Содержание к диссертации
Введение
1 Зависимость процесса инициации транскрипции от структуры промотора 10
1.1. Влияние структуры ДНК на процесс регуляции функционирования промотора 11
1.2. Дополнительные элементы структуры промоторной ДНК, влияющие на активацию транскрипции 19
1.3. Особенности взаимодействия RNAP с промоторной ДНК 22
2 Основные принципы молекулярного взаимодействия регуляторных белков и промоторной ДНК в процессе транскрипции 24
2.1. Влияние структуры белка на процесс регуляции функционирования промотора 24
2.2. Позитивная регуляция транскрипции генов. Структура белка CRP 26
2.3. Классификация CRP-зависимых промоторов 29
2.4. Взаимодействие CRP и РНК-полимеразы при активации транскрипции с промоторов класса I и П 32
2.5. Дополнительные элементы структуры CRP и его гомологов, способные влиять на активацию транскрипции 35
2.6. Активация транскрипции в промоторах, содержащих несколько сайтов узнавания комплекса CRP-cAMP 37
2.7. Репрессия транскрипции комплексом CRP-cAMP 39
2.8. Строение и регуляция гена сгр 41
2.9. Катаболитная репрессия 42
2.10. Строение и регуляция гена суа 44
2.11. Негативная регуляция транскрипции генов 45
3 Особенности регуляции транскрипции генов катаболизма нуклеозидов 48
3.1. Регуляция транскрипции deo оперона 48
3.2. Регуляция транскрипции гена cytR 49
3.3. Структура белка CytR 50
3.4. Взаимодействие CytR и комплекса CRP-cAMP при регуляции транскрипции 53
3.5. Общая характеристика генов CytR регулона 56
4 Материалы и методы 61
4.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и среды 61
4.2. Генно-инженерные методы 64
4.3. Конструирование рекомбинантных плазмид 67
4.4. Методы анализа рекомбинантных плазмид 68
4.5. Определение активности ферментов 70
5 Изучение структурно-функциональной организации промотора гена udp Е. coli 71
5.1. Получение мутаций в регуляторной области гена udp E.coli и их первичная характеристика 73
5.2. Изучение влияния структуры - 10 области на эффективность экспрессии промотора гена udp Е. coli 11
5.3. Изучение влияния мутаций в области блока Прибнова на экспрессию промотора udpP+ 79
5.4. Изучение влияния мутаций в 35 области и в области CRP-связывающих сайтов на экспрессию промотора udpP+ 81
5.5. Сравнительный анализ эффективности промоторов генов udp и lacZ 88
6. Изучение влияния структуры +1 области гена udp Е. coli на эффективность инициации транскрипции промотора 89
6.1. Уточнение точки инициации транскрипции гена udp Е. coli 90
6.2. Изучение функциональной значимости поли-Т структуры в области инициации транскрипции гена udp Е. coli. 95
- Дополнительные элементы структуры промоторной ДНК, влияющие на активацию транскрипции
- Дополнительные элементы структуры CRP и его гомологов, способные влиять на активацию транскрипции
- Взаимодействие CytR и комплекса CRP-cAMP при регуляции транскрипции
- Получение мутаций в регуляторной области гена udp E.coli и их первичная характеристика
Введение к работе
Актуальность темы. Изучение транскрипции прокариотических генов является важным направлением развития молекулярной биологии. Несмотря на то, что этот процесс достаточно хорошо изучен, особенно на модели Е. coli, интерес к исследованиям в этой области не ослабевает, т.к. именно на этапе транскрипции осуществляется наиболее эффективная регуляция экспрессии генов. В результате становится возможным произвольное изменение уровня активности промоторов и создание штаммов-продуцентов различных биологически активных веществ. Кроме того, возможность направленного изменения активности клеточных белков на уровне экспрессии их генов создает предпосылки для разработки узкоспециализированных химиотерапевтических агентов, например, для лечения онкозаболеваний. Так известно, что в раковых клетках резко возрастает количество белка группы фосфоролиза нуклеозидов - уридинфосфорилазы (Vita А., 1986, Bose R., 1974), продукта гена udp (Walton L., 1989), что часто приводит к метастазированию опухоли (Liu М., 1998). В связи с этим проводились работы по клонированию соответствующих генов и изучению свойств уридинфосфорилаз из различных про- и эукариотических организмов (Kouni М.Н., 1988, Takehara М., 1995, Watanabe S.-L, 1995, Watanabe S.-L, Uchida Т. 1995, Avraham Y., 1990, Sounders B.P.,1969). Изучение регуляции транскрипции этого гена позволит в дальнейшем создать агенты, способные целенаправленно регулировать концентрацию уридинфосфорилазы в клетке.
Транскрипция любого гена является многостадийным и многофакторным процессом белок-белкового и белок-нуклеинового взаимодействия. Изучению этого процесса на модели гена udp Е. coli посвящены многие работы (Mironov А, 1979, Brikun I., 1996), в которых рассмотрены основные этапы транскрипции и определены основные регулирующие белковые факторы. Однако имеющиеся данные не позволяют пока составить полного представления о процессах, происходящих на промоторе udpP. Например, оставалась неясной функция поли-Т структуры в области старта транскрипции, которая является характерной особенностью этого гена и присутсвует также у udp S. typhimurium. Кроме того, сравнительный анализ генов udp Е. coli, S. typhimurium, Y. pseudotuberculosis и V. cholerae выявил высокую консервативность структурных элементов промотора (Zolotukhina М., Ovcharova L, 2003). Однако, наблюдающиеся различия в эффективности экспрессии гена udp у
7 этих бактерий, свидетельствуют о сложности и неоднородности взаимодействий различных регуляторных белков с промоторной областью udpP. В связи с этим представляется актуальным проведение функционального анализа структурных элементов этого промотора.
Ген udp входит в состав так называемого CytR-регулона, контролирующего экспрессию генов катаболизма и транспорта нуклеозидов в клетке. Важно подчеркнуть, что, по меньшей мере, три промотора deoP2, cddP, nupG обладают сходной с промотором гена udp структурой. Поэтому уточнение механизмов транскрипции гена udp позволит создать более полное представление о регуляции всех генов этой группы.
В классической работе (Jacob F., 1961), ставшей основой для создания концепции оперона, указывалось, что регуляция синтеза белка на уровне транскрипции гена повышает уровень жизнеспособности клетки и приводит к экономному использованию ресурсов. Следовательно, можно предположить, что на начальных этапах эволюции до появления элементов регуляции, большинство бактериальных генов находилось под контролем промоторов, экспрессия которых осуществлялась конститутивно и не зависела от дополнительных белковых факторов. В процессе эволюции генома Е. соН в структуре промоторов могло происходить накопление спонтанных мутаций, снижающих его активность и одновременно обусловливающих зависимость экспрессии промотора от присутствия специфических регуляторных белков, которые, в свою очередь, модулировали активность промотора в зависимости от условий среды обитания. В связи с этим представлялось актуальным проведение направленной поэтапной модификации строго регулируемого природного промотора гена udp в конститутивный путем сайт-направленного мутагенеза различных структурных элементов промотора. Другими словами, мы попытались реконструировать процесс, обратный тому, который, по-видимому, происходил в процессе эволюции бактериальных промоторов, с целью выявления возможных причин и способов, используемых клеткой для создания регулируемых промоторов.
Цель и задачи исследования. Настоящая работа выполнялась с целью проведения функционального анализа структурных элементов регуляторной области гена udp Е. соН и уточнения механизмов ее позитивной и негативной регуляции, а также процесса инициации транскрипции. Достижение указанной цели было связано с решением следующих задач:
8 проведение направленного мутагенеза в области старта транскрипции, для получения набора мутантных промоторов, позволяющего изучить механизм функционирования этой области; проведение направленного мутагенеза пентамерных мотивов 5'-TTGCG-3' и 5'-CGAAAA-3' и получение коллекции мутантных промоторов, позволяющих проследить функциональную взаимосвязь между-10 и — 35 областью; проведение направленного мутагенеза в участках связывания белка-активатора и —35 области, для получения мутантных промоторов, позволяющих изучить взаимодействия между RNAP и CRP; определение стартов транскрипции генов udp Е. coli, S. typhimurium, Y. pseudotuberculosis и V. cholerae.
Научная новизна. Проведен систематический анализ структурных элементов промотора гена udp с помощью сайт-специфического мутагенеза. Выявлено функциональное перекрывание этих элементов как на стадии узнавания промотора RNAP, так и на стадии инициации транскрипции. При сравнении эффективности экспрессии мутантных промоторов с различными заменами в -10 области выявлено наличие конкуренции между белками CytR и RNAP за связывание в промоторной области гена udp с белком-активатором CRP. На основе мутантных промоторов с модифицированной —35 областью впервые показана способность RNAP конкурировать с комплексом cAMP-CRP за связывание с промотором при наличии близкой к консенсусу -35 области. Изучение мутантных вариантов промотора udpP с модифицированными сайтами связывания белка CRP позволило доказать, что присутствие белка-активатора на сайте CRP2, на фоне поврежденного CRP1-сайта, способствует повышению уровня экспрессии промотора udpP.
Проведение экспериментов по изучению транскрипции гена udp на стадии инициации позволило сделать вывод о способности единственной замены — 15С—>Т на фоне консенсусной -10 области приводить к независимой транскрипции промотора.
Установлено, что инициация транскрипции гена udpP сопровождается ярко выраженным слипадж-эффектом. При этом в качестве старта транскрипции могут использоваться несколько соседних тиминовых нуклеотидов, Выявлено, что самым эффективным при этом является остаток тимина в положении -1. Также показано, что остаток гуанина в положении +3 может выступать и в качестве дополнительного старта, и выполнять функцию структурного стабилизатора транскрипта, способствуя переходу транскрипционного комплекса к стадии элонгации.
Обнаруженная нами способность структуры СЯР2-сайта оказывать влияние на выбор RNAP стартового нуклеотида, выявленная на фоне близких к консенсусным -10 и —35 областей, подтверждает факт функционального перекрывания структурных элементов промотора udpP на стадии инициации транскрипции.
Практическая значимость. Методом сайт-направленного мутагенеза получена коллекция штаммов, содержащих промоторы с мутациями в различных элементах структуры, которая может быть использована для дальнейших исследований в этой области.
Установлен факт наличия конкуренции между регуляторными белками и RNAP за связывание с промотором.
Показано, что выбор RNAP инициирующего нуклеотида зависит от присутствия в структуре промотора элементов, ответственных за положительную регуляцию. Полученные результаты могут быть использованы при изучении генов, обладающих подобной структурой, учитывая, что ген udp является членом CytR-регулона, в котором несколько промоторов имеют сходную структуру.
В результате работы установлено, что промотор гена udp в условиях дерепрессии является не менее эффективным, чем имеющие большую практическую и научно-исследовательскую значимость промоторы lacZ и lacUV5, и может быть использован для создания высокоэффективного экспрессионного вектора. Так, в ходе исследований на основе мутантных промоторов создан набор рекомбинантных плазмид, позволяющих осуществлять экспрессию гена реперного белка с требуемой эффективностью.
Структура работы. Диссертация изложена на 131 листе машинописного текста, включая 19 рисунков и 7 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей: описание материалов и методов, изложение и обсуждение результатов, выводов и списка используемой литературы. Список литературы включает 245 работ отечественных и зарубежных авторов. .Апробация работы. Материалы исследования по теме диссертации опубликованы в четырех статьях. Диссертационная работа бьша апробирована на семинаре секции "Молекулярная биология" ГосНИИгенетика 1 декабря 2003 года.
10 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Дополнительные элементы структуры промоторной ДНК, влияющие на активацию транскрипции
В качестве дополнительного элемента промотора, способного компенсировать отсутствие выраженной —35 области, можно назвать "TG" мотив. Этот элемент найден у целого ряда прокариотических промоторов, и расположен непосредственно за -10 областью в положении -15, -14 п.н. Впервые этот элемент был обнаружен на промоторе ХРге [193]. Данный промотор не узнается RNAP самостоятельно и требует присутствии фагового активатора транскрипции сП. Присутствие "TG" мотива, удлиняющего -10 область, делает несущественным отсутствие сколько-нибудь выраженной последовательности —35 области, что также было показано на примере промотора Р22 Pant [108]. На примере galPl промотора было показано, что замена основания —14G на -14С, -14Т или перемещение -14G— —13G, снижает эффективность мотива в 3 раза [41]. Также указывалось, что TG-мотив может иметь форму TxTGx, располагаясь сразу за -10 областью[234]. Было показано, что при делеции 84 а.к., соответствующих домену 4,2 о70 -субъединицы RNAP, ответственному за взаимодействие с —35 областью, холофермент терял способность взаимодействовать с полноценным промотором, но продолжал инициировать транскрипцию на промоторе с «удлиненной» -10 областью [114]. Дальнейшие работы выявили способность домена 2,.5 а70-субъединицы специфически взаимодействовать с "TG" мотивом [15]. В некоторых бактериальных промоторах встречается дополнительный третий элемент промоторной последовательности [215, 122], усиливающий действие -10 и -35 области. Он был открыт при изучении группы генов ггп [181,147, 185]. Транскрипты семи очень «сильных» генов rrn E.coli, кодирующих рибосомальные РНК, составляют около 60% всей РНК, синтезируемой быстро растущей клеткой. Высокий уровень транскрипции поддерживается благодаря АТ-богатой последовательности размером около 20 п.н., расположенной сразу за -35 областью. На примере промотора ггпВ показано, что при наличии этой последовательности эффективность промотора повышается в 30-70 раз. Эта последовательность носит название UP-элемент. Исследования показали, что UP-элемент (гена гтВЇ) функционирует in vitro в транскрипционной системе, содержащей только промоторную ДНК и очищенную RNAP. ДНКазный футпринтинг показал, что RNAP закрывает собой все 20 п.н. UP элемента.
Расположение UP элемента относительно старта транскрипции в разных промоторах отличается, но всегда сохраняется соответствующая фаза спирали. Для UP-элемента предложена консенсусная последовательность, которая способна повышать эффективность промотора в 326 раз, что почти в 5 раз выше, чем UP-элемент дикого типа из ггпВ1[63]. Консенсусная последовательность содержит два консервативных региона: (5 -AAA(a/t)(a/t)T(a/t)TTTT-3 ) и (АААА), которые разделены 2 п.н. Мутационный анализ показал, что каждый регион способен функционировать в одиночку. На примере malT и lac промоторов была доказана зависимость эффективности влияния UP-элемента на транскрипцию от его расположения на промоторе, в частности на образование продуктивного или непродуктивного транскрипционного комплекса [207, 62]. В интересной работе W. Ross и др. [180] исследована роль UP-элемента на примере шести промоторов: ггпВ2, rrnD PI, RNAII, merT, lac и APR. Эффективность влияния элемента на транскрипцию изменялась в большом диапазоне от 1,5 до 90 раз, и в основном зависела от сходства структуры элемента с консенсусной последовательностью. Эксперименты с производными RNAP показали, что деления около 100 С-концевых аминокислот а-субъединицы RNAP позволяет ферменту осуществлять транскрипцию на базальном уровне [89]. Однако такие производные не способны образовывать контакт с UP-элементом. Дополнительные эксперименты с очищенной сс-субъединицей показали способность последней узнавать и связываться с UP-элементом. Дальнейшие работы показали, что 85 С-концевых аминокислот а- субъединицы RNAP образуют компактный домен (aCTD), способный к димеризации и связыванию ДНК. aCTD связан с остальной частью RNAP через чувствительную к протеазам аминокислотную цепь длиной 13-20 остатков, не обладающую регулярной структурой. Видимо эта связующая цепь обеспечивает разнообразие взаимодействий aCTD с промоторами разного типа [34]. Кроме того выявлено, что взаимодействие a-субъединицы RNAP с UP-элементом стимулирует также протекание дальнейших стадий инициации транскрипции [168,204]. Известно, что CRP также взаимодействует с aCTD RNAP. Возможно, это взаимодействие компенсирует высокоэффективное связывание RNAP с UP-элементом в промоторах, не обладающих этим структурным элементом. В таком случае, взаимодействие с UP-элементом обеспечивает постоянную, а взаимодействие с cAMP-CRP избирательную активацию транскрипции. Наличие в структуре промотора UP-элемента повышает активность, но не изменяет зависимость промотора от CRP. Кроме того, на активность промотора влияет расположение UP-элемента. Максимальная активность наблюдалась в положениях -76 и -86 п.н. при сайте с центром в области -43,5 п.н. Предполагается, что в этих положениях UP-элемент находится с одной стороны спирали ДНК вместе с API регионом CRP и aCTD RNAP и имеет возможность взаимодействовать с ними одновременно. Предлагается три модели такого взаимодействия. По первой модели С-концевые домены обеих a-субъединиц являются связанными с UP-элементом, а для обеспечения взаимодействия с комплексом cAMP-CRP происходит изгиб ДНК. По второй модели, два aCTD попеременно занимают два положения, обеспечивающие оптимальное взаимодействие с UP-элементом, а затем необходимый контакт с cAMP-CRP. Третья модель предполагает, что один aCTD взаимодействует с UP-элементом, в то время как второй обеспечивает контакт с первым по ходу промотора мономером CRP димера. Для окончательного выяснения механизма регуляции необходимы эксперименты с двумя по-разному меченными aCTD RNAP [126].
Изучение структуры промотора galPl выявило важность ещё одного региона в процессе активации транскрипции. Это область от -10 до +20 п.н. принимает участие в последней стадии образования открытого комплекса [118]. Позднее область, расположенная после сайта инициации транскрипции в районе от +1 до +20 нуклеотида, получившая наименование DSR-элемента [32]. DSR-элементы могут in vivo увеличивать активность промотора более чем в 10 раз. Однако в экспериментах in vitro, выполненных в условиях варьирования концентрации RNAP, каких-либо изменений в эффективности образования открытого комплекса не наблюдалось. Поэтому предполагается, что DSR-элементы влияют на транскрипцию на стадии образования инициирующего комплекса. Результаты исследований in vitro показали, что эти элементы могут влиять на уровень абортивной инициации транскрипции. 1.3. Особенности взаимодействия RNAP с промоторной ДНК Известно, что а-субъединица RNAP необходима для обеспечения связывания с промотором и покидает фермент с началом процесса удлинения цепи вновь образующейся РНК [22]. Расплетание ДНК на приблизительно полтора витка происходит за счет энергетически выгодных взаимодействий между промотором и RNAP. Предполагается, что одним из таких выгодных контактов является взаимодействие одной субъединицы RNAP с нематричной нитью в области «плавления». RNAP первоначально узнаёт основания незначащей цепи -10 области и эти специфические контакты сохраняются даже после плавления дуплекса ДНК. Участие а7 субъединицы во взаимодействии с нематричной нитью было подтверждено предпочтительным взаимодействием этой субъединицы с одно-цепочечными олигонуклеотидами [104]. Замены Туг425, Туг430, Тгр433, Тгр434 приводят к ослаблению способности а -субъединицы к «плавлению» ДНК.
Дополнительные элементы структуры CRP и его гомологов, способные влиять на активацию транскрипции
В структуре CRP содержится третий активирующий домен (AR3, 52-58 а.к [177]. AR3 был обнаружен при замене Lys52 на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту. Замена Lys52 повышает активацию транскрипции, частично супрессирует эффект замен в AR1 и AR2 в промоторах класса П и не влияет на промоторы класса I [18]. Исследования показали, что не менее важным для работы AR3 является аминокислотный остаток Glu58. В комплексе CRP-ДНК дикого типа Lys52 и Glu58 образуют солевой мостик. Возможно, замена Lys52 освобождает отрицательно заряженную боковую группу Glu58 и вызывает дополнительные энергетически выгодные электростатические взаимодействия с RNAP. Эксперименты с учетом ориентации гетеродимера показали, что AR3 может функционировать только во второй субъединице CRP. Некоторые данные показывают, что функционирующий AR3 взаимодействует с доменом 4 о70-субъединицы RNAP (590-600 а.к.) [176, 56, 174]. Этот домен, содержащий а-спираль-поворот-а-спираль мотив (572-592 а.к.), участвует в узнавании -35 области промотора. Замена Lys593, Lys597 и Arg599 в о70 уменьшает или полностью устраняет зависимость активации транскрипции от AR3. Пространственная модель взаимодействия CRP и RNAP показала, что AR3 и 590-600 остатки а70-субъединицы находятся рядом и могу вступать в контакт [36]. Интересно, что гомолог CRP белок FNR обладает функционально активным AR3 доменом. FNR - белок-регулятор фумаратного и нитратного катаболизма. Этот белок является транскрипционным фактором E.coli необходимым для адаптации к росту в условиях отсутствия кислорода. FNR относится к группе CRP-подобных белков (семейство CRP), к которому относятся также ОхгА из Salmonella typhimurium, FixK из Rhizobium meliloti, Bradyrhizobium japonicum, Azorhizobium caulinodans, HlyX из Actinobacillus pleuropneumoniae [75], FnrN из Rhizobium leguminosarum, ANR из Pseudomonas aeruginosa, AadR из Rhodopseudomonas palustris, NtcA и CysR из цианобактерии Synechococcus, CLP из Xanthomonas campestris и FLP из Lactobacillus casei [189]. Все эти белки имеют сходство в первичной и третичной структуре с CRP, но их функции в клетке не совсем ясны.
Сравнительный анализ последовательностей CRP и FNR показал наличие одинаковых остатков в 22% из 207 эквивалентных позиций. Пространственная структура белков также схожа, Р-структура большого домена неизменна в обоих белках, но остатки, отвечающие за связывание с сАМР, не представлены в FNR. В малом домене FNR также присутствует а-спираль-поворот-а-спираль мотив, но остатки в AR1 изменены. Показано, что AR1 расположен на той субъединице белка-димера FNR, которая взаимодействует с сайтом связывания, находящимся ближе к старту транскрипции и вступает в контакт с доменом 4 субъединицы ст70. В то время как дистальная субъединица белка FNR, осуществляет контакт с aCTD [17, 232, 233]. N-концевая структура FNR содержит кластер из четырех цистеиновых остатков, не имеющий аналога в CRP. Вероятно, этот кластер участвует в связывании ионов железа, которые необходимы для FNR-активации в условиях анаэробного роста. Спирали, участвующие во взаимодействии с промоторами, входящие в а-спираль-поворот-а-спираль мотив CRP и FNR, отличаются остатками только в позициях 1, 5 и 9. Эксперимент по замене характерных для FNR остатков Val208, Ser212, Gly216 на соответствующие CRP остатки Argl80, Glyl84 и Lysl88 позволил FNR активировать экспрессию /ас-оперона в анаэробных условиях роста, что явилось первым прямым доказательством того, что FNR является ДНК-связывающим белком активатором транскрипции. FNR-связывающий сайт на ДНК, также как CRP-связывающий сайт, представляет собой инвертированный повтор длиной 22 п.н. Консенсусные последовательности для CRP и FNR отличаются только в двух симметрично расположенных позициях. В промоторах lac, melR и gal в последовательности CRP- связывающего сайта были заменены основания в соответствии с FNR-связывающим сайтом. В результате эти промоторы начали вести себя как FNR-зависимые [189]. Интересно, что в отличие от CRP, способного регулировать промоторы разных типов относительно расположения его сайтов связывания, почти все известные в природе FNR-зависимые промоторы, относятся к одному типу и содержат FNR-узнающие сайты с центром около -40 п.н. Общие черты в организации FNR-зависимых промоторов и CRP-зависимых промоторов класса II предполагают сходный механизм активации транскрипции через прямой контакт активатора с RNAP и связывание с ДНК. Как отмечалось выше, FNR не обладает гомологией с AR1 доменом CRP, но обнаруживает большое сходство между 80-87 остатками и AR3 доменом CRP, содержащим петлю с Lys52. Мутационный анализ показал, что этот район FNR обладает функцией положительного контроля, т.е. при внесении в него изменений активация транскрипции прекращается [231]. Точечные мутации, внесенные в С-конец а-субъединицы RNAP предотвращали активацию FNR-зависимого рерТ промотора из S.typhimurium. Интересно, что эти мутации оказались в области, взаимодействующей с AR1 доменом CRP. Возможно, активирующее воздействие FNR осуществляется структурой, соответствующей петле АРЗ CRP, выходящей на поверхность в области петли AR1 CRP. 2.6. Активация транскрипции в промоторах, содержащих несколько сайтов узнавания комплекса cAMP-CRP Многие cAMP-CRP-зависимые промоторы содержат только один сайт связывания для этого комплекса. Однако существуют бактериальные промоторы, содержащие несколько таких сайтов. Например, deoP2 из Е. coli, ansB из Salmonella enterica [98], hutUp из Klebsiella aerogenes [154], cat, ага, cea, cytR и некоторые другие. Существовало предположение, что в этих промоторах в активации транскрипции участвует только один CRP-узнающий сайт. Ген сеа, кодирующий токсин колицин Е1, положительно регулируется комплексом CRP-cAMP посредством CRP-связывающего сайта в области -63,5 п.н. Ген обладает вторым CRP-сайтом с центром в -107,5 п.н., который не влияет на активацию транскрипции in vivo, но способен повышать её in vitro [183]. Изучение E.coli lac промотора, содержащего помимо своего CRP-сайта с центром в -61,5 п.н. дополнительный CRP-сайт с центром в -93,5 п.н., продемонстрировало усиление активации транскрипции и тем самым подтвердило участие второго CRP-сайта в этом процессе [103]. Дальнейшая работа с рекомбинантными промоторами выявила зависимость уровня активации от расположения второго CRP-связывающего сайта [37].
Максимальный эффект (увеличение в 5 раз от исходного уровня активации промотора с одним CRP-сайтом) был получен при положении центра второго сайта, как в deoP2 и ans промоторах, в области -90,5 - -93,5 п.н. Несколько меньший эффект (увеличение в 2 раза) дало расположение центра второго сайта в области -82,5 - -84,5 п.н., которое найдено в hutUp промоторе. Интересно, что ansB ген E.coli контролируется белком FNR, связывающимся в области -41,5 п.н. и белком CRP, связывающимся в области -91,5 п.н. Показано, что белки взаимодействуют между собой при активации транскрипции [97]. Большое значение имеет уровень сродства связывающего сайта к активирующему комплексу. В некоторых промоторах, как, например, в сеа, более высоким сродством обладает ближний к старту транскрипции сайт. Этот сайт, обычно, является основным в активации транскрипции. Существуют промоторы, в которых дальний сайт обладает большим сродством, чем ближний. Например, в deoP2 промоторе сайт с центром в -93,5 положении от старта транскрипции обладает более высоким сродством к CRP, чем сайт с центром в -40,5 положении. Хотя, последний, в большей степени участвует в активации промотора. В cdd и tsx промоторах наибольшим сродством обладает сайт в -40 области, но второй сайт принимает активное участие в активации транскрипции. Кроме того, существуют промоторы с несколькими CRP-сайтами, функция которых не известна, например mtlAB оперон [111]. Таким образом, можно заключить, что механизм регуляции промоторов с несколькими CRP-связывающими сайтами рассматривается как сочетание механизмов, характерных для CRP-зависимых промоторов I и П классов. Предложены две модели активации. Первая модель соответствует тем случаям, когда один CRP-димер связывается с промотором в положениях -103 п.н., -93 п.н. или -83 п.н., а второй — в положении -62 п.н., то AR1 ближней субъединицы каждого CRP-димера взаимодействует с одной из .aCTD (рис. 4А), то есть осуществляется активация транскрипции по механизму характерному для промоторов класса I.
Взаимодействие CytR и комплекса CRP-cAMP при регуляции транскрипции
CytR/cAMP-CRP регулон состоит из 11 генов, входящих в 7 транскрипционных единиц, кодирующих белки, необходимые для использования нуклеозидов и дезоксинуклеозидов в качестве единственного источника энергии. Транскрипция этих генов контролируется тремя регуляторами, способными влиять на образование нуклеопротеидного комплекса. Многофункциональный комплекс cAMP-CRP активирует транскрипцию со всех промоторов этой группы. Классический бактериальный репрессор DeoR отрицательно регулирует транскрипцию в некоторых из указанных промоторах. Вторым репрессором системы является CytR, способный связываться с cAMP-CRP с высокой кооперативностью. Это приводит к образованию репрессирующего комплекса, в котором ДНК оборачивается вокруг CytR и одной или двух молекул cAMP-CRP. Репрессирующий комплекс образуется в промоторах с различным строением и почти всегда это зависит от расположения cAMP-CRP. В отличие от других членов Lad семейства у белка CytR отсутствует способность узнавать оператор с достаточно высоким для репрессии транскрипции сродством. In vitro CytR способен с очень низким сродством связываться с оператором, но не способен независимо репрессировать его in vivo. В присутствии cAMP-CRP, однако, связывание CytR усиливается более чем в 1000 раз (в разных промоторах от ста до нескольких тысяч раз) [88, 160, 161]. Более того, мутации в CRP-связывающем сайте или изменения фазы спирали ДНК между этими сайтами влияют на CytR репрессию. Репрессия включает образование нуклеопротеидного комплекса. Кооперативное связывание CytR и cAMP-CRP осуществляется посредством белок- белкового взаимодействия. Регион CRP, контактирующий с CytR, состоит из двух щ экспонированных на поверхности петель, близко расположенных и физически выделенных из ДНК-связывающего домена CRP. Замены в этих областях не влияют на взаимодействие с ДНК, но понижают способность CRP быть посредником для CytR. Эксперименты на примере deoP2 промотора показали способность CytR репрессировать транскрипцию при отсутствии оператора. Мутантный белок с делегированным ДНК-связывающим доменом также способен репрессировать транскрипцию. Кроме того, усеченный белок способен взаимодействовать с сАМР- CRP, реагировать на индукцию и олигомеризоваться. Данные показывают, что CytR способен регулировать работу промотора без специфического CytR-ДНК \ взаимодействия, и косвенно свидетельствуют о важности белок-белковых контактов для сайт-специфического воздействия CytR. Одновременно установлено, что большой домен репрессора наряду с взаимодействием с индуктором и димеризацией, ответственен за контакты с cAMP-CRP [201]. Направленным мутагенезом выявлено, что во взаимодействии cAMP-CRP с ДНК основное место занимают контакты Glul81 с G-C п.н. в +4 положении связывающего сайта. Эти контакты высоко специфичны и замена G-C пары на А-Т снижает эффективность связывания в 10 раз [200]. Последующие исследования уточнили, что во взаимодействии с CytR участвуют две а-спирали (А и В) CRP, расположенные с противоположной стороны , от ДНК-связывающей поверхности активатора.
С помощью генетических, биохимических методов и анализа гомологичных моделей структуры определили область CytR, ответственную за образование CytR-CRP нуклеопротеидного комплекса. По влиянию на силу репрессии были выделены четыре аминокислотных остатка в положениях 171, 213, 322 и 329. Все остатки находятся с одной стороны субъединиц CytR, но отдалены друг от друга. Кроме того, аминокислоты 213 и 322 находятся на поверхности белка, а аминокислоты 171 и 329 несколько углублены в предполагаемую структуру CytR. Замена на Ala трех аминокислот: Leu 169, Тгр173 и Arg212 привела к значительному ослаблению белок-белковых контактов с CRP. В структуре активатора две гидрофобные аминокислоты Vail 08 и Pro ПО, возможно, ответственны за взаимодействие с Leu 169 и Тгр173 репрессора [198, 106]. Предполагается, что гидрофобные контакты вообще играют главную роль в белок-белковом взаимодействии. Позднее в составе белка CRP была выявлена группа аминокислотных остатков (12, 13, 17, 105, 108 и ПО а.о.), осуществляющих контакт с CytR, которая получила название «репрессионной области» (RR). В белковой глобуле RR оказалась сближенной с AR2 областью белка CRP. Соответствующие аминокислотные остатки, комплементарные области RR, обнаружены внутри С-концевого домена белка CytR [137]. Взаимодействия CytR-ДНК происходят за счет связывающего ДНК мотива а-спираль-поворот-сс-спираль внутри N-концевого домена белка CytR [215]. Было показано, что взаимодействие CytR-ДНК зависит от определенных физиологических условий. В интересной работе Meibom К. и др. [128] было установлено, что в образовании репрессирующего комплекса CytR(CRP)2 участвует только по одной (ближайшей к репрессору) субъединице CRP-димера. Причем вне зависимости от класса и типа промотора белок CytR всегда взаимодействует с той из субъединиц CRP, у которой функционально активна AR1 область. Обычно в процессе регуляции CytR находится между двумя комплексами cAMP-CRP с ДНК. По предлагаемой модели взаимодействия с ДНК большой домен CytR расположен перпендикулярно положению PurR в подобном комплексе с ДНК. Кроме того, в отличие от PurR белок CytR не вызывает изгиба или расплетания ДНК при связывании [106]. Установлено, что комплекс cAMP-CRP способен индуцировать конформационные изменения в структуре CytR репрессора. В отсутствии активатора CytR способен связывать операторную пару октамеров (несовершенный повтор 5 GCAA-3 ), расположенных в прямой и обратной ориентации, разделённых 2 п.н. В присутствии активирующего комплекса CytR может узнавать оператор с октамерами в обратной ориентации, разделёнными 10-13 п.н., или октамерами в прямой ориентации, разделёнными 1 п.н., при этом эффективность связывания увеличивается в 30 раз. В работе Perini L.T. и др. [163] был предложен модифицированный консенсусный мотив для связывания белка CytR. Мотив представляет собой палиндромную структуру, состоящую из двух гексамеров, разделенных 2-5 пн (5 TGCAA-N2-5TGCAA-3 ). При использовании в качестве консенсуса этого модифицированного CytR-мотива в регуляторной области генов cddP, deoP2, udpP, tsxP, nupG-P, deoPl и cytR были выявлены дополнительные сайты связывания белка CytR, отличающиеся от консенсуса не более чем 5 п.н. Сродство CytR к оптимальному для него оператору всё же много меньше, чем у большинства прокариотических репрессоров к их естественным операторам.
Возможно, низкое сродство CytR к своему оператору обеспечивает высокую структурную подвижность, т.е. способность взаимодействовать с операторами различной конфигурации [162]. 3.5. CytR регулон В состав CytR-регулона входят 9 генов катаболизма нуклеозидов. Активация транскрипции на этих генах происходит с помощью комплекса cAMP-CRP, вызывающего изгиб ДНК, а репрессия посредством кооперативного связывания белка CytR с активирующим комплексом [166, 161, 88]. Все промоторы CytR регулона обладают CRP-связывающими сайтами, расположенными вокруг -40 п.н. Большинство промоторов содержат второй CRP-связывающий сайт, ограничивающий место узнавания CytR. Кроме того, для промоторов генов nupG, cdd и промотора tsxP2 показано наличие третьего альтернативного сайта связывания CRP, не участвующего в активации промотора [88, 159]. В deoP2 промоторе расстояния между двумя CRP-сайтами составляет 53 п.н., что соответствует 5 виткам В-спирали ДНК. В cdd промоторе это расстояние составляет 51 п.н. В tsxP2 промоторе два CRP-сайта разделены всего 33 п.н. Промотор cytR вообще содержит только один CRP-связывающий сайт. Промотор deo оперона на протяжении многих лет являлся основной моделью по изучению CytR/cAMP-CRP регуляции. Транскрипция с промотора активируется cAMP-CRP комплексом в 30 раз и репрессируется CytR белком в 10 раз. Первые исследования показали необходимость для активации транскрипции только одного сайта - CRP1. Видимо, активация идет по модели промоторов класса П. Точечные мутации в CRP2-canTe приводят к ослаблению отрицательной регуляции. Делеция CRP2-canTa полностью устраняет CytR-регуляцию. Однако повышение внутриклеточной концентрации CytR способно восстановить отрицательную регуляцию транскрипции. Также восстановление регуляции происходило при вставке синтетического CRP-сайта на расстоянии пяти витков спирали ДНК. Кроме того, установлено, что мутации в CRP2-caftTe понижают уровень связывания с CRP1-сайтом.
Получение мутаций в регуляторной области гена udp E.coli и их первичная характеристика
В результате проведения сайт-направленного мутагенеза были получены промоторные мутанты по структурным элементам, ответственным за связывание с RNAP: udpPlSO, udpP170, udpP310, udpP312, udpP4U, udpP360, udpP430, udpP450, udpP480, udpP250) и белком CRP: udpP113, udpP360, udpP450 (сайт связывания CRP1) и udpP240, udpP250 (сайт CRP2). Нуклеотидные замены, внесенные в регуляторную область представлены на схеме (рис. 6). На основе полученных вариантов была сконструирована серия мутантов с делетированной дистальной областью промотора, включающей сайт CRP2 (udpP , udpP310A, udpP480A. udpP430, udpP450A udpP360A). Ряд полученных нами конструкций содержит одновременно мутации по нескольким элементам промотора, которые условно можно разделить на три группы: 1) мутации, затрагивающие -10 область промотора: udpP310, udpP312, udpP411, udpP470, udpPlSO, udpP170, udpP430, udpP450, udpP310A udp430A udp450a; 2) мутации в —35 области промотора: udpP480, udpP360, udp430, udp450, udpP480A, udpP360A. udp430A, udp450A, 3) мутации, расположенные в сайтах связывания белка CRP: udpP113, udpP360, иіїрРЗбОд, udpP450, udpP450A (в сайте CRP1); udpP240, udpP250 (в сайте CRP2), udpP+A, udpP310A udpP480A, udpP430A, udpP450A, udpP360A (делеция сайта CRP2). Для изучения характера экспрессии мутантных промоторов и уровня их регуляции соответствующие последовательности были клонированы в составе экспрессионного вектора pJEL250. Полученными рекомбинантными плазмидами трансформировали изогенные штаммы (АМ2009, АМ2010, АМ2014 — таб. 1), отличающиеся аллельным состоянием генов cytR и сгр. У отобранных трансформантов определяли активность Р-галактозидазы (таб. 3). В качестве контроля использовали плазмиду pJEL250 udpP+, содержащую соответствующий фрагмент регуляторной области гена udp дикого типа. Производные штаммов АМ2009 (cytR+crp+) и АМ2010 (cytR crp ), содержащие рекомбинантные плазмиды, выращивали на среде с глицерином, т.е. в условиях максимальной активации промотора комплексом cAMP-CRP. Способность белка-репрессора CytR связываться с операторным сайтом полученных мутантов определяли путем измерения активности CDD-азы (продукта гена cdd). Поскольку ген cdd как и udp, принадлежит к CytR-регулону, при амплификации промотор-операторной области гена udp в составе многокопийной плазмиды происходит оттитровка репрессора и повышается уровень экспрессии гена cdd в составе хромосомы (таб. 4). Увеличения количества рекомбинантных плазмид в клетке достигали повышением температуры до 37С, используя способность вектора pJEL250 изменять свою копийность в зависимости от температуры.
В качестве контроля использовали производные штамма АМ2009 (cytR crp+), содержащие вектор pJEL250 или плазмиду udpP+, в составе которой был клонирован промотор гена udp дикого типа. Способность полученных нами мутантных промоторов к транскрипции в присутствии регуляторных белков CytR и CRP изучали методом транскрипции in vitro (см. "Материалы и методы"). 5.2. Изучение влияния структуры - 10 области на эффективность экспрессии промотора гена udp Е. coli Согласно полученным ранее данным по S1 -картированию старта транскрипции гена udp [28], последовательность TAAAGT, расположенная на расстоянии 6 по отношению к +1 (рис. 6), выполняет функцию Прибнов-блока. Она отличается от канонической последовательности ТАТААТ двумя нуклеотидными заменами (подчеркнуты). Представляло интерес выяснить, как скажется на CytR/CRP-зависимой регуляции промотора udpP замена природного Прибнов-блока на канонический. С этой целью с помощью праймера D методом Кункеля на основе промотора udpP+ был получен мутант udpP310, содержащий две замены: -10А — Т и -8G- А. Как следует из данных таблицы 3, у штамма АМ2009, содержащего на плазмиде мутантный промотор udpP310, активность Р-галактозидазы возрастает в 5,5 раз по сравнению с тем же штаммом, несущим плазмиду с промотором дикого типа, причем уровень репрессии промотора снижается в 4 раза. С этим согласуются результаты опытов по титрованию CytR репрессора (таб. 4), которые в случае плазмиды udpP310 показывают, что эффективность титрования репрессора этим промотором составляет только 80% от уровня промотора дикого типа (плазмида udpP+). Следовательно, репрессирующий комплекс на мутантном промоторе udpP310 образуется менее эффективно. Наряду с этим, в штамме AM2014(cytR crp ) активность р-галактозидазы по сравнению с диким типом увеличивается в 6 раз, что указывает на частичный выход промотора udpP310 из-под контроля активирующего транскрипцию комплекса цАМФ-CRP. Следовательно, RNAP взаимодействует с последовательностью -10 именно в ожидаемой нами области ДНК и эффективность этого контакта влияет на CytR/CRP-зависимую регуляцию промотора udpP+. Представляется вероятным, что более эффективное связывание RNAP с консенсусным Прибнов-блоком либо осложняет образование репрессирующего комплекса, либо способствует высвобождению из него репрессора CytR. Ранее нами [239] были сконструированы два мутантных промотора с «ухудшенным» консенсусом для -10 области: udpP312 (замена -7Т-»С) и udpP411 (замена -11A-»G). Измерение активности р-галактозидазы у мутанта udpP312 показало ее снижение в 2 раза в штамме АМ2009 (cytR+crp+) и в 11,5 раз в штамме АМ2010 (cytR crp ) с неактивным репрессором CytR (таб. 3). В то же время, эффективность титрования репрессора на плазмиде, несущей промотор udpP312, увеличилась в 2,7 раза по сравнению с контрольным промотором udpP+ (таб. 4). Таким образом, слабое взаимодействие RNAP с областью -10, а именно, замедленный переход закрытого транскрипционного комплекса в открытый, приводило к более эффективному образованию репрессирующего комплекса в штамме АМ2009 (cytR+crp+), что объясняет незначительное, по сравнению с промотором udpP+, увеличение экспрессии в штамме cytR crp+ (АМ2010) относительно штамма АМ2009. Также было показано, что замена -11A-»G (мутант udpP411) является еще более значительной для взаимодействия RNAP с промоторной ДНК, и снижает уровень экспрессии промотора до уровня его экспрессии в отсутствие активатора (штамм АМ2010). Этот мутант примерно также эффективно как и udpP312 титрует репрессор CytR in vivo (таб. 4), однако в отсутствие репрессора CytR в клетке уровень активности р-галактозид азы возрастает всего в 2 раза, что в 23 раза ниже уровня экспрессии промотора дикого типа.
В данном случае активность промотора, видимо, подавлялась полной неспособностью полимеразы формировать открытый транскрипционный комплекс, как в присутствии, так и в отсутствии репрессора CytR. Отмечалось, что наиболее эффективно белок CytR связывается с операторной областью мутанта udpP470, у которого делегирована -10 область. Исследование эффективности образования CytR-ДНК комплекса методом торможения в геле показало, что мутантные промоторы с «ухудшенной» структурой -10 области не обладают более высоким сродством к репрессору [239]. Возможно, наблюдаемое в системе in vivo увеличение эффективности титрования репрессора связанно с учащенным образованием репрессирующего комплекса, чему, в случае промотора дикого типа и, в особенности, мутанта udpP310 препятствует активное формирование открытого транскрипционного комплекса. Таким образом, полученные ранее данные подтверждают вывод, сделанный на основе промотора udpP310 о наличии обратной зависимости эффективности образования репрессирующего комплекса от степени сродства RNAP к -10 области промотора. Наиболее вероятное объяснение этой зависимости — прямая конкуренция белков CytR и RNAP в промоторной области гена udp за связывание с белком-активатором CRP. 5.3. Изучение влияния мутаций в области блока Прибнова на экспрессию промотора udpP На основании анализа свойств мутантных промоторов, содержащих замены в структуре Прибнов-блока, нами была выявлена прямая корреляция между активностью промотора и эффективностью связывания RNAP [239]. При этом выяснилось, что мутант udpP310, содержащий консенсусную -10 область (рис. 6), характеризуется частичным выходом из-под контроля активирующего транскрипцию комплекса cAMP-CRP и осуществляет транскрипцию в 5,5 раз эффективнее, чем промотор дикого типа udpP+ (таб. 3). Кроме того, было показано, что мутации, затрагивающие —10 область промотора udpP+ (нуклеотидные замены —7Т— С и -ПА—»G), приводили к инактивации промотора и повышению его способности к титрованию репрессора CytR соответствующим операторным участком, расположенным в районе -60 нуклеотида [239]. Эти данные свидетельствуют о том, что изменение структуры канонической области промотора гена udp существенным образом сказывается на характере его регуляции под действием регуляторных белков CytR и CRP.
Похожие диссертации на Функциональный анализ структурных элементов промотора гена udp Escherichia coli
