Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
1.1. Влияние нефти и нефтепродуктов на жизнеспособность организмов 9
1.1.1. Микроорганизмы 9
1.1.2. Микроводоросли 13
1.1.3. Макроводоросли и водная растительность 19
1.1.4. Высшие растения 22
1.2. Механизмы действия углеводородов нефти на клетки фотоавтотрофов 26
1.3. Методы определения состояния фотоавтотрофных организмов .в водных экосистемах 30
1.4. Использование биологических индикаторов в качестве мониторинга загрязнения природной среды 34
1.5. Роль липидов в устойчивости и адаптации фото автотрофных организмов к факторам внешней среды 39
1.5.1. Роль липидов в функционировании мембран и реакциях фотосинтеза 39
1.5.2. Изменение липидного состава биомембран при адаптации растительных клеток к температурным условиям 42
1.5.3. Изменение состава мембранных липидов при патологии растительных организмов 44
ГЛАВА II. Объекты и методы исследования 51
2.1. Организмы 51
2.2. Нефть и нефтепродукты 51
2.3. Оценка влияния нефти и нефтепродуктов на цианобактерии 55
2.4. Регистрация флуоресценции 55
2.5. Определение относительного количества клеток флуоресцентным методом . 55
2.6. Определение интенсивности фотосинтеза по флуоресценции хлорофиллаа 57
2.7. Определение миграции энергии между фикобилинами и хлорофиллом а 60
2.8. Регистрация длительного послесвечения 60
2.9. Определение относительного количества живых клеток цианобактерии по характеристикам длительного послесвечения 62
2.10. Оценка фотосинтетической активности по длительному послесвечению 63
2.11. Методы анализа состава жирных кислот мембранных липидов цианобактерии 67
2.12. Обработка результатов экспериментов 68
ГЛАВА III. Результаты исследования 69
3.1. Влияние температуры выращивания на численность клеток, свойства фотосинтетического аппарата и состав жирных кислот мембранных липидов цианобактерии 69
3.1.1. Влияние температуры на численность клеток и свойства фотосинтетического аппарата цианобактерии 69
3.1.2. Влияние температуры выращивания на жирно-кислотный состав мембранных липидов клеток цианобактерии 71
3.2. Влияние Самгорской нефти и ее фракций на жизнеспособность цианобактерии 75
3.2.1. Влияние нефти на жизнеспособность клеток цианобактерии 75
3.2.2. Влияние отдельных фракций нефти на численность клеток цианобактерии 79
3.3. Влияние Самгорской нефти и нефтепродуктов на фотосинтетические реакции клеток цианобактерии. 86
3.3.1. Влияние нефти на фотосинтетические реакции клеток культуры цианобактерии 87
3.3.2. Влияние фракций нефти на фотосинтетические реакции клеток цианобактерии 94
3.4. Влияние Самгорской нефти и нефтепродуктов на состав жирных кислот мембранных липидов клеток цианобактерии 101
3.5. Апробация метода длительного послесвечения в полевых условиях 106
ГЛАВА IV. Обсуждение экспериментальных результатов
Выводы 117
Литература 118
- Использование биологических индикаторов в качестве мониторинга загрязнения природной среды
- Определение интенсивности фотосинтеза по флуоресценции хлорофиллаа
- Влияние температуры выращивания на жирно-кислотный состав мембранных липидов клеток цианобактерии
- Влияние Самгорской нефти и нефтепродуктов на состав жирных кислот мембранных липидов клеток цианобактерии
Введение к работе
В настоящее время вследствие увеличения эксплуатации природных ресурсов возрастает загрязнение вод, почвы и атмосферы. Одним из главных антропогенных факторов, воздействующих на окружающую среду, является нефть и нефтепродукты. Угроза глобального загрязнения Мирового океана нефтью и продуктами ее переработки быстро возрастает. Ежегодно в моря и океаны поступает около 7-Ю млн. тонн нефти. В конце 80-х годов приток нефти в водные акватории Земли утроится (Мартынов, Солнцев, 1976 ; Нельсон-Смит, 1977; Милейковский, 1978). Отрицательные последствия нефтяного загрязнения многообразны. Особенно они опасны для водных биоценозов. Нефтепродукты, попадающие в атмосферу и почву, в конце концов оказываются в закрытых водоемах и океане. Первичными продуцентами водных биоценозов являются фотоавтотрофные организмы - водоросли и водные растения. Они в процессе жизнедеятельности выделяют в окружающую среду и поглощают из нее много органического вещества. Эта "открытость" обмена делает их чувствительными к загрязнению среды. Отмечена неодинаковая чувствительность фотоавтотрофов к нефтяному загрязнению. Возможна адаптация цианобактерий к токсическим концентрациям нефти и нефтепродуктам. Малые концентрации нефтепродуктов стимулируют, а большие уменьшают численность и ингибируют физиологическую активность водных фотоавтотрофов (Гапочка , 1981; Миронов , 1973,1980). Эти исследования разрозненны, некоторые данные противоречивы, проверены на небольшом количестве видов, выполнены разными методами, в них часто не оценивается зависимость результата действия нефтепродукта от физиологического состояния клеток фотоавтотрофов и от продолжительности наблюдения. Все это требует даль-
- б -
нейших исследований, которые удобно проводить на модельных организмах.
Известно, что первичные изменения в живой клетке под воздействием широкого круга факторов внешней среды проявляются в реакциях биологических мембран. Прижизненные наблюдения за состоянием мембран могут служить методами индикации состояния организма. На основании изменения функциональной активности биомембран и их структурной организации можно делать заключение о наличии в окружающей среде вредных веществ.
Моделью для исследований влияния нефтепродуктов на фотоав-тотрофные организмы в настоящей работе была выбрана цианобакте-рия Ап&Ъаепа variabilis . Для оценки состояния популяции и функциональных свойств мембран фотосинтетического аппарата этой культуры использовали явления: флуоресценции (Л) и длительного послесвечения (ДПС). Для исследования структурных свойств мембран измеряли состав жирных кислот мембранных липидов.
Цель работы состояла в исследовании закономерностей изменения функциональных и структурных характеристик фотосинтетических мембран цианобактерии a. variabilis ПОд влиянием нефти и ее фракций в динамике инкубации культуры в различных физиологических условиях.
В задачи работы входили:
Выявление закономерностей изменения состояния популяции и активности фотосинтетического аппарата цианобактерии a. variabilis при загрязнении Самгорской нефтью и сравнение влияния легкой и тяжелой фракций нефти при двух температурах 35 и 15с на основании измерения ФЛ и ДПС.
Анализ состава жирных кислот мембранных липидов клеток цианобактерии в норме и после загрязнения культуры нефтепродук-
тами. 3. Проверка возможности использования выбранных методических приемов для наблюдения в полевых условиях за воздействием нефти и нефтепродуктов на фотоавтотрофные организмы. Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование влияния Самгорской нефти и отдельных ее фракций в динамике инкубации цианобактерии a. variabilis с использованием ряда биофизических и биохимических показателей. Показана последовательность структурных и функциональных нарушений в фотосинтетическом аппарате цианобактерии под действием нефтяного загрязнения. Обнаружено, что снижение температуры выращивания до 15С повышает чувствительность цианобактерии к интоксикации нефтепродуктами. Установлено, что повреждающее действие Самгорской нефти обусловлено ее тяжелой фракцией. Легкая фракция нефти снижает токсичность тяжелой на клетки цианобактерии A. variabilis.
Практическая ценность. Показано, что методы регистрации ФЛ и ДПС можно использовать как в лаборатории, так и в полевых условиях для оценки влияния нефтяных углеводородов на клетки цианобактерии и других фотоавтотрофов. Полученные данные расширяют представления о закономерностях реактивных перестроек в фотосинтетическом аппарате организмов под воздействием изменяющихся условий среды. Наблюдения важны для понимания физиологического состояния популяций фотоавтотрофов в экосистеме в условиях нефтяного загрязнения. Данные работы могут быть использованы для прогнозирования последствий аварийных нефтяных загрязнений.
Внедрение. Разработанный метод исследования внедрен в практику экспедиционных работ лаборатории Природных углеродистых веществ кафедры геохимии ландшафтов Географического факуль-
тета МГУ для изучения загрязнения окружающей среды нефтью и нефтепродуктами.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, в которую вошли методы исследования, результаты, их обсуждение, выводы и список литературы. Работа изложена на йб страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 23 рисунка . Список литературы имеет 2,Ъ8 наименований.
Использование биологических индикаторов в качестве мониторинга загрязнения природной среды
В качестве индикаторов для оценки малых, предельно допустимых концентраций (ПДК) и больших техногенных нагрузок, а также всевозможных химических загрязнителей в воде , почве и атмосфере используют ответные физиологические и биохимические реакции различных живых организмов - микроорганизмов, низших и высших растений и животных, с целью прогнозирования влияния антропогенных факторов внешней среды на живые организмы (Израэль и др., 1978 ; Айверсон, 1979). Наличие или отсутствие любых видов организмов и их сообществ является показателем состояния окружающей среды. К видам индикаторов относят такие организмы, присутствие , обилие или отсутствие которых указывает на определенные факторы окружающей среды или определенные комбинации этих факторов.
Видами индикаторов служат стенобионты, чутко реагирующие на незначительные отклонения отдельных факторов или их сочетаний в окружающей среде. Биологическими индикаторами могут быть виды или сообщества видов показателей определенного экологического фактора, указывающие на наличие следующих загрязняющих химических соединений: тяжелые металлы, нефть и нефтепродукты, пестициды и канцерогенные полициклические ароматические углеводороды. Биологическими индикаторами могут служить любые представители живых организмов от одноклеточных микроорганизмов до растений и животных. Основной проблемой физиологии является выявление и оценка надежности биологических индикаторов и разработка критериев их использования в исследовании загрязнений окружающей среды различными токсическими соединениями. В оценке токсичности, в качестве тест-организма в настоящее время используется известный биологический вид, культивируемый в лаборатории, а также обитающий в природной среде при воздействии на него разнообразных загрязняющих агентов. Возможность использования индикаторных организмов в качестве контроля влияния загрязнения в водных акваториях основана на том, что влияние загрязнения приводит к изменению видового состава и численности популяции.
Рассмотрим вначале микробиологическую индикацию загрязнения внешней среды. Изучали численность и распределение липоли-тических бактерий в Черном море, а также бактерии, разрушающие полициклические и хлорированные соединения в Балтийском море. Липолитические бактерии составляли 44$ от числа всех сапрофитных бактерий в водной толще и их численность колебалась в воде от 10 до 10 кл/мл. По мере удаления от прибрежных и приустевых участков в открытом море число липолитических бактерий снижалось до нескольких клеток в I мл воды. В воде доминировали липолитические бактерии следующих родов: citrobacter, Proteus, Erwiitia j Escherichia . Плотность бактерий, окисляющих бенз(а)-пирен в открытой части Балтийского моря, составляла 10-100 кл/мл. Численность бенз(а)пирена толерантной микрофлоры оказалась много выше, чем бенз(а)пирен-окисляющей. Численность бактерий, разрушающих хлорированные углеводороды, достигала в Балтийском 2 4 море 10 -10 кл/мл. Распределение и численность липолиюв может служить индикатором органических загрязнений, а бактерии окисляющих бенз(а)пирен и хлор-углеводороды - нефтяных и промышленных (Цыбань и др., 1981).
В качестве микробиологических индикаторов к различным органическим и нефтяному загрязнению в заливах Баренцова моря использовали: кишечные палочки, энтерококки, нефтеокисляющие микроорганизмы и бактериофаги. По микробиологическим показателям загрязнений заливов бытовой и нефтяной органикой было прослежено, что чем грязнее вода, тем ниже титр санитарно-показательных микроорганизмов; при этом изменение титра индикаторов бытовых загрязнений скоррелировано с титром микроорганизмов - нефтераз-рушителей (Токин и др., 1979).
Для полевых условий пригоден тест-метод силикагелевой среды с нефтепродуктом, позволяющий учесть истинные нефтеокисляю-щие бактерии. Выделенные из морской воды нефтеразрушающие микроорганизмы относятся к артробактериям и сапрофитным микобактери-ям (Гусев и др., 1980).
В исследовании влияния природных условий, а также присутствия в среде нефтепродуктов на рост и физиологическое состояние морских водорослей: Dunaliella vir. , Nephrochloris sal,, Porpbyridium. sp. использовали метод диффузионного культивирования. Независимо от присутствия пленки нефтепродуктов на поверхности воды, в которую были погружены полупроницаемые камеры с водорослями, рост в этих условиях был более интенсивным, чем параллельных периодических культурах. Рост сопровождался снижением содержания хлорофилла в клетках всех водорослей и фико-билиновых пигментов. У красной водоросли обсуждают возможность данного метода для изучения функционирования микроорганизмов in situ и применение его при биоиндикации состояния окружающей среды с помощью микроводорослей (Сенцова, Гусев, 1982). У микроводорослей отмечаются видовые различия в чувствительности к одному и тому же загрязняющему агенту, поэтому менее устойчивые виды могут использоваться для биотестирования. Для водных акваторий, загрязненных тяжелыми металлами, наиболее эффективна Chloreila vulgaris . При биологическом анализе хлорорга-нического загрязнения преимущество имеют виды Gyrodinium fiesum ,
Ditylum brigbtweiiii . На нефть и нефтепродукты чутко реагируют D. brigbtweiiii и CToscinodiscus granii . Нарушение биопродукционных процессов регистрировалось по изменению скорости ассимиляции углерода и уровню замедленной флуоресценции, которые адекватно отражали аномальное поведение тест-организмов (Цвылев, Ткаченко , 1981).
Определение интенсивности фотосинтеза по флуоресценции хлорофиллаа
После начала освещения фотосинтезирующих организмов наблюдается сложное изменение в уровне свечения (рис. 5). Эти кинетические кривые являются отражением индукционных явлений фотосинтеза. Время, занимаемое индукцией, затрачивается пигментным аппаратом на адаптационные перестройки, необходимые ему для функционирования в условиях освещения.
ДПС связано со световыми и темновыми процессами, протекающими на мембранах тилакоидов. По изменению интенсивности ДПС и другим его характеристикам можно судить об интактности фотосинтетического аппарата. Например, по кинетическим характеристикам индукционной фазы можно оценить скорости фотосинтетической ассимиляции СОр или выделения Ор листьями (обзоры, Тарусов, Веселовский, 1978 ; Веселовский, Веселова, 1983). Таким образом, наблюдение за свойствами ДПС позволяет судить об относительной жизнеспособности популяции клеток цианобактерии Anabaena variabilis.
Для оценки относительной величины фотосинтетической активности (СА) цианобактерии A, variabilis мы использовали факт тушения ДПС во время индукционной фазы фотосинтеза (Тарусов, Веселовский, 1978 , Веселовский, Веселова, 1983). Величина (с-а)/с была принята пропорциональной фотосинтезу, следовательно, мы использовали величину тушения ДПС от уровня с, сразу после освещения, до стационарного уровня - а.
Отношение уровня свечения в максимуме температурной зависимости (Ь) к уровню свечения (а) при комнатной температуре 22С Ь/а (в наших опытах температура 28С) тоже может быть показателем состояния электрон-транспортной цепи. Чем ниже это отношение , тем медленнее работает электроннотранспортная система. Падение этого отношения у поврежденных растений рассматривают как нарушение работы фотосинтетического аппарата (Джанумов и др., 1971 ; Александров , Джанумов, 1972 ; Веселова, Веселовский, 1974). По нашим расчетам, поскольку изменения отношения уровня свечения (Ь-а)/ при температуре 28(j соответствуют изменениям величины (с-а)/с, оно также было использовано как показатель относительной величины уровня фотосинтеза.
Для анализа термостабильности фотосинтетических мембран цианобактерии АпаЪаепа variabilis регистрировали температурные зависимости длительного послесвечения. Характер зависимости представлен на рис. 5. Значение температуры максимума на температурной зависимости ДПС отражает термостабильность фотосинтетических мембран (Тарусов, Веселовский, 1978). Перестроение температурных зависимостей ДІЮ в координаты Аррениуса позволило выявить критические точки, указывающие температурные области структурных изменений тилакоидных мембран.
Клетки цианобактерии A. variabilis осаждали путем центрифугирования 10 минут при 5000 о, осадок промывали дистиллированной водой и ре суспендировали в 3 мл калий-фосфатного буфера рН 7,1. Полученную суспензию разрушали ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-І (22 кГц, 2 раза по 30 сек.). Затем экстракцию липидного материала проводили по Дж.Фолчу с сотр. (Foich et ai., 1957) в модификации Е.Блайя, В.Дайера и М.Фишвика, А.Урайта (Bligb. , Dyer, 1959; Plsbwick , Wright , 1977). С этой целью гомогенат клеток цианобактерии в калий-фосфатном буфере (I мл) заливали смесью (20 мл) хлороформ-метанол (2:1, по объему), смесь перемешивали, через 15-20 минут добавляли бидистиллирован-ную воду (3 мл), вновь перемешивали и оставляли при температуре 3-5С на 3 часа. Затем отбирали нижнюю (хлороформную фазу, которую выпаривали на роторном испарителе при температуре 35С. Образцы метилировали с ацетилхлоридом - СН3СОС (Ланкин, Садов-никова , 1971). Упаренные пробы растворяли в 5 мл метанола с добавлением 0,1-0,2 мл ацетилхлорида. Смесь метилировали 1,5 часа на водяной бане при 75С с обратным холодильником. Затем переводили образовавшиеся метиловые эфиры жирных кислот в гексан с прокаленным Na2S0n, упаривали гексан с метиловыми эфирами жирных кислот до объема 0,5 мл и анализировали.
Состав жирных кислот мембранных липидов определяли методом газо-жидкостной хроматографии, используя хроматограф типа ЛХМ-8МД модель 5, детектор - пламенно-ионизационный (ПИЩ), колонка длиной 2 метра и диаметром - 3 мм. Насадка: неподвижная жидкая фаза 8% PEGA (полиэтиленгликольадипинат) на носителе Chromatoii ж-AW-HMDS с размером частиц 80-100 меш. Анализ проводили в изотермическом режиме при температуре термостата 175С, испарителя - 250С. Газ-носитель - гелий, давление на входе колонок 5 атм., скорость газа-носителя 30 мл/мин.
Содержание отдельных жирных кислот определяли по отношению площади соответствующего пика хроматограммы, которую рассчитывали методом триангуляции/ к суммарной площади пиков высших жирных кислот и выражали в процентах.
Влияние температуры выращивания на жирно-кислотный состав мембранных липидов клеток цианобактерии
В присутствии нефти наблюдалось отставание в росте. Таким образом, наблюдалась различная реакция клеток культуры цианобактерии, выращиваемых при температурах 35 и 15С, на введение Самгорской нефти.
В культуре, росшей при оптимальных условиях, первичное снижение численности клеток обратимо, популяция восстанавливалась через две недели, тогда как клетки цианобактерии, выращенные при 15С, после временной стабилизации численности клеток они погибают (в культуре остается около 10-20% клеток).
Из рисунков 8, 9 и 10 видно, что под действием нефти изменения в численности клеток, регистрируемые по параметрам ДПС, изменяются больше, чем в случае измерения ФЛ. Это означает,что, вероятно, под действием нефти происходит преимущественная гибель жизнеспособных живых в популяции клеток. Уменьшение ФЛ показывает , что одновременно происходит отмирание клеток. Например, через 10 суток после введения нефти при температуре 35С погибает около 30% живых клеток и 10-15% клеток лизируются, а в 15-градусной культуре в это время погибает половина клеток и разрушается 20%. При инкубации свыше трех недель после введения нефти в 15-градусную культуру разница в количестве клеток, измеренных по параметрам ФЛ и ДШ , уменьшается, вероятно, вследствие усиления деструкции мертвых клеток. На 34-35 сутки относительное количество клеток, измеренных обоими способами, совпадает, следовательно, в культуре остаются функционально активные, жизнеспособные клетки (рис. 8, 9 и 10).
Установлено, что углеводороды с большим молекулярным весом токсичнее, чем с низким. Однако, есть и другого рода наблюдения - нефтепродукты с низкой температурой кипения действуют неблагоприятно на биологические организмы ( overbeek., Blonde-au , 1954 , Baker , 1970,1971а,б , Pulich et el., 1974). Вероятно, противоречия связаны с тем, что эксперименты проводили с различными концентрациями и разными по физико-химическим свойствам нефтепродуктами, на различные объекты среды и т.п.
Нефти представляют сложные смеси различных по молекулярному весу углеводородов. В настоящее время нет единого мнения о токсичности отдельных углеводородов. Чтобы представить, какова роль отдельных углеводородных фракций в биологическом действии на популяции цианобактерии A. variabilis цельной Самгорской нефти последняя была разделена на четыре фракции х и эффект каждой на рост клеток был проверен. Фракции отличались по температурам кипения: легкая - 50-200С , две средних - 200-25ОС , 250-300С и тяжелая - 350-500С. В культуру вводили фракции из расчета, чтобы концентрация нефтепродуктов в культуре составляла -0,5 мл/л. Уже первые опыты выявили неодинаковое действие легких и тяжелых фракций нефти на культуру клеток. Поэтому в дальнейшем в культуру цианобактерии добавляли легкую и тяжелую фракцию в количестве, которое соответствует их содержанию в Самгорской нефти при концентрации I мл/л (0,4 и 0,2 мл/л соответственно). Концентрация легкой фракции была в два раза больше, чем концентрация тяжелой. Использовали также смесь этих фракций как модель цельной Самгорской нефти. Опыты проводили с культурой клеток цианобактерии A. variabilis , выращенными при температурах 35 и 15С.
Влияние фракций сильно зависело от температуры культивиро х Фракции были разделены и любезно предоставлены сотрудником ИОФХ АНГрССР (г.Тбилиси) - Г.Ш.Хитири. После их введения в культуру при температуре 35С количество клеток колебалось (рис. Па, 12а и ІЗа). Б первые несколько дней инокуляции нефтепродуктами было заметно подавление численности, но затем к 26-30 суткам выращивания она частично восстанавливалась. Это было видно как в случае ФЛ измерения, так и методом ДІЮ.
В действии фракций наблюдались различия. После воздействия на культуру цианобактерии легкой фракции (50-200С) количество клеток в течение последующих двух-трех суток уменьшалось на 30-40% от контроля. Введение тяжелой фракции Самгорской нефти (350-500С) в среду с культурой вызывало уменьшение количества клеток измеренное ФЛ методом, до 30-35% от контроля через 7-8 суток и к 24-30 суткам выращивания их количество доходило до исходного состояния. Измерения методом ДПС также показали, что происходит уменьшение числа клеток культуры до 50-60$ от контроля, но через 2-4 суток после добавления фракции и их количество медленно нарастало к 30 суткам выращивания, но не достигало контроля.
Наблюдались различия между действием на клетки легкой и тяжелой фракций. Клетки культуры, росшие при температуре 35С, быстрее восстанавливались до исходного состояния после воздействия легкой фракции по сравнению с действием тяжелой.
Влияние Самгорской нефти и нефтепродуктов на состав жирных кислот мембранных липидов клеток цианобактерии
Нефть и нефтепродукты являются одними из основных факторов антропогенных загрязнителей водных акваторий, вследствие аварий танкеров и при бурении в шельфових зонах морей и океанов, прорывов нефтепроводов (Рябчиков, 1974 ; Мартынов, Солнцев, 1976 , Нельсон-Смит , 1977).
Существует ряд методов оценки нефтяного загрязнения по биотестам: физиологические и биохимические реакции, анатомические, морфологические, биоритмические отклонения от нормы, нарушения ценотических и биогеоценотических связей. Важной задачей мониторинга является разработка биоиндикаций, которые способны оценить биологическое действие негативного фактора, влияющего на окружающую среду. К биоиндикации предъявляют следующие требования: быстрота, точность и воспроизводимость результатов, кроме того, объекты должны иметься в большом количестве и единого качества. С помощью этих биоиндикаторов можно проводить массовый анализ. Такие методы могут быть основаны на фундаментальных свойствах и общих реакциях биологического объекта (Израэль, 1978, 1982 ; Шуберт, 1982).
Большое значение имеет выбор объекта для биотестирования. Соответствующий вид должен быть массовым в экосистеме и среда загрязнения должна быть средою его обитания. Прежде , чем работать с биоиндикатором, необходимо знать его общие свойства и наиболее чувствительные реакции к загрязнению. Этим условиям удовлетворяют фотоавтотрофы, в частности цианобактерии, которые обитают в водных и почвенных средах и обладают "открытым" обменом с окружающей средой.
Как было отмечено в разделе "Обзор литературы" (стр. ib-ІЗ ) ,по отношению к различным концентрациям нефтепродуктов микроводоросли обладают различной чувствительностью. Малые концентрации нефти стимулируют, а большие угнетают физиологическую активность и рост водных фотоавтотрофов. Наблюдается адаптация микроводорослей к токсическим концентрациям нефтепродуктов. Поэтому в настоящей работе мы попытались систематически изучить последовательность первичных изменений функциональных и структурных характеристик фотосинтетических мембран цианобактерии АпаЪаепа variabilis под влиянием Самгорской нефти и ее отдельных фракций. На основании таких наблюдений можно было решить, как в качестве модели определения степени загрязненности окружающей среды нефтью и нефтепродуктами можно использовать сине-зеленые водоросли (цианобактерии). Физиология и биохимия цианобактерии интенсивно исследуется в последние десятилетия (Гусев, Никитина, 1979). Исследование проводили на стационарной фазе роста культуры цианобактерии A. variabilis . Для подсчета количества клеток использовали приемы, основанные на измерениях ФЛ и ДПС, свойства которых подробно описаны в литературе (обзор, Тарусов, Веселовский, 1978), они оказались проще, надежнее и быстрее классического микроскопического метода (в камере Горяева). Несмотря на то, что мы пытались стандартизировать выращивание, получить культуру цианобактерии в колбах с равноценными и идентичными популяцими, это оказалось сложно. Поэтому при анализе численности мы использовали несколько параметров - интенсивность флуоресценции клеток цианобактерии в присутствии диурона О- щ), /- интенсивность свечения в максимуме температурной зависисимости послесвечения и амплитуду вспышки послесвечения на индукционной фазе - с (рис. 3 и 5).
Анализ относительного количества клеток по этим трем параметрам позволил оценить характер изменения численности клеток на стационарной фазе роста культуры цианобактерии после введения в среду выращивания Самгорской нефти или ее различных фракций. Однако, оказалось, что результаты опытов с использованием ДПС имели лучшую воспроизводимость, чем в случав измерения ФЛ.
Важную дополнительную информацию о состоянии фотосинтетического аппарата живых клеток в условиях нефтяного загрязнения дало изучение температурных зависимостей ДПС цианобактерии. Наблюдение за изменением интенсивности свечения при увеличении температуры позволяло следить за функционально активными, присутствующими в культуре живыми клетками. Измерение температурных зависимостей ДПС выявило температурные условия максимума фотосинтеза. Температурная зависимость и энергия активации фотосинтетического аппарата фотоавтотрофов зависит от физиологического состояния живых клеток, следовательно, можно использовать эти параметры в качестве теста к нефтяному загрязнению. Температурные зависимости ДПС наблюдаются в том случае, когда интактна ФС П (обзор, Тару сов, Веселовский, 1978), в случае отсутствия температурных зависимостей можно предположить, что у исследуемых клеток культуры блокирована и не функционирует ФС П (может быть даже разрушена), то клетки популяции вскоре погибнут, что наблюдалось в наших экспериментах с цианобактериями, культивируемыми с нефтепродуктами при пониженной температуре. Данные о большей чувствительности ФС П согласуются с результатами других исследователей (Маторин и др., 1975 ; Веселова и др., 1980). Прекращение функционирования ФС П происходит потому , что нарушается процесс передачи энергии из антенн в реакционный центр, и разрушается система, окисляющая воду.
Смещение по температурной шкале точки перелома на температурных кривых послесвечения, представленных в координатах Аррениуса, указало на изменение в структуре фотосинтетических мембран у клеток, росших при I5C, в результате загрязнения культуры Самгорской нефтью. Это согласуется с прямым наблюдением увеличения степени насыщенности жирных кислот мембранных липидов в этих условиях (табл. 5).
