Введение к работе
Актуальность проблемы. Иммуноферментный анализ (ИФА) в настоящее время является одним из самых распространенных аналитических методов, используемых для определения разнообразных аналитов. На практике в современных условиях наиболее интенсивно применяется твердофазный вариант ИФА (тИФА). Известно несколько форматов тИФА, при этом во всех форматах последним этапом является определение каталитической активности фермента-метки. Для этого в тИФА используют различные методы детекции, но наиболее чувствительным является хемилюминесцентный метод.
Традиционно в тИФА в качестве метки используется катионный изофермент с пероксидазы хрена (ПХ). И в этом случае субстратом для хемилюминесцентной регистрации активности ПХ является люминол. Так как каталитическая активность ПХ в отношении люминола крайне низка, требуется введение в реакционную среду дополнительных соединений, которые называются усилителями. Наиболее известным усилителем для ПХ является 4-йодофенол. Предел обнаружения ПХ в этом случае составляет 1.0 пМ. Изучение кинетики данной ферментативной реакции показало, что ПХ продуцирует аналитический сигнал, сильно изменяющийся во времени. Таким образом, для развития новых высокочувствительных тИФА методов требуется решить проблему нестабильности хемилюминесцентного сигнала (ХЛС), а также понизить предел обнаружения пероксидазы.
В последние годы был выделен ряд новых ферментов, относящихся к группе анионных изопероксидаз. В отличие от ПХ эти пероксидазы продуцируют практически неизменный во времени аналитический сигнал. Этот факт позволил продемонстрировать преимущества использования анионной пероксидазы сои (ПС) по сравнению с ПХ в тИФА с хемилюминесцентной детекцией (ХЛ-тИФА). К сожалению, данная группа пероксидаз также имеет недостаток, заключающийся в том, что ХЛС, продуцируемый ими, значительно ниже, чем с применением ПХ. Введение в реакционную среду усилителей ПХ не дает значительного усиления хеми люминесценции. Данный факт ограничивает чувствительность разрабатываемых иммуноферментных тест-систем. Все вышеперечисленное однозначно указывает на актуальность поиска эффективных усилителей для анионных пероксидаз, приводящих к высокому по величине и стабильному во времени аналитическому сигналу, что, в конечном счете, позволит качественно улучшить аналитические параметры иммуноферментных тест-систем.
Цели и задачи исследования. Обнаружить эффективные усилители ХЛС, продуцируемого анионными пероксидазами, и продемонстрировать
преимущества их применения при разработке высокочувствительных имму но ферментных тест-систем с хемилюминесцентной детекцией.
В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:
Оценить способность 3-(10'-фенотиазинил)-пропан-1-сульфоната натрия
(ФТПС) в качестве усилителя ХЛС, продуцируемого анионными пероксидазами сои и батата;
Сравнить ФТПС с другими производными фенотиазина как
потенциальными усилителями ХЛС, продуцируемого ПС;
Изучить влияние некоторых производных пиридина на усиливающую
способность ФТПС;
Оценить возможности детектирующей системы на основе ПС и ФТПС с 4-
морфолинопиридином (МП) в сэндвич и конкурентном форматах ХЛ-тИФА.
Научная новизна работы. Открыто, что ФТПС является эффективным усилителем хемилюминесценции, продуцируемой анионными пероксидазами в процессе окисления люминола пероксидом водорода. Впервые для анионных пероксидаз был продемонстрирован эффект вторичного усиления ХЛС под воздействием ряда производных пиридина. Добавление пары усилителей ФТПС/МП в реакционную смесь при наиболее благоприятных условиях окисления люминола пероксидом водорода приводило к понижению предела обнаружения пероксидазы сои до 0.03 пМ. Кроме того, показано, что образующийся ХЛС практически неизменен в течение длительного времени. Продемонстрированы преимущества использования разработанной системы усиления на основе анионной ПС и усилителей ФТПС/МП в сравнении с традиционно используемой в ХЛ-тИФА катионной ПХ и усилителя 4-йодофенола на примере сэндвич формата тест-системы для определения тиреоглобулина человека. Более того, возможности разработанной детектирующей системы были продемонстрированы в конкурентном формате тИФА для определения охратоксина А и 2,4- дихлорфеноксиуксусной кислоты.
Практическая значимость работы. Продемонстрировано, что использование разработанной детектирующей системы на основе коммерчески доступной анионной пероксидазы сои вместо пероксидазы хрена в составе имму но ферментных наборов с хемилюминесцентной детекцией позволяет существенно улучшить их качество за счет понижения предела обнаружения, расширения линейного диапазона определяемых концентраций и большей стабильности хемилюминесцентного сигнала во времени. Разработанный метод анализа был успешно применен для определения тиреоглобулина в сыворотке
человека, охратоксина А в образцах соевых бобов и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в образцах апельсинов.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге, 2009» (Санкт-Петербург, 2009), «Биокатализ-2009» (Архангельск, 2009), «Перспективы развития инноваций в биологии, 2009» (Москва, 2009) и «Ломоносов-2009» (Москва, 2009) и международных симпозиумах «The 13th Annual Meeting of the Israel Analytical Chemistry Society, 2010» (Тель-Авив, Израиль, 2010), «Bioluminescence and Chemiluminescence, 2010» (Лион, Франция, 2010) и «Luminescence Spectrometry, 2010» (Прага, Чехия, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы: 4 статьи в журналах, входящих в перечень периодических изданий, публикация в которых рекомендуется ВАК, и 8 тезисов докладов на международных конференциях и симпозиумах.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (5 глав), выводов и списка цитируемой литературы (149 ссылок). Работа изложена на 147 страницах и включает 60 рисунков и 15 таблиц.
