Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1 .Система окислительного гомеостаза у растений 10
1.2. Салициловая кислота и ее роль в регуляции физиологических процессов в растениях
2. Объекты и методы исследований 52
2.1 .Объект исследований и постановка опытов 52
2.2.Методики анализов 53
2.2.1. Получение общеклеточной суспензии 53
2.2.2. Выделение хлоропластов 53
2.2.3. Определение содержания диеновых коньюгатов 54
2.2.4 Определение содержания малонового диальдегида 54
2.2.5. Определение содержания шиффовых оснований 55
2.2.6. Определение активности супероксиддисмутазы 56
2.2.7. Определение активности каталазы 57
2.2.8. Метод спонтанной биохемилюминесценции 57
2.2.9. Определение содержания белка 58
2.2.10. Определение уровня общих липидов 58
2.2.11. Статистическая обработка данных 59
3. Результаты и их обсуждение 60
3.1.Особенности влияния салициловой кислоты на про-антиоксидантный статус клеток и хлоропластов растений гороха при использовании разных концентраций и продолжительности введения салицилата 60
3.1.1. Изменение про- антиоксидантного статуса клеток гороха при разных концентрациях и продолжительности обработки растений салициловой кислотой 60
3.1.2.Изменение про- и антиоксидантного статуса хлоропластов гороха при продолжительной обработке растений салициловой кислотой 75
3.2.Изменения в развитии реакций перекисного окисления липидов и антиоксидантнои системе клеток и хлоропластов гороха при тепловом шоке после продолжительной обработки салициловой кислотой 80
3.2.1. Про- и антиоксидантний статус клеток гороха при тепловом шоке после продолжительной обработки салицилатом 80
3.2.2.Изменения в развитии реакций перекисного окисления липидов и антиоксидантнои системе в хлоропластах растений гороха при тепловом шоке после продолжительной обработки салицилатом 86
Заключение 91
Выводы 92
Список литературы 93
- Салициловая кислота и ее роль в регуляции физиологических процессов в растениях
- Определение содержания малонового диальдегида
- Изменение про- антиоксидантного статуса клеток гороха при разных концентрациях и продолжительности обработки растений салициловой кислотой
- Про- и антиоксидантний статус клеток гороха при тепловом шоке после продолжительной обработки салицилатом
Введение к работе
Актуальность проблемы. Активация процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран, вызванная усиленной генерацией активных форм кислорода (АФК), является одним из наиболее ранних эффектов, происходящих у растений при воздействии различных стрессовых факторов, в том числе и теплового шока (Курганова и др., 1997; Dat et al., 1998(2); Курганова и др., 1999; Zhou, Leul, 1999). Повышение уровня ПОЛ приводит к серьезным повреждениям мембран, вызывая существенные нарушения их структуры и функций (Браун, Моженок, 1987; Барабой и др., 1992). Начальным этапом в развитии ПОЛ является интенсификация генерации АФК (Зенков, Меньшикова, 1993; Halliwell, Gutteridge, 1986). В клетках растений, образование АФК наиболее интенсивно идет в хлоропластах (Мерзляк, 1989). Этим обусловлена высокая степень выраженности в этих органоидах общих изменений в состоянии про- антиоксидантного равновесия в клетке при тех или иных внешних воздействиях.
При неблагоприятных условиях окружающей среды для сдерживания окислительных процессов необходимо быстрое включение антиоксидантных (АО) ресурсов. Обнаружено, что активность АО-системы может увеличиваться при действии стрессоров самой различной природы, что предупреждает окислительные изменения мембран и предотвращает гибель клеток (Rao et al., 1996; Kubo et al., 1999). Устойчивость растений к внешним воздействиям в значительной степени определяется соотношением уровня ПОЛ и активности антиоксидантной системы.
Особое внимание исследователей к салициловой кислоте (СК) связано с обнаружением ее ключевой роли в индукции системной приобретенной устойчивости растений к инфицированию фитопатогенами. Однако не вызывает сомнения факт участия СК в развитии защитных реакций в растениях в ответ на неблагоприятные факторы среды не только биотической, но и абиотической природы (Шакирова, 2000; Шакирова, 2001).
Показано, что салициловая кислота может изменять уровень ПОЛ. Большое количество данных свидетельствует о том, что СК стимулирует образование АФК и развитие ПОЛ (Вовчук и др., 1997, Conrath et al., 1995). Одновременно предполагается важная роль салицилата и в сдерживании окислительных процессов, связанных с защитными реакциями растений (Тарчевский и др., 1999).
Однако следует отметить, что в литературе практически отсутствуют сведения о роли влияния СК на про- антиоксидантный статус клеток в изменении чувствительности растений к действию неблагоприятных факторов среды.
В связи с этим представляется актуальным исследование влияния салицилата на интенсивность перекисного окисления и активность АО-системы при предадаптации растений к последующей гипертермии.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в исследовании влияния салициловой кислоты на уровень перекисного окисления липидов и активность антиоксидантной системы растений гороха, выявлении значения вызванных салицилатом изменений в перекисном гомеостазе для развития ответной реакции на последующую гипертермию. Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи: 1. Исследовать влияние экзогенной салициловой кислоты на перекисный гомеостаз клеток гороха при кратковременной (до 120 мин) обработке проростков салицилатом.
2. Исследовать изменения уровня перекисного окисления липидов и активности антиоксидантнои системы клеток и хлоропластов гороха при длительном (7 суток) воздействии экзогенной салициловой кислоты на растения.
3. Сравнить влияние салицилата в двух концентрациях (100 и 500 мкМ) на перекисный гомеостаз растений гороха.
4. Исследовать влияние предобработки СК на ответную реакцию про-антиоксидантной системы растений гороха при последующем действии гипертермии.
Научная новизна. Впервые показано, что кратковременная обработка растений гороха 100 и 500 мкМ салициловой кислотой вызывает изменения в перекисном гомеостазе клеток, причем 500 мкМ салицилат оказывает более ярко выраженное действие.
Получены новые данные, позволяющие оценить соотношение изменений перекисного гомеостаза под влиянием длительной обработки салициловой кислотой в клетках и хлоропластах гороха.
Установлено, что выращивание растений гороха на среде, содержащей 500 мкМ салициловую кислоту, приводит к снижению уровня перекисного окисления и активации системы антиоксидантнои защиты.
Впервые показано, что предобработка 500 мкМ салицилатом растений гороха в течение 7 суток приводит к предадаптации проростков к последующему тепловому шоку. Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты важны для понимания механизмов участия салициловой кислоты в развитии защитных реакций в растениях в ответ на неблагоприятные факторы среды абиотической природы, в частности высокой температуры. Знания биохимических изменений, вовлеченных в растительные стрессовые ответы, могут быть использованы для выведения растений с повышенной устойчивостью к абиотическому стрессу. Основные выводы и результаты работы могут быть использованы в учебном процессе на биологических факультетах университетов при чтении спецкурсов и включены в соответствующие разделы лекций общего курса по физиологии растений.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены на 9-й и 10-й Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005, 2006), на X и XI нижегородских сессиях молодых ученых (Нижний Новгород, 2005, 2006), на IV Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений», (Минск, 2005), на I (IX) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2006), на Втором Международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), на конференции «Физиология растений -фундаментальная основа современной фитобиотехнологии» (Ростов-на-Дону, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (147 работ, в том числе 95 иностранных). Работа изложена на 110 страницах, содержит 13 рисунков и 3 таблицы.
Салициловая кислота и ее роль в регуляции физиологических процессов в растениях
Увеличивается интерес к такому производному кислорода как NO, который, взаимодействуя с 02 , образует крайне токсичный продукт - пероксинитрил (ONOO") (Koppenol, 1998; Тарчевский, 2000, Corpas et al., 2001) и действует совместно с Н202 (Bowler, Fluhr, 2000). NO образуется в результате реакции, катализируемой NO-синтазой, при участии аргинина, НАДФН и 02 (Тарчевский, 2000), а также в анаэробных условиях в результате работы ксантиноксидазы (Godber et al., 2000). NO, с одной стороны, проявляет токсические свойства АФК, а с другой - взаимодействуя с кислород-производными радикалами органических соединений, способен оказывать протекторное действие (Тарчевский, 2002). В клетке, в разных ее компартментах, постоянно протекают окислительно-восстановительные процессы, способные приводить к появлению АФК. Наиболее интенсивно генерация АФК идет на сопрягающих мембранах хлоропластов и митохондрий. Также АФК образуются на плазмалемме, в пероксисомах, микросомах, ядре, клеточной стенке, в экзоцеллюлярном пространстве (Аверьянов, 1991). 02 является одним из основных первичных продуктов восстановления кислорода в хлоропластах, где он образуется за счет переноса электронов на 02 при работе фотосинтетической электронотранспортной цепи (Foyer et al., 1994; Alscher et al.,1997). Перенос электронов за счет этой реакции составляет 10-30% от общего транспорта электронов по ФЭТЦ в хлоропластах.
В фотосистеме I образование 02 и Н202 может происходить при взаимодействии кислорода с FeS-центрами на акцепторной стороне фотосистемы. Предполагается, что аналогичные процессы возможны также и внутри мембраны при окислении первичных акцепторов (Иванов и др., 1997). В фотосистеме II существует несколько участков образования АФК: при восстановлении 02 через посредство феофитина и пластохинона (Casano et al., 2000), на уровне Р-680 (Corpas et al., 2001) и кислород-выделяющего комплекса. Показано, что если фотосистема I генерирует главным образом только 0"2 , то фотосистема II - как 02 , так и Н202 (Tjus et al., 2001). Нарушение работы фотосистемы I, приводящее к усилениию генерации 02 составляет основу токсического действия на растения гербицида параквата (Asada, Takahashi, 1987). Хлоропласты являются также активными продуцентами синглетного кислорода. Основной путь его образования в хлоропластах - это взаимодействие 02 с возбужденной триплетной молекулой хлорофилла. Мономерные формы хлорофилла а695 - наиболее эффективные генераторы 02. Существенный вклад в процесс образования синглетного кислорода вносят вновь синтезированные молекулы пигмента в центрах биосинтеза хлорофилла. Продукция АФК в хлоропластах существенно зависит от интенсивности освещения и степени восстановленности ЭТЦ. При повышении уровня освещения процент сброса энергии и электронов на кислород увеличивается (Шаркова, 1994). Образование АФК в хлоропластах идет и в темновых реакциях фотосинтеза. Предполагается, что непосредственными переносчиками электронов на 02 являются ферредоксин-зависимые редуктазы стромы -нитритредуктаза и монодегидроаскорбатредуктаза (Corpas et al., 2001). Возможно, АФК образуются также при работе рубиско (Мерзляк, 1989). В митохондриях основной формой продуцируемых АФК является 0"2 , образующийся при работе дыхательной цепи переноса электронов (Скулачев, 1998). Известно, что около 98% кислорода, потребляемого митохондриями, превращаются в воду, в то время как оставшиеся 2% дают 0 " (Скулачев, 1998).
Супероксидный анион - радикал продуцируется на двух участках электронотранспортной цепи митохондрий в результате утечки электронов на уровне комплекса I и в окислительно-восстановительных реакциях, идущих при участии убихинона (Corpas et al., 2001). Возможными источниками генерации АФК на плазмалемме могут служить несколько различных систем. Прежде всего, это НАД-Н-зависимая пероксидаза, ассоциированная с наружной поверхностью мембраны, способная окислять НАД-Н с образованием супероксидного анион-радикала (Mehdy, 1994). С плазмалеммой ассоциирована НАДФН-оксидаза, переносящая электроны от цитоплазматического НАДФ-Н на 02 апопласта (Wojtaszek, 1997, Papadakis et al., 1999). Возможно, перенос электронов от внутриклеточных пиридиннуклеотидов через плазмалемму связан с наличием на мембране электронотранспортной цепи, компонентом которой является флавоцитохром Ь558, составляющий кор НАДФ-Н- оксидазы (Wojtaszek, 1997). Регуляция активности НАДФ-Н-оксидазы осуществляется посредством фосфорилирования- дефосфорилирования. Поэтому продукция АФК на плазмалемме зависит от активности протеинкиназ и протеинфосфатаз, которые соответственно повышают или снижают активность НАДФ-Н-оксидазы (Wojtaszek, 1997). Возможна активация НАДФ-Н -оксидазы ионами Са2+ (Barbier-Brygoo et al., 1997), салициловой кислотой (Dat et al., 1998(1)). Генерация супероксидного анион-радикала НАДФ-Н-оксидазой требует переноса электронов, не сопровождающегося переносом протонов через плазмалемму.
Определение содержания малонового диальдегида
Определение содержания малонового диальдегида (МДА) проводили по методике Стальной и Гаришвили (1977). В основе метода лежит реакция между МДА и тиобарбитуровой кислотой (ТБК), которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного комплекса, содержащего 1 молекулу МДА и 2 молекулы ТБК, с максимумом поглощения при Л=532 нм. К 1 мл суспензии добавляли 1,5 мл воды и 1 мл 0,5% ТБК в 20% ТХУ. Пробирки со смесью помещали на водяную баню, доводили до кипения на 30 минут. После охлаждения пробы отфильтровывали и фильтрат спектрофотометрировали при Л = 532 нм против контроля (вместо суспензии вода). Содержание МДА определяли по формуле: где Д532 - оптическая плотность, Е - коэффициент молярной экстинкции, 1,56-10 моль" см", С - концентрация белка или концентрация общих липидов, мг/мл. Содержание МДА выражали в мкМоль МДА/мг белка или в мкмоль МДА/мг общих липидов. Содержание шиффовых оснований (ШО) определяли спектрофотометрически (Камышников, 2003). Метод основан на том, что образующиеся в ходе ПОЛ шифыфовы основания обладают дополнительным максимумом в спектре поглощения при 440 нм. К 0.2 мл суспензии добавляли 4 мл смеси «гептан -изопропанол» (1:1) и встряхивали 10-15 минут. Далее в пробирку добавляли 1 мл раствора HCI (рН 2.0) и 2 мл гептана, интенсивно встряхивали.
После отстаивания и расслоения смеси на фазы (на что уходит 20-25 минут) отбирали верхний, гептановый, слой, который спектрофотометрировали при Л = 440 нм против контроля (вместо суспензии вода). Содержание ШО выражали в единицах экстинкции (Е440) / мг общих липидов. Активность СОД определяли спектрофотометрически (Чевари и др., 1985). Принцип метода основан на том, что СОД способна конкурировать с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксидные анион-радикалы, образующиеся в результате аэробного взаимодействия восстановленного НАДН с фенозинметасульфатом (ФМС). В результате этой реакции НСТ восстанавливается до гидразинтетразолия. В присутствии СОД процент восстановления НСТ снижается. Реакционная смесь содержала 1,2 мл 0,15 М фосфатного буфера (рН 7,8); 0,1 мл 0,16 мМ ФМС; 0,3 мл 0,61 мМ НСТ; 0,3 мл суспензии. Реакцию запускали 0,2 мл 1 мМ НАДН. Спектрофотометрировали при Л = 540 нм. Активность фермента рассчитывали следующим образом: где Т(%)—процент блокирования; Ео—изменение экстинкции 0 пробы (не содержит суспензии); Епр—изменение экстинкции пробы за 1 минуту. где А — удельная активность фермента; С — концентрация белка, мгмл"1. Активность СОД выражали в мкМоль НСТ/мг белка мин. Активность каталазы определяли по методу Patterson et al. (1984), основанному на способности каталазы разлагать Н202 с образованием Н20. Активность фермента определяли по снижению количества пероксида водорода в пробе, определяемого по снижению экстинкции пробы. Реакционная смесь содержала 1,9 мл 0,05 М калий-фосфатного буфера (рН 8,0) и 0,1 мл исследуемой суспензии. Реакцию запускали добавлением 1мл 30 мМ Н202. Активность каталазы рассчитывали по формуле: где Еч и Е2-молярные экстинкции пробы после внесения пероксида и через 20 секунд; 43,6 М-1, сек-1- коэффициент молярной экстинкции Н202; С - концентрация белка (мг/мл); Т-время, мин.
Активность фермента выражали в мкМ Н202/ мг белка мин. Хемилюминесценция индуцируется пероксидом водорода с сульфатом железа. В представленной системе происходит каталитическое разложение перекиси ионами металла с переходной валентностью - двухвалентным железом по реакции Фентона. Образующиеся при этом свободные радикалы вступают в процесс инициирования свободнорадикального окисления. На последней стадии свободнорадикального окисления при рекомбинации радикалов происходит образование неустойчивого тетроксида, распадающегося с выделением кванта света.
Изменение про- антиоксидантного статуса клеток гороха при разных концентрациях и продолжительности обработки растений салициловой кислотой
Сейчас уже не вызывает сомнения факт участия СК в развитии защитных реакций в растениях в ответ на неблагоприятные факторы среды не только биотической, но и абиотической природы (Mishra, Choudhuri,1999; Шакирова, 2000, 2001). Среди комплекса изменений, происходящих у растений при воздействии различных стрессовых факторов, в том числе и гипертермии, одним из наиболее ранних эффектов является активация процесса перешеного окисления липидов мембран, вызванная усиленной генерацией АФК. Показано, что салициловая кислота может изменять уровень ПОЛ. В литературе встречаются крайне противоречивые сведения о влиянии салициловой кислоты на процесс перекисного окисления липидов: рассматриваются как ее анти- так и прооксидантное действие (Вовчук и др., 1997; Conrath et al., 1995; Тарчевский и др., 1999). При этом разными авторами используются разные концентрации и способы обработки растений СК, например, обработка листьев СК в концентрации 0.1 - 5 мМ в течение 8 часов при комнатной температуре (Rao et al., 1997), обработка листьев 100 мкМ СК в течение 1 - 6 часов (Dat et al., 1998(1)), обработка листьев СК в концентрациях 1мкМ - 1 мМ в течение 1.5 часов, выращивание проростков на среде, содержащей 0,05 - 5 мМ СК в течение 7 (Senaratna et al., 2000) или 10 дней (Mishra, Choudhuri, 1999). Однако показано, что в инфицированной ткани содержится ЮОмкМ СК (Durner, Klessig, 1996; Ryals et al., 1996), а в отдаленных тканях в 10 -20 раз меньше (Ryals et al., 1996). В литературе чаще встречаются работы, в которых разные растения инкубируют с СК в течение длительных промежутков времени от нескольких часов до нескольких суток. Известно, что генерация активных форм кислорода - это очень быстрый физико-химический процесс, длящийся порядка микро- и миллисекунд (Зенков, Меньшикова, 1993). Следовательно и смещение прооксидантно-антиоксидантного равновесия в мембранах живых организмов развивается довольно быстро, сравнимо со временем избыточной генерации АФК. Однако при экзогенном введении салицилата возможно требуется достаточное время для передвижения СК по растению и для последующего развития изменений в про- антиоксидантнои системе клеток растений. В связи с этим нами исследовалось влияние СК на ПОЛ клеток гороха как при кратковременной (15, 60 и 120 минут) обработке листьев физиологической концентрацией СК 100 мкМ и более высокой концентрацией - 500 мкМ, так и при длительной (7 суток) обработке растений 500 мкМ салицилатом.
Для исследования действия СК при коротких экспозициях листья проростков гороха обрабатывали 100 и 500 мкМ СК в течение 15, 60 и 120 минут. После этого оценивали уровень ПОЛ в клетках растений гороха, определяя потенциальную способность клеток к образованию свободных радикалов по биохемилюминисценции и содержание основных продуктов ПОЛ - ДК и МДА. Прямая зависимость между интенсивностью ПОЛ и накоплением перечисленных выше соединений является хорошо установленным фактом (Владимиров, Арчаков, 1972). Одновременно оценивали и интенсивность АО-защиты, определяя суммарную АО-активность клеток гороха по биохемилюминисценции и активность главных АО-ферментов - СОД и каталазы.
Полученные данные свидетельствуют о том, что при обработке листьев растений 100 и 500 мкМ СК в течение 15 минут, потенциальная способность клеток гороха к образованию свободных радикалов в растениях, обработанных СК в обеих концентрациях, была ниже по сравнению с контрольными, необработанными СК (рис. 3,а).
Одними из наиболее ранних продуктов ПОЛ являются ДК. Содержание ДК в клетках гороха при обработке листьев 100 и 500 мкМ СК снижалось в опытных растениях, по сравнению с контрольными, сопоставимо с общей способностью клетки к образованию свободных радикалов (рис. 3, б). Однако, содержание вторичного продукта ПОЛ -МДА, наоборот увеличивалось в опытных образцах в такой же степени, как снижалось содержание ДК (рис. 3, в). Это может объясняться тем, что первичные продукты ПОЛ - ДК, к 15 минутам обработки салицилатом уже превратились в более поздний продукт -МДА.
Поддержание уровня липопероксидации в безопасных для клетки пределах осуществляется многокомпонентной системой АО-защиты, включающей в себя как ферменты, так и низкомолекулярные соединения. В обсуждаемых экспериментах оценивали суммарную АО-активность клетки растений гороха по биохемилюминисценции. В проведенных экспериментах наблюдали небольшое повышение активности АО-системы в растениях, обработанных СК, по сравнению с контрольной группой, причем эффект от меньшей концентрации был более ярко выражен (рис. 4).
Таким образом, обработка листьев гороха 100 и 500 мкМ СК в течение 15 минут в целом дала близкие результаты. Обе концентрации СК немного снижали потенциальную способность клетки к свободнорадикальному окислению и образование начальных продуктов ПОЛ - ДК, увеличивая, в свою очередь, содержание более позднего продукта ПОЛ - МДА. Одновременно обработка СК в обеих концентрациях способствовала усилению суммарной АО-активности клеток гороха.
Про- и антиоксидантний статус клеток гороха при тепловом шоке после продолжительной обработки салицилатом
Доказано, что СК участвует в развитии ответной реакции растений на воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды самой различной природы. Известно, что СК накапливается во время экспозиции с озоном или УФ светом (Yalpani et al., 1994), а предобработка листьев СК может защитить их от окислительного стресса, вызванного паракватом (Strobe!, Кис, 1995). В литературе показано, что ткани из микрорастений картофеля, выращенные на ацетилсалициловой кислоте, имеют повышенную термоустойчивость (Doke et al., 1994; Prasad et a!., 1994; Foyer et al., 1997). Высокая температура - один из главных абиотических стрессов, лимитирующих урожай растений и распространение во многих районах мира.
В связи с этим, представлялось интересным исследовать, будет ли наблюдаться предадаптация растений к последующему тепловому шоку, при выращивании проростков гороха на среде, содержащей 500 мкМ СК в течение 7 суток. Для этого обработанные СК на протяжении длительного времени проростки гороха подвергали действию высокой температуры (42С) в течение 30, 60 и 120 минут. Уровень ПОЛ оценивали по трем показателям - потенциальной способности клеток к образованию свободных радикалов, содержанию начальных продуктов ПОЛ - ДК и содержанию промежуточного продукта ПОЛ -МДА. Антиоксидантный статус клетки оценивали по суммарной АО-активности клетки, а также по активности двух АО-ферментов - СОД и каталазы.
Обнаружено, что потенциальная способность клеток гороха, предобработанного 500 мкМ СК, к образованию свободных радикалов, до начала действия высокой температуры не различалась у опытных и контрольных растений. После начала действия стрессирующего фактора в контрольных растениях данный показатель поддерживался на постоянном уровне, а в обработанных СК снижался по сравнению с контрольной группой (рис. 10, а). Установлено, что содержание ДК и МДА изменялось незначительно независимо от длительности теплового шока, но было ниже в растениях, выращенных на салициловой кислоте (рис. 10, б, в).
Генерирование АФК, особенно Н202, во время абиотического стресса, было предложено рассматривать как часть сигнального каскада, ведущего к защите от этих стрессов и способствующего активации работы антиоксидантов (Doke et al., 1994; Prasad et al., 1994; Foyer etal.,. 1997). В наших экспериментах суммарная активность АО-системы до начала действия ТШ была выше в контрольной группе растений, у которой поддерживалась на этом уровне на протяжении всего времени действия стрессирующего фактора. В растениях, выращенных на СК, наблюдалось повышение активности АО -системы к 30 минутам действия ТШ, а затем постепенное снижение к 120 минутам влияния высокой температуры (рис. 11, а). Одновременно оценивали активность антиоксидантных ферментов -СОД и каталазы. В нашей работе в растениях, выращенных на СК, уровень СОД достигал высокого уровня еще до начала действия стрессирующего фактора и поддерживался на этом уровне на протяжении всего времени действия ТШ (рис. 11,6). Известно, что эксперессия генов СОД может активироваться салицилатом (Scandalios, 1997) и в ответ на действие стрессирующих факторов (Matters, Scandalios, 1998; Bowler et al., 1989; Zhu, Scandalios, 1994). Но последнее происходит уже после начала влияния высокой температуры, тогда как обработка СК, вероятно, способствует предварительной подготовке АО-системы клеток гороха к последующему воздействию стресса.
Что касается другого АО-фремента - каталазы, то ее активность практически не изменялась в контрольных и опытных растениях на протяжении всего времени действия гипертермии (рис. 11, в).
В результате проведенных экспериментов наблюдали соответствие между интегральными показателями интенсивности ПОЛ и активности АО-системы (рис. 10, а, 11, а). Так до начала действия стрессового фактора общая АО-активность растений, обработанных СК была ниже контрольных значений. Но уже к 30 минутам действия высокой температуры суммарная АО-активность клеток под влиянием СК увеличивалась. Одновременно наблюдалось значительное снижение потенциальной способности клеток к образованию свободных радикалов под влиянием СК к 30 минутам действия гипертермии. К 60 и 120 минутам влияния ТШ способность к образованию свободных радикалов увеличивалась, а АО-активность уменьшалась примерно в равной степени.
Интенсивность липопероксидации, оцениваемая по содержанию продуктов ПОЛ, было явно ниже в растениях, обработанных СК (рис. 10, б, в). Можно предположить, что это объясняется тем, что салицилат активировал работу АО-системы еще до начала действия гипертермии (рис. 11,6).
Ключевым компонентом системы антиоксидантной защиты является СОД. К настоящему времени показана активация СОД при воздействии на растения засухи, параквата, этилена, салициловой кислоты, фитопатогенов и др. (Matters, Scandalios, 1998; Bowler et al., 1989; Zhu, Scandalios, 1994; Scandalios, 1997). Индукция СОД при тепловом шоке обнаружена в клетках животных и у бактерий (Privalle, Fridovich, 1987), но эксперименты с растениями давали неоднозначные результаты (Scandalios, 1990).
В нашей работе в растениях, выращенных на СК, уровень СОД сразу достигал высокого уровня и поддерживался на этом уровне на протяжении всего времени действия ТШ. В литературе встречаются данные о том, что СК инициирует синтез одной из субъединиц СОД и тем самым усиливает ее работу, что очень важно при последующем действии неблагоприятных факторов окружающей среды (Rao, 1997). Степень развития стрессового ответа зависит от исходного уровня ПОЛ и буферной емкости антиоксидантных систем (Мерзляк, 1989; Барабой, 1991; Лукаткин, Левина, 1997). При исходно более низком уровне пероксидации, что в наших экспериментах можно наблюдать в растениях, выращенных на 500 мкМ СК, стрессор той же силы и длительности вызывает колебания уровня ПОЛ, АО- защиты и общей резистентности организма значительно меньшей амплитуды, медленнее развивающиеся и, следовательно, вызывает более позднее наступление истощения ресурсов клетки.
