Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние десятилетия иерсиниоэы и листериоз заняли значимое место в инфекционной патологии человека. Основные эпидемиологические закономерности этих инфекций, относящихся к классу сапронозов, обусловлены тем, что возбудители способны, обитать не только в организме хозяина, но и в объектах окружающей среды.
Экологию иерсиний и листерий активно изучали п плане влияния абиотических факторов на динамику бактериальных популяций, а также закономерностей распространения в окружающей среде (Сомов, 1974-1993; Гершун, 1971-1988; Ющенко, 1985; Максименкова, 1987; Беленева, 1996 и др.). В последние годы выявлены закономерности и механизмы существования иерсиний, листерий и других патогенных бактерий в сообществах почв и водоемов. Показана важная роль биотических факиров в существовании бактериальных популяций во внешней среде (Литвин, 1988, 1991; Пушкарева, 1989-1997).
Объектом этих бактериологических исследований, естественно, были "культивируемые" формы бактерий - способные к росту на обычных питательных средах. Из литературы известно, что это - не единственная форма сущестчования микроорганизмов: у ряда неспорообразующих бактерий - Е. coli, Salmonella sp., Shigella sp., V. cholerae, Legionella pneumophila и др. - при обитании в окружающей среде описаны так называемые "некультивируемые" - по сути, покоящиеся формы (Cclwell, 1985; Roszak, 1987 и др.), не учитываемые бактериологическим методом. Такие покоящиеся бактериальные клетки не делятся, однако вполне жизнеспособны, доказательством чего служат биосинтез белка и нуклеиновых кислот, функционирование дыхательной и электронно-транспортной цепей (МасКау, 1992; Zimmerman,' 1978); способность к реверсии в вегетативную форму (Пушкарева с соаві., 1997; Романова, 1997; Colwell, 1984; Jones, 1992 и др.). В функциональном отношеїшн они аналогичны спорам бацилл (Романова, Гинцбург, 1993)
Нжультивируемые формы иерсиний и листерии не были известны. Вопросы популяционной экологии Y. psuedotuberculosis и L. monocytogenes, связанные с переходом бактерий в некулгтивируемое состояние, не изучались. Могут ли иерсииии и листерии существовать в і почвах в некультивируемой форме? Каковы условия образования , покоящихся форм и их реверсии в вегетативные (культивируемые) формы? Какова доля и динамика некультивируемой (покоящейся) части бактериальной популяции? Существуют ли покоящиеся формы в естественных условиях - почвах природного очага? Ответы на эти и другие вопросы имекг- немаловажное значение, имея в виду механизмы сохранения возбудителей в межэпидемические (межэпизоотические) периоды, а также "запуска" эпизоотического и эпидемического процессов при сапронозах. Значительный интерес для проблемы природной очаговости инфекций и эпидемиологии представляет также изучение естественных связей патогенных иерсиний и листерии с растениями и путей их инфицирования.
Цель работы - изучить возможность обратимого перехода в некультивируемое (покоящееся) состояние патогенных иерсиний и листерии при обитании в почве и взаимодействии с растениями.
Основные задачи:
-
Разработать тест-систему на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления иерсиний и листерии в естественных почвах. .
-
Проверить возможность перехода Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes в некультивируемое состояние, оценить динамику численности вегетативных и покоящихся (некультивируемых) форм иерсиний и листерии в почве при паралелльном использовании бактериологического метода И ПЦР в эксперименте.
3. Выявить условия реверсии некультивируемых форм в
вегетативные при обитании и почве.
-
Исследовать почвы природного очага псевдотуберкулеза на наличие некультивируемых форм возбудителя.
-
Установить характер взаимодействий иерсшшй и листерий с водорослями и их экзометаболитами.
-
Изучить возможность проникновения иерсшшй и листерий из почвы в вегетативные органы высших растешш и длительность существования в них.
Научная новизна:
впервые в образцах почв из природного очага псевдотуберкулеза обнаружены ,рекультивируемые формы патогенных иерсиний, выявленные с помощью ПЦР при отрицательных результатах бактериологических исследований;
впервые экспериментально доказан переход Y. pseudotuberculosis И L. monocytogenes в некультивируемое состояние при инкубировании в почве, оценены динамика формирования и коїщеитрация таких покоящихся форм, длительно сохраняющихся в почве;
впервые установлено, что зеленые водоросли Scenedesmus quadricauda активно индуцируют переход иерсиний и листерий в покоящееся состояние при обитании в почве;
впервые выявлена реверсия покоящихся форм иерсиний и листерий в исходные вегетативные формы под воздействием ряда биотических факторов; .4
впервые экспериментально доказана возможность колонизации высших растений патогенными иерсшшямн и листериями из субстрата через корневую систему.
Практическая значимость работы
Разработан экспресс-метод индикации патогенных иерсиний и листерий в субстратах внешней среды на основе ПЦР; в сочетании с бактериологическим методом он позволяет дифференцировать некультивируемые формы возбудителей и ориентировочно оценивать их концентрацию в почвах и водоемах.
Подготовлены методические рекомендации "Выявление некультивируемых форм Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes в объектах окружающей среды с применением полимеразной цепной реакции".
Материалы диссертации используются в курсе лекций для студентов кафедры альгологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Апробация работы. Результаты исследований отмечены на конкурсе молодых ученых НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, доложены на Всесоюзной конференции по актуальным проблемам инфекционной патологии (г. Санкт-Петербург, 1993 г.), VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, мнкообиологов и паразитологов (г. Москва, 1997 г.).
Диссертация апробирована на совместной конференции отдела природноочаговых инфекций, отдела генетики и молекулярной биологии бактерий, отдела эпидемиологии НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН 22 апреля 1997г. (протокол N 2).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, выводов и списка литературы. Работа
*.» изложена на 123 страницах, иллюстрирована 12 рисунками и 10
таблицами. Список источников литературы включает 182 работы, в том
числе 60 зарубежных.
