Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Каллусные культуры. Дедифференциация клеток 7
1.2. Гетерогенность каллусных культур 8
1.3. Дифференциация клеток 11
1.4. Белки как маркеры морфогенетических процессов 12
1.5. Факторы, определяющие морфогенез in vitro 19
1.6. Содержание и метаболизм СК в растениях 23
1.7. СК как участник сигнальных систем 25
1.7.1. Активные формы кислорода 25
1.7.2. Участие СК в реакции сверхчувствительности и апоптозе 29
1.7.3. Роль СК как вторичного мессенджера 30
1.7.4. Индукция защитных белков 32
1.7.5. СК и дыхание 34
1.8. Некоторые другие физиологические эффекты СК 35
Глава 2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследований 37
2.2. Методы исследований 37
2.2.1. Получение каллусных культур 37
2.2.2. Условия культивирования 37
2.2.3. Определение прироста биомассы 40
2.2.4. Приготовление препаратов для цитогенетического анализа 40
2.2.5. Определение митотической активности и количества хромосомных аберраций 40
2.2.6. Определение содержания перекиси водорода 41
2.2.7. Выделение белков 41
2.2.8. Электрофоретическое разделение белков 41
2.2.9. Другие измерения 42
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Инициация каллусов гречихи на средах с агаром и фитогелем 43
3.2. Изменение содержания растворимых белков в каллусах гречихи в течение пассажа 49
3.3. Полипептидный состав каллусов гречихи с различным морфогенным потенциалом 52
3.4. Полипептидный состав эксплантов 57
3.5. Влияние СК на ростовые процессы каллусов гречихи 59
3.6. Действие СК на содержание и полипептидный спектр растворимых белков каллусов гречихи 70
3.7. Влияние СК на ростовые процессы каллусов гречихи в первые дни культивирования 76
3.8. Влияние СК на содержание перекиси водорода в каллусах гречихи 82
Заключение 87
Выводы 89
Список литературы 90
- Гетерогенность каллусных культур
- Активные формы кислорода
- Определение прироста биомассы
- Изменение содержания растворимых белков в каллусах гречихи в течение пассажа
Введение к работе
Салициловая кислота (СК) является стрессовым фитогормоном, участвующим в формировании локальной и системной устойчивости (Raskin, 1992; Тарчевский, 2002). Известно, что содержание салицилата значительно повышается при действии элиситоров, патогенов и экзогенной перекиси водорода, и, наоборот, обработка растений СК приводит к повышению содержания Н202 и устойчивости к инфицированию. Установлено, что салицилат может влиять на процессы роста и развития растений. Показано, что СК приводит к активации прорастания семян (Шакирова, 2001), индуцирует цветение растений (Cleland, Tanaka, 1979), стимулирует органогенез и эмбриоидогенез в культурах in vitro (Kling, Meyer, 1983; Sherry et al., 1992; Luo et al., 2001). Перекись водорода и индуцирующий ее накопление салицилат могут выступать в роли сигналов, вызывающих в неинфицированных клетках экспрессию защитных генов и образование ряда патоген-индуцируемых белков (PR-белков) (Raskin, 1992; Gaffney et al., 1993; Chen et al., 1995; Тарчевский и др., 1996; Максютова, 1998).
Каллусы с различной способностью к морфогенезу отличаются по морфофизиологическим, биохимическим и генетическим характеристикам. Морфогенный каллус гречихи татарской (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) интересен тем, что в течение длительного времени (до 10 лет) сохраняет характерную нодулярную морфологию, способность к регенерации и хромосомную стабильность, что достаточно редко встречается в культурах in vitro.
Представляло интерес проведение сравнительного анализа действия СК на каллусы с различной морфогенной способностью, поскольку данный вопрос является мало изученным.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление изменений морфофизиологических характеристик и белкового состава каллусов гречихи татарской с различным морфогенным потенциалом при действии
салициловой кислоты. Исходя из указанной цели, были поставлены следующие задачи:
изучить изменение содержания растворимых белков каллусов гречихи в ходе пассажа;
исследовать действие СК на ростовые процессы (прирост биомассы и митотический индекс) каллусов гречихи в различных условиях культивирования (свет, темнота);
исследовать влияние СК на белковый состав каллусных культур гречихи в различных условиях культивирования (свет, темнота).
определить содержание перекиси водорода в каллусах гречихи, культивируемых на средах с салицилатом в различных условиях (свет, темнота).
Научная новизна работы. Впервые среди растворимых белков каллусов гречихи с различной морфогенной способностью выявлены специфические полипептиды 35, 73 кДа, характерные для морфогенного типа каллуса, и 16, 62 кДа, характерные для неморфогенного типа каллуса. Впервые обнаружены различия в содержании отдельных полипептидов эксплантов (незрелых зародышей) и каллусных культур. Впервые показано влияние СК на ростовые процессы двух типов каллусов гречихи, проявлявшееся в изменении прироста биомассы и митотического индекса. Впервые показаны изменения в полипептидном спектре морфогенного и неморфогенного каллусов гречихи при действии салицилата в различных условиях культивирования (свет, темнота). Наиболее значительные изменения в полипептидном спектре наблюдались в неморфогенном каллусе, культивируемом на свету. Впервые выявлены различия в содержании перекиси водорода в каллусах с различной морфогенной способностью. Клетки неморфогенного каллуса содержали в 6.6 раза больше перекиси по сравнению с клетками морфогенного каллуса. Наиболее значительные изменения в содержании Н2Ог под действием СК обнаружены в неморфогенном каллусе при культивировании на свету.
Научно-практическая значимость работы. Обнаруженные нами
физиолого-биохимические особенности каллусов гречихи татарской могут представлять интерес для специалистов, занимающихся изучением процессов морфогенеза in vitro. Данные диссертационной работы могут найти применение в генетических, биотехнологических и селекционных исследованиях. Полученные результаты могут использоваться в учебном процессе при чтении лекций на кафедрах биохимии, физиологии и биотехнологии растений университетов и институтов сельскохозяйственного профиля.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на II (X) съезде Русского ботанического общества (Санкт-Петербург, 1998), на VII международном симпозиуме по гречихе (Canada, Winnipeg, 1998), на IV съезде общества физиологов растений (Москва, 1999), на Всероссийском симпозиуме "Клеточная биология на пороге XXI века", (Санкт-Петербург, 2000), на VIII международном симпозиуме по гречихе (Korea, Chunchon, 2001), на юбилейной научной конференции молодых ученых "Молодые ученые Волго-Уральского региона на рубеже веков" (Уфа, 2001), на 5 Пущинской конференции молодых ученых "Биология - наука 2ГГО века" (2001), на 6 Пущинской конференции молодых ученых "Биология - наука 2ГГ0 века" (2002), на итоговых научных конференциях КНЦ РАН (Казань, 2001; 2002).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация содержит 24 рисунка, 5 таблиц. Список литературы включает 289 наименований, в том числе 211 на иностранных языках.
Гетерогенность каллусных культур
Сложность структурной организации является характерным признаком каллусных культур, представленных различными типами клеток. Обычно в каллусах выделяют меристему и паренхиму, соотношение между которыми может меняться в процессе культивирования, что было показано на культурах женьшеня (Данилина и др., 1978). Часто в культурах выделяют еще запасающую ткань, представляющую собой скопление клеток, заполненных крахмальными гранулами и жировыми включениями, а также трахеидные элементы (Бутенко, 1975). В культуре Viciafaba по морфологическим признакам было выделено несколько типов клеток (Фролова, 1981). Наблюдаемое разнообразие исследователь рассматривала как результат перехода каллусных клеток от одного дифференцированного состояния (клетки меристематического типа с основной функцией деления) к другому типу дифференциации (клетки паренхимного типа, запасающие питательные вещества).
Растительные клетки в культуре подвергается значительным генетическим изменениям на самых различных уровнях. Данное явление получило название сомаклональной изменчивости. Наиболее часто в культурах in vitro наблюдаются мутации геномного уровня: полиплоидия и анэуплоидия. При длительном культивировании в клетках чаще всего происходит полиплоидизация, анэуплоидия встречается гораздо реже. Например, в культурах Vicia faba (Фролова, Шамина, 1978), Lycopersicon esculentum (Внучкова, 1978), Rauwolfia serpentina (Кунах, 1994) и многих других выявлена полиплоидия. Юрковой и сотрудниками (1985) при анализе длительно культивируемых (более одного года) каллусов твёрдой и мягкой пшеницы был обнаружен высокий уровень анэуплоидии (до 82,4% клеток). Повышение числа анэуплоидных и полиплоидных клеток при увеличении продолжительности культивирования было выявлено в каллусной культуре кукурузы (Paul, Ghosh, 1984) и ячменя (Singh, 1986). В результате клеточной селекции в длительно пассируемых культурах образуется относительно стабильная по признаку плоидности клеточная популяция, причем наиболее приспособленные к условиям культивирования клетки образуют модальный класс плоидности, которых в одной культуре может быть несколько (Шамина, 1978; Кунах, 1994).
В культурах наблюдается повышенное число хромосомных аберраций. Обнаружено, что каллусы, полученные из проростков кукурузы, имели много хромосомных аномалий, таких как разрывы или слипание хромосом, асинхронность деления, отставание хромосом (Mohanty et al., 1986). В каллусе мягкой пшеницы также были обнаружены такие структурные изменения хромосом как делеции и транслокации (Gupta, Atoned, 1986).
Сомаклональная изменчивость в культурах in vitro может затрагивать также и генный уровень, проявляющийся, например, в модификации ДНК (метилирование) и изменении активности генов (Lo Schiavo et al., 1989), транслокации участков хромосом (Ashmore, Gould, 1981).
Причины сомаклональной изменчивости в культивируемых клетках растений обсуждаются во многих работах (Bayliss, 1977; Шамина 1978; Фролова, 1981; De Klerk, 1990; Karp, 1991; Peschke et al., 1991).
Проведены многочисленные исследования, посвященные изучению морфологических особенностей каллусных культур. Начиная с первых работ по классификации каллусных культур по морфотипу, отмечается корреляция между морфологией каллусов и их способностью к морфогенезу. Под морфогенезом (Батыгина и др., 1994) следует понимать процесс формирования различных структур (не только органов), совершающийся на субмолекулярном, молекулярном, надмолекулярном, клеточном, тканевом и органном уровнях. В качестве критерия морфогенной способности можно использовать морфологию каллусных культур.
В работе Лу и Вэсила (Lu, Vasil, 1981) было выявлено два типа каллусов: один рыхлый, водянистый, желтоватой окраски, не способный к морфогенезу, в то время как другой, морфогенный каллус, был компактным, плотным,, белого цвета. Обнаружено, что количество морфотипов каллусов варьирует в зависимости от вида растения. Анализ каллусов, полученных в культуре пыльников ячменя, позволил выявить пять морфотипов (Искакова, 1991). В работе Росеева (1985) описано четыре основных типа и шесть подтипов каллусов ячменя, различающихся по своим морфогенным реакциям. Согласно классификатору, предложенному Кучеренко (1993), выделяют 33 морфотипа каллусов риса.
Обычно считается, что рыхлые каллусы морфогенетически неперспективны (Папазян, 1983; Гапоненко и др., 1984). Как правило, рыхлая консистенция неморфогенных культур определяется присутствием больших, удлиненных клеток паренхимного типа, тогда как в морфогенных культурах основная масса каллуса представлена мелкими меристематическими клетками. Рыхлая структура каллусных тканей не всегда свидетельствует об отсутствии способности к морфогенезу. Для многих видов растений, таких как ячмень (Бишимбаева, Рахимбаев, 1997), овес (Bregitzer, 1991), кукуруза (Fransz, Shel, 1994), некоторые виды хвойных (Hakman, 1987) и злаков (Круглова, Горбунова, 1997) описаны рыхлые эмбриогенные каллусы, структура которых определяется присутствием соматических зародышей, находящихся на разных стадиях развития
Дифференциация в биологии развития рассматривается как последовательность трех достаточно сложных процессов: появление у клетки компетенции, становление детерминации и, наконец, активация (Ермаков, Матвеева, 1994). Индуцирующее воздействие внешних факторов на систему, обладающую соответствующей компетенцией, приводит к детерминации развития. Под компетенцией понимается способность клетки воспринимать индуцирующее воздействие и специфически реагировать на него. Детерминация означает приобретение развивающейся живой системой состояния готовности к реализации вполне определенных наследственных потенций и выбора определенного пути развития из нескольких потенциально возможных (Чайлахян и др., 1982). Активация определяется как проявление внешних признаков, характерных для детерминированного пути развития, в том числе начало синтеза специфических белков. В основе процесса активации лежит изменение активности отдельных генов или их блоков (Ермаков, Матвеева, 1994)
Активные формы кислорода
При действии элиситоров начальным этапом НАДФН-оксидазной сигнальной системы является активация фермента НАДФН-оксидазы. Окисление НАДФН молекулярным кислородом приводит к образованию супероксид-анионов, которые в результате реакции, катализируемой супероксиддисмутазой, превращаются в Н202. Повышение содержания активных форм кислорода (окислительный "взрыв") приводит, с одной стороны, к реакции сверхчувствительности и к апоптозу, а с другой стороны, к увеличению содержания СК. Салицилат, в свою очередь, при патогенезе индуцирует локальную устойчивость клеток, находящихся рядом с местом внедрения патогена и системную устойчивость в частях растений, неинфицированных патогеном, которая распространяется и на последующее инфицирование (Тарчевский, 2002).
Элиситориндуцирумое образование перекиси водорода подавляется ингибиторами протеинкиназ, но активируется ингибиторами протеинфосфатаз (Tenhaken et al., 1995), появление окислительного "взрыва" в этом случае происходит и в отсутствие элиситора. Показано, что ингибиторы протеинкиназ могут блокировать реакцию сверхчувствительности и апоптоз в культуре сои (Levine et al., 1994) и листьях табака (Не et al., 1994). Все это свидетельствует о важной роли фосфорилирования и дефосфорилирования белков в осуществлении НАДФН-сигнального пути (Тарчевский, 2002).
К числу активных форм кислорода относятся 02 "-супероксид-анион, ОН-гидроксильный радикал, 02-синглетный кислород и перекись водорода (Меныцикова и др., 1994). Супероксид-анион в кислой среде может спотанно превращаться в 02, при нейтральных и щелочных рН с помощью супероксиддисмутазы образуется перекись водорода: 2 02 +2Н+С0Д» Н202+02. Считается, что это главный путь образования перекиси водорода в клетках. Н202 является источником образования наиболее сильного из известных окислителей в биосистемах - ОН радикала (Саприн, Калинина, 1999). Он образуется в реакциях Фентона в присутствии следовых количеств железа и меди: Fe2++H202- Fe3++OH + OH, а также реакции Габера-Вейса: 02 + Н202 - ОН + ОН+ 02 (Bowler et al., 1992; Меньшикова и др., 1994). В растениях Н202 образуется различными путями. Одним из них является окисление НАДФН локализованной в клеточной стенке пероксидазой (Mendy, 1994). Образование перекиси может происходить и при окислении аминокислот, таких как гистидин, метионин, триптофан (Knox, Dodge, 1985), глюкозы (Kazan et al., 1998) и щавелевой кислоты (Азаришвили и др., 1996). Основным местом синтеза перекиси водорода в клетках являются хлоропласты, ее образование выявлено также в перокисомах в процессе фотодыхания. Под действием стрессоров активные виды кислорода могут образовываться в митохондриях (Rich, Bonner, 1978; Van Breusegem, 2001).
Снижение содержания активных форм кислорода происходит с помощью ферментных систем растений. Супероксиддисмутаза превращает 02 в Н202, которая элиминируется аскорбат-оксидазой, глутатион-редуктазой, каталазой (Sairam, Srivastava, 2002), а также разлагается с помощью пероксидазы. Интересно, что пероксидаза является полифункциональным ферментом, способным редуцировать перекись и продуцировать активные формы кислорода (Хайруллин, 2001). Ферменты антиоксидантной защиты локализованы в органеллах (ядре, митохондриях, пероксисомах, хлоропластах), цитоплазме, клеточной стенке и могут секретироваться в межклеточное пространство (Ладыгина и др., 1970; Савич, 1989; Bowler et al, 1992)
Баланс между активными формами кислорода и антиоксидантной защитой может нарушиться из-за их активной генерации или снижения уровня антиоксидантов при действии различных факторов, такое состояние клетки является окислительным стрессом (Саприн, Калинина, 1999). Время жизни активных форм кислорода мало: для ОН-радикала - оно составляет 10"9с, синглетного кислорода и супероксид-аниона- 10"6с (Меньшикова и др., 1994). Считается, что эти молекулы не способны проникать через клеточную стенку растений (Bowler, Fluhr, 2000). По сравнению с ними Н2Ог относительно долгоживущая молекула (Ю"3с), которая может транспортироваться от места своего образования в клетке (Levine et al., 1994; Меныцикова и др., 1994) и проникать через мембраны (Van Breusegem, 2001). Гидропероксильный радикал НО 2, который образуется при протонировании супероксид-аниона при низких значениях рН, также способен к миграции, поскольку он менее полярен, чем 02 (Саприн, Калинина, 1999).
Активные формы кислорода оказывают повреждающее действие на клетки, разрушая белки, липиды, фотосинтетические пигменты, ДНК (Bowler et al., 1992; Hernandez et al., 1993). Гидроксильный радикал считается самым опасным, поскольку он может разрывать С-Н и С-С молекулярные связи (Меныцикова и др., 1994). Наиболее опасным является повреждение генома образующимся в реакции Фентона ОН-радикалом, вследствие наличия ионов меди и железа в зоне локализации ДНК. Предполагается, что перекись водорода и супероксид-анион сами не повреждают ДНК (Саприн, Калинина, 1999). Молекула ОН инициирует реакции, включающие деградацию нуклеиновых кислот и белков, перекисное окисление липидов, а супероксид-анион и Н2Ог рассматриваются как более слабые окислители (Mendy, 1994). Все активные формы кислорода являются сильными мутагенами, тератогенами и канцерогенами (Калуев, 1998). Токсичными для клетки могут быть также образующиеся в цепных реакциях органические перекиси, кетоны, спирты, эпоксиды, которые являются более долгоживущими по сравнению с активными формами кислорода (Меныцикова и др., 1994).
Определение прироста биомассы
Для построения кривой каллусы массой 250-300 мг высаживали на среду RX. В течение пассажа каждые 3 дня каллусы взвешивали. Оводненность каллусов определяли высушиванием кусочков каллуса до постоянного веса. Прирост биомассы по сырому или сухому весу за определенный отрезок времени рассчитывали по формуле: А = (тк - т„ )/ тн 100 %, где А - прирост биомассы, тк - конечный вес каллуса тн - начальный вес каллуса. Окрашивание хромосом проводили 2% ацетоорсеином (2 г синтетического орсеина ("Serva") растворяли в 100 мл 45% уксусной кислоты, нагретой до слабого кипения). Материал кипятили в красителе в течение 5-10 секунд, затем готовили давленые препараты в 45% молочной кислоте. Препараты просматривали с помощью микроскопа Jenamed (Германия).
Митотическии индекс определяли подсчитывая количество делящихся клеток на нескольких препаратах, приготовленных из разных участков каллуса. При этом учитывалось не менее 3000 клеток на точку фиксации. Митотическии индекс вычисляли по формуле: MH=M/N 100%, где МЯ-митотический индекс, N - общее количество клеток, М - число делящихся клеток. Число хромосомных аберраций определяли как отношение суммы аберрантных анафаз и телофаз к общему числу подсчитанных анафаз и телофаз. Определение перекиси водорода проводили согласно Беллинкампи и др. (Bellincampi et al., 2000) в нашей модификации. Каллусную ткань растирали в холодном ацетоне в соотношении 1:2, затем центрифугировали 30 мин при 8000 об/мин. на холоду. Супернатант и реагент смешивали в соотношении 1:1 и через час измеряли оптическую плотность на фотометре КФК-3 (Россия) при 560 нм. Содержание перекиси водорода определяли по калибровочной кривой, построенной с помощью известных концентраций Н202. В состав реагента входили 0.5 мМ железо аммоний сернокислое (II), 50 мМ H2S04, 0.2 мМ оранжевый ксиленол (Sigma), 200 мМ сорбитол.
Белки каллусной ткани и незрелых зародышей замораживали в жидком азоте, затем растирали в 50 мМ трис-НО буфере с 5% меркаптоэтанолом (рН 7,4). Экстракцию белков проводили в течение 1,5 часов при t = -4С, затем гомогенат центрифугировали 30 мин при 8.000 об/мин. Содержание растворимых белков определяли по Брэдфорду (Bradford, 1976).
Одномерный электрофорез проводили в 12% полиакриламидном геле в присутствии 2% додецилсульфата натрия по Леммли (Laemmli, 1970) на приборе для электрофореза в вертикальных пластинах геля. В качестве маркеров использовали следующие белки ("Serva", Германия): бычий сывороточный альбумин с молекулярной массой 66 кДа, яичный альбумин - 45 кДа, трипсиноген - 24 кДа, /?- лактоглобулин - 18,4 кДа, лизоцим - 14,3 кДа. Гели окрашивали 0,1 % раствором Кумасси G-250 ("Serva", Германия). Молекулярную массу полипептидов определяли по методу Вебера и Озборна (Weber, Ozborn, 1969).
Электрофоретические гели сканировали на сканере Relysis Scopio Pro (Тайвань), затем обрабатывали с помощью программ Photoshop 5,0 и Microsoft Word 97. Денситометрический анализ проводили с помощью программы Scion Image (www.scioncorp.com). Каллусы фотографировали фотоаппаратом "Зенит" с переходными кольцами и без них, на пленку AGFA HDC plus и Тип-17 "Тасма". Эксперименты проводились в 3-х кратной биологической повторности. Данные обработаны статистически с помощью программы Statgraph, графики построены в программе Microsoft Graph. В таблицах и на графиках данные представлены как средние арифметические величины ± среднеквадратичная ошибка.
Изменение содержания растворимых белков в каллусах гречихи в течение пассажа
Все клетки в растении находятся под контролем генетически детерминированных программ развития. Системы регуляции обеспечивают реализацию генетически заложенных потенций в клетке в пределах нормы реакции и в зависимости от внешних условий. В культурах in vitro нарушаются естественные коррелятивные связи между клетками и тканями растений, в результате чего клетки рассматриваются как относительно самостоятельные индивидуумы Длительно культивируемые клетки растений in vitro образуют неполовую популяцию. Популяции соматических клеток физиологически асинхронны и генетически гетерогенны (Бутенко, 1975; Yeoman, Forche, 1980; Фролова, 1981).
Одной из важных характеристик популяции клеток является рост, который обычно оценивают по числу клеток или по их общей биомассе. Несмотря на асинхронность популяции и относительную самостоятельность составляющих ее клонов, клетки in vitro в целом проходят фазы ростового цикла, характерные для роста клеток высших растений in vivo (Бутенко, 1999).
При переносе каллуса на свежую питательную среду увеличение числа клеток описывается сигмоидной кривой роста. Весь цикл роста принято разделять на несколько фаз: лаг-фазу, фазу ускорения роста, фазу экспоненциального роста, фазу замедления роста, стационарную фазу и фазу деградации. В зависимости от вида растения, используемого экспланта или клона полученной культуры сигмоидная кривая роста может видоизменяться (Бутенко, 1999).
Исследуемые морфотипы были отобраны в связи со способностью нодулярного каллуса к эмбриоидогенезу и неспособностью рыхлого каллуса к любому типу морфогенеза. В дальнейшем рыхлый каллус будет называться неморфогенным, а нодулярный - морфогенным.
Обнаружено, что прирост биомассы неморфогенного каллуса превышает прирост биомассы морфогенного каллуса. На 21 сутки культивирования прирост биомассы неморфогенного каллуса на сырой вес составлял 1100%, а морфогенного каллуса 121% (рис. 4). Неморфогенный каллус был более оводненным (95-98% воды), по сравнению с морфогенным (90-94% воды). Прирост биомассы неморфогенного каллуса в отличие от морфогенного каллуса приближался к типичной сигмоидной кривой роста. Высокий прирост биомассы неморфогенного каллуса обусловлен как интенсивным делением клеток, так и их последующим растяжением, в то время как рост морфогенного каллуса осуществлялся преимущественно за счет воспроизведения ПЭКК (разрыхление ПЭКК-» образование мягкого каллуса-» новое возникновение ПЭКК), т.е. деления клеток (Румянцева и др., 1992).
Наши исследования показали, что содержание белков в морфогенном каллусе выше, чем в неморфогенном (рис. 4) в несколько раз и это соотношение изменялось в ходе пассажа. В среднем за пассаж содержание растворимых белков в неморфогенном каллусе (1.9 мг/г сырого веса) было в 6 раз меньше, чем в морфогенном (11.2 мг/г сырого веса). Показано, что в морфогенных каллусах других видов растений также содержится больше белков, чем в неморфогенных, например, в морфогенной каллусной культуре кофе (Yuffa et al., 1994) и риса (Chen, Luthe, 1987) содержание белков в 2 раза выше, чем в неморфогенной. Содержание белков в каллусах пшеницы с различным морфогенным потенциалом отличалось почти в 10 раз (Rajyalakshmi et al., 1991; Озолина и др., 1995). По-видимому, морфогенный каллус характеризуется большей метаболической активностью и более интенсивным синтезом белков, необходимым для сохранения эмбриогенного потенциала.
Следует отметить, что динамика содержания растворимых белков в ходе пассажа была разной в двух исследуемых типах каллусов. Содержание растворимых белков в неморфогенном каллусе незначительно изменялось в ходе пассажа (рис. 4). В морфогенном каллусе выявлено существенное повышение содержания растворимых белков на 9 и 18-21 сут и снижение на 15 сут культивирования, что, вероятно, связано с цикличностью образования ПЭКК.
Одним из подходов к изучению механизмов морфогенеза является изучение качественного и количественного состава белков культур с различной морфогенной способностью. Проведен сравнительный анализ полипептидных спектров морфогенных и неморфогенных культур моркови (Sung, Okimoto, 1981, Tan, Kamada, 2000), ячменя (Stirn et al., 1995), пшеницы (Rajyalakshmi et al., 1991), риса (Chen, Luthe, 1987), люцерны (Giroux, Pauls, 1996), гороха (Stirn, Jacobsen, 1987), березы (Hvoslef-Eide, Corke, 1997), шпината (Ishizaki et al., 2002) и др. На основании выявленных различий между двумя типами каллусов исследователями обнаружены белки-маркеры, ответственные за прохождение отдельных этапов морфогенеза.
С помощью электрофоретического разделения растворимых белков морфогенной (23-9) и неморфогенной (ЗЭ ) линий каллуса гречихи, нами было обнаружено 80 полос с молекулярной массой от 12 до 90 кДа (рис. 5). Экстракция белков проводилась на 12 день пассажа.
Наибольший интерес вызывает появление специфических полипептидов, образование которых связывают с проявлением регенерационной способности (Sung, Okimoto, 1981; Chen, Luthe, 1987; Stirn, Jacobsen, 1987; Yuffa et al, 1994; Stirn et al., 1995). Нам удалось обнаружить ряд полипептидов 19, 23, 28, 35, 39, 68, 73 кДа, характерных только для морфогенного типа каллуса и 16, 22, 33, 37, 53, 62 кДа - для неморфогенного каллуса.
