеле А-0,5 m подвергался хроматографии на другом аффинном сорбенте - денатурированной ДНК-целлюлозе. Предварительно было установлено, что с нативной ДНК-целлюлозой Есо СК не связывается. По сравнению с гепарин-сефарозой в данном случае фермент элюировался в градиенте Касі значительно более узким пиком. При этом он практически не перекрывался с пиком неспецифической нуклеазной активности, который был смещен в область более высокой ионной силы. Фермент также тестировался в отсутствие т-РНК. Лишь в концентрированном препарате фермента после глицеринового диализа наблюдалась остаточная нуклеазная активность, которая была существенно ниже по сравнению с неспецифи-феской активностью, характерной для фермента после очистки на гепарин-сефарозе.

Таким образом, эффективными процедурами очистки ЕЕсо ок после гельфильтрации оказались очистка на денатурированной ДНК-целлюлозе и гепарин-сефарозе. В связи с тем, что фракционирование на каждом из этих сорбентов не обеспечивало исчерпывающей очистки от нуклеаз, стала очевидной необходимость использования трех стадий для очистки фермента. Были испробованы две схемы: биогель А-0,5т- ДНК-целлюлоза - гепарин-сефароза и биогель А-0,5т - гепарин-сефароза - ДНК-целлюлоза. В результате было показано, что использование первого варианта схемы очистки позволяет полностью удалить остаточную нуклеазную активность из препарата фермента, что делает его пригодным для генно-инженерных работ. Выход REco ок составил 120 единиц активности на I г биомассы (таблица 12).

Кардинально усовершенствовать и упростить метод получения Есо СК позволила также аффинная хроматография, но на другом сорбенте, а именно - на голубой сефарозе. Использование голубой сесрарозы для выделения Есо СК было обусловлено высокой эффективностью данного сорбента в плане очистки рестриктаз, а также преимуществами его практического применения /56/. В частности, к ним относятся простота и рациональность процедуры хроматографии на голубой сефарозе, позволяющие из небольшого количества биомассы в малых объемах получать рестриктазы в концентрированном виде и пригодные не только для тестирования, но и для физического картирования ДНК. При этом исключаются стадии осаждения СА и СС в отличие от стандартных схем. Более подробно эти данные изложены во П главе обзора литературы в разделе "Аффинная хроматография".

Уже на 1-ой стадии очистки грубого экстракта из клеток E.coli ск на этом сорбенте был получен фермент, активность которого определялась в отсутствие т-РНК. На рис. 3 представлены результаты титрования фракций градиента с голубой сефаро-зы. Высокое сродство Есо СК к этому сорбенту проявилось в том, что фермент элюировался лишь в последних фракциях градиента NaCi , соответствующих концентрации соли 0,9-1,0 М. Неспецифический нуклеазный гидролиз тесторной ДНК фага А наблюдается на рисунке в виде светящихся треков в области 0,1 и 0,5 М NaCi, что соответствует двум пикам неспецифических нуклеаз. Столь четкое разделение пиков неспецифической и специфической активности является большим преимуществом метода. Полученный ферментный препарат был высоко активен: 3 мкл фермента обеспечивали полный гидролиз I мкг ДНК фага Я за I час инкубации, а также в незначительной степени был загрязнен нуклеазами, что делало его пригодным для физического картирования ДНК.

Похожие диссертации на Рестриктирующие компоненты системы хозяйской специфичности ДНК бактерий коли-дизентерийной группы

Окислительная модификация компонентов системы крови в норме и при эндогенной интоксикации : на примере хронических дерматозовЩелчкова, Наталья Александровна

Влияние ароматических аминов на интенсивность процессов перекисного окисления липидов и некоторые компоненты антиоксидантной системы печени крысЛомоносова, Елена Евгеньевна

Влияние тепловой обработки на компоненты антиоксидантной системы молока и его интегральную антиоксидантную активностьЩербакова, Юлия Владимировна

Получение фибрин-мономера и анализ результатов фотометрического определения компонентов фибринолической системы кровиТитаева, Елена Владимировна

Гетерогенность свойств основных РНК-компонентов белоксинтезирующей системы клетки в связи с биологическими особенностями зерновых культурНасонов Андрей Иванович

Исследование компонентов протеолитических систем крови в качестве субстратов цистеиновых катепсинов Фаенкова Вера Петровна

Конструирование и функционирование рекомбинантных белков, составленных из компонентов холестеринмонооксигеназной/лиазной системыНазаров Павел Александрович

Факторы, определяющие субстратную специфичность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Escherichia coli и человекаСидоренко Виктория Сергеевна

Сравнительная характеристика ДНК коринеморфных бактерий Фомин Борис Андреевич

СИСТЕМА РЕПАРАЦИИ ДНК У БАКТЕРИИ MYCOPLASMA GALLISEPTICUMГОРБАЧЕВ АЛЕКСЕЙ ЮРЬЕВИЧ