Введение к работе
Актуальность проблемы;
Экспресс-оценка степени загрязнения объектов окружающей среды органическими соединениями является необходимым компонентом экологического контроля. Учитывая постоянно растущий перечень веществ, поступающих как загрязнители в окружающую среду, эффективным инструментом анализа оказываются методы, основанные на интегральной оценке органических компонентов, а не только на определении содержания индивидуальных веществ. В этой связи значительное внимание уделяется разработке биосенсорных экспресс-методов контроля, значительно повышающих оперативность анализа, снижающих его стоимость и позволяющих выполнить как интегральную оценку загрязненности, так и проводить селективный анализ.
Важной характеристикой степени загрязненности воды легкоокисляемыми органическими веществами является индекс биохимического потребления кислорода (БПК). Традиционная методика определения БПК требует инкубирования насыщенной кислородом пробы в течение 5, 10 или 20 суток (БПК5, БПКю или БПК2о, соответственно). Отсутствие оперативности существенно снижает ценность традиционной методики. Для оперативного анализа разрабатываются методы оценки БПК, основанные на использовании биосенсорных анализаторов. Биосенсорные анализаторы БПК представляют собой надежные, простые и дешевые аналитические инструменты и с успехом используются для контроля водных экосистем (наряду с традиционными методами определения БПК) за рубежом. В России аналогичные анализаторы в настоящее время промышленно не выпускаются. В мире при создании БПК-сенсоров наиболее часто используют биосенсоры на основе кислородного электрода Кларка и целых клеток микроорганизмов.
Одной из важных проблем в экологии является очистка сточных вод биотехнологических производств, в том числе спиртовых производств. Сточные воды спиртовых заводов характеризуются высоким содержанием органических загрязнений, что приводит к гибели естественных экосистем вокруг них. Для таких предприятий не только практически сложно, но и нерационально стремиться к созданию универсального БПК-сенсора. Напротив, целесообразно производить разработку биосенсоров и выбор соответствующих микроорганизмов, которые обеспечивали бы наиболее эффективную детекцию БПК в соответствии с конкретным типом сточных вод, т.е. разрабатывать специализированные БПК-биосенсоры.
К преимуществам биосенсоров можно отнести: короткое время ответа, портативность, удобство в работе, а также отсутствие специальных требований к приготовлению исследуемого образца. Микроорганизмы - доступный биологический материал. Клетки микроорганизмов легко воспроизводятся, культивируются и поддерживаются в чистой культуре. В некоторых случаях они обеспечивают жизнеспособность и активность ферментных систем в течение нескольких лет. Вместе с тем, для микробных сенсоров характерна низкая субстратная специфичность - чувствительность к большому количеству веществ, что является преимуществом для интегральной оценки степени загрязнения, но недостатком для селективного анализа.
Наряду с определением интегральных показателей качества воды важным является одновременное определение содержания отдельных компонентов в водных
средах. Существует несколько подходов повышения селективности биосенсоров. Один из способов селективной детекции компонентов может заключаться в получении интегральных характеристик смеси с помощью низкоселективных анализаторов и использовании математических методов обработки данных с целью определения вклада, вносимого отдельными компонентами. Различные хемометрические методы, включая применение искусственных нейронных сетей (ИНС), успешно используются в аналитической химии для обработки сигналов химических сенсоров. Однако для применения в области биосенсорики данные методы не развиты. Следует отметить, что биосенсоры, предназначенные для экологического контроля стоков биотехнологических производств, можно использовать и для мониторинга ферментационных процессов на этих производствах. Это позволит сократить затраты на оборудование и увеличить экономическую отдачу предприятия. Так, дифференциальная оценка содержания нескольких компонентов на различных стадиях позволяет оптимизировать технологический процесс брожения и снижать материальные затраты, приводя в соответствие качество исходного сырья с качеством применяемых ферментов и дрожжевой биомассы. Одновременно снизится экологическая нагрузка на окружающую среду. Следует отметить, что существующие методы определения содержания спиртов и углеводов эффективно применяются для контроля качества готовой продукции, но не могут быть использованы для экспресс-оценки содержания указанных компонентов в ферментационных средах. Одной из важнейших особенностей биосенсоров, обеспечивающейся сменой рецепторных элементов, является возможность применения одного анализатора для различных аналитических целей. Таким образом, создание универсального биосенсорного анализатора со сменными биорецепторными элементами для определения БПК и анализа многокомпонентных смесей в современных условиях является важной задачей для биотехнологических производств.
Работа выполнялась при частичной поддержке гранта Федерального агентства по образованию РНП 2.1.1.7789. и ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 гг.», госконтракт № 02.512.11.2010. Автор работы является победителем конкурса программы « Участник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в 2008 г. (г. Пущино). Цель работы;
Разработка химико-биологических основ применения низкоселективных микробных биосенсоров для экспресс-оценки БПК и мониторинга биотехнологических процессов и создание на этой базе макета универсального биосенсорного анализатора.
Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи: Разработать стабильные и воспроизводимые биорецепторные элементы
биосенсоров на основе различных способов иммобилизации клеток
микроорганизмов. Охарактеризовать биокатализаторы на основе целых клеток микроорганизмов
по их субстратной специфичности для использования в качестве основы
рецепторного элемента биосенсора.
Разработать модификацию макета биосенсора проточно-инжекпионного типа для экспресс-анализа БПК. Определить его аналитические и метрологические характеристики. Оптимизировать конфигурации искусственных нейронных сетей для снижения ошибки определения компонентов при анализе двух-, трех- и четырехкомпонентных смесей. Разработать модификацию макета многоканального биосенсора проточно-инжекционного типа на основе неселективных клеток микроорганизмов для селективного анализа многокомпонентных смесей.
Научная новизна
Впервые показан эффект изменения субстратной специфичности уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans при иммобилизации в различные носители, что имеет существенное значение при создании биосенсорных систем для анализа многокомпонентных смесей.
Показано, что применение уксуснокислых бактерий G. oxydans и метилотрофных дрожжей P. angusta как основы рецепторного элемента биосенсора для определения БПК стоков пищевых и ликероводочных производств позволяет получать данные с высокой корреляцией к стандартному методу.
Расширена возможность применения технологии искусственных нейронных сетей для обработки сигналов биологических сенсоров. Разработана методика применения ИНС в решении задачи селективной детекции модельных двух-, трех- и четырехкомпонентных систем, содержащих метанол, этанол, фруктозу и глюкозу, выполняемой низкоселективными микробными сенсорами.
Впервые показана возможность применения дрожжевого штамма Saccharomyces bayanus ВКМ Y-349, характеризующегося активным транспортом фруктозы, как основы одного из рецепторных элементов многоканального биосенсора для селективного определения данного вещества в водных средах.
Практическая значимость
Разработан и апробирован макет многоканального биосенсора проточно-инжекпионного типа для определения содержания глюкозы, фруктозы, метанола, этанола и индекса БПК в водных средах. Метод анализа с использованием разработанного макета биосенсора характеризуется высокой экспрессностью и высокой чувствительностью. Макет многоканального биосенсора может быть использован в научных исследованиях, в учебном процессе и как прототип опытного образца прибора для серийного выпуска.
Работа вносит практический вклад в разработку высокоэффективных аналитических систем на основе биосенсоров. Предложенные методы анализа сигналов биосенсоров значительно повышают селективность анализа при использовании биосенсоров на основе целых клеток микроорганизмов и позволяют в перспективе разрабатывать недорогие и эффективные анализаторы.
Апробация работы и публикации
Результаты работы докладывались на Тульском молодежном инновационном конвенте (г. Тула), 2009 г. (диплом победителя); Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (г. Москва, г. Пушино), 2008 г (диплом победителя); 2-ой Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех - 2008» (г. Москва), 2008 г. (медаль выставки); XII Международной
научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии», 2008 г. (диплом за 3 место); Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2007 г. (медаль конкурса); XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (г. Москва), 2007 г.; IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (г. Томск) в 2006 г.; Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология - современные биоаналитические системы, методы и технологии» (г. Пушино), 2006 г. (диплом лауреата конкурса); Международной молодёжной научной конференции «XIV Туполевские чтения» (г. Казань), 2006 г. (диплом за 3 место).
По теме диссертации опубликовано 8 статей, 7 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.
Структура и объем работы
