Введение к работе
Актуальность темы. Никование двуспиралыюй ДНК, т.е. внесение разрыва (ника - nick) только в одну цепь ДНК, вовлечено во многие биологические процессы, такие как инициация репликации ДНК, ДНК-рекомбинация, репарация, конъюгативная мобилизация некоторых плазмид. Никующие эндонуклеазы, участвующие в биологических процессах, действуют либо в комплексе с другими белками, либо узнают сложные последовательности ДНК и поэтому не могут использоваться для практических целей. Недавно никующие эндонуклеазы (никазы), которые узнают короткую специфическую последовательность, вносят разрыв в ДНК в фиксированном положении относительно этой последовательности и действуют в виде мономеров, были выделены из бактерий. Эти никазы быстро нашли практическое применение. На их основе уже создан ряд новых биотехнологических методов, таких как изотермическая реакция для амплификации олигонуклеотидов, амплификация геномной ДНК, построение простейшего линейного мотора. Новый метод детектирования ДНК-мишеней на основе никазы предложен в настоящей работе. Предполагается, что никующие эндонуклеазы могут заменить эндонуклеазы рестрикции в клонировании ДНК и что некоторые проблемы нанотехнологий на основе ДНК могут быть решены с применением этих ферментов. Таким образом, никующие эндонуклеазы становятся ещё одним инструментом молекулярной биологии. Ограниченное количество природных никующих сайт-специфических эндонуклеаз стимулировало интенсивное конструирование на основе эндонуклеаз рестрикции искусственных никаз с новыми специфичностями. Информация о пространственной структуре никующих эндонуклеаз необходима как для выяснения механизма внесения разрыва в одну цепь ДНК, так и Для рационального конструирования никующих эндонуклеаз с новыми специфичностями.
Цели и задачи работы. Целью настоящей работы было определение пространственной структуры никующей эндонуклеазы N.BspD6I и разработка на основе никазы нового метода детектирования ДНК-мишеней. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
сконструировать штамм-суперподуцент никазы;
отработать технику выделения никазы с чистотой не менее 95%;
найти условия концентрирования (не менее 20 мг/мл) и кристаллизации никазы;
получить набор дифракционных данных, достаточный для определения пространственной структуры;
разработать метод гибридизационного анализа ДНК с использованием никазы.
Научная новизна. Определена пространственная структура никазы N.BspD6I — первой структуры этого класса ферментов. Координаты атомов N.BspD6I занесены в Банк Белковых Структур (PDB) под кодом 2EWF.
Разработан принципиально новый метод детектирования ДНК-мишеней с использованием никазы и молекулярных биконов.
Практическая значимость. Информация о структуре важна при конструировании никаз с новыми специфичностями. Использование никазы в сочетании с молекулярными биконами позволит повысить чувствительность существующих методов детектирования ДНК на два порядка.
Апробация работы и публикации. Результаты докладывались на IV Всероссийской Научно-Практической Конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002 г.), на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века». (Пущино, 2003 г.), на конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике «50 лет двойной спирали» (Киев, 2003 г.), на II Московском международном конгрессе «Биотехнология: Состояние и перспективы развития» (Москва, 2003 г.), на Международной конференции «Наука и Бизнес: Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда и биомедицина» (Пущино, 2004 г.) и на конференции Deutsche Gesellschaft fur Kristallographie (Freiburg, Germany 2006 г.).
По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 'f'S Р страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, описания использованных материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Материал иллюстрирован % S рисунками и 3 таблицами. Библиография включает 7юссылок.
