Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Особенности распространения и экологии цианобактерий и актиномицетов в природе 8
1.1. Участие цианобактерий и актиномицетов в почвообразовании 9
1.2. Симбиотические взаимоотношения цианобактерий и актиномицетов с микро- и макроорганизмами 11
I.2.1. Цианобактерии в симбиотических взаимоотношениях с другими организмами 13
I.2.2 Взаимодействие актиномицетов с различными организмами 21
Глава II. Геологическая деятельность микроорганизмов 27
11.1. Микробная трансформация и деструкция минералов и горных пород 27
11.2. Эксперименты по биогенной трансформации силикатных минералов 30
11.3. Теоретические подходы к изучению биогенного выветривания минералов 34
11.4. Прямое и косвенное влияние микроорганизмов на процессы выветривания минералов 37
II.6. Бuогенное минералообразование 41
Экспериментальная часть 43
ГлаваIII. Объекты и методы исследования 43
111.1. Объекты исследования .43
111.2. Методы исследования 43
Глава IV. Результаты и обсуждение .49
IV.1. Идентификация исследуемых актиномицетов 49
IV. 2. Конструирование экспериментальных ассоциативных талломов 49
IV.3 Ультраструктурные изменения актиномицетов и цианобактерии в экспериментальном ассоциативном талломе 53
IV.4. Изменения физиологических свойств цианобактерии и актиномицетов при формировании ассоциативного таллома 56
IV. 5. Преобразование структуры глинистых минералов под влиянием экспериментальных цианобактериально-актиномицетных ассоциаций 63
Обсуждение результатов 79
Выводы .88
Список литературы 91
- Симбиотические взаимоотношения цианобактерий и актиномицетов с микро- и макроорганизмами
- Взаимодействие актиномицетов с различными организмами
- Прямое и косвенное влияние микроорганизмов на процессы выветривания минералов
- Ультраструктурные изменения актиномицетов и цианобактерии в экспериментальном ассоциативном талломе
Введение к работе
Актуальность темы.
К настоящему времени накоплен огромный материал о существовании удивительного разнообразия типов взаимодействия организмов в природе, многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что симбиотические системы представляют собой одну из основных форм существования организмов в биосфере (Бухарин и др., 2011).
Повсеместное развитие цианобактериальных сообществ, компонентный состав которых представлен разнообразными бактериями, в том числе актиномицетами, определяет исключительное значение этих организмов в формировании и устойчивом развитии биосферы (Заварзин, Колотилова, 2001). Являясь первопоселенцами на выветриваемых скальных породах, цианобактериальные сообщества принимают активное участие во многих биохимических процессах (накоплении органического вещества, его минерализации, разрушении минеральных субстратов, выщелачивании и распределении различных элементов), способствуя тем самым изменению субстрата, ведущее к формированию почвы. Результатом трансформации, разрушения и перемещения глинистых материалов под влиянием микроорганизмов является изменение порозности, водопроницаемости, катионообменной способности почв, что определяет формирование почвенного профиля.
Однако вследствие того, что изучение взаимодействия микроорганизмов в природных сообществах затруднено, исследование взаимного влияния отдельных компонентов сообщества возможно путем создания модельных ассоциаций, в которых подбираются и изучаются различные пары микроорганизмов.
Цель работы: выявление структурно-функциональных особенностей цианобактерий и актиномицетов - компонентов экспериментально сформированных талломов и исследование роли цианобактериально-актиномицетных ассоциаций в кристаллохимической перестройке решетки глинистых минералов.
Задачи исследования:
-
Формирование экспериментальных ассоциативных талломов при совместном культивировании цианобактерий и актиномицетов.
-
Сравнительное исследование ультраструктурных особенностей актиномицетов и цианобактерий в ассоциативном талломе и в монокультурах.
-
Изучение экофизиологических и функциональных проявлений цианобактерий и актиномицетов в ассоциации и монокультурах.
-
Исследование биодеградационного влияния цианобактериально-актиномицетных ассоциативных талломов на кристаллохимическое состояние решетки глинистых минералов группы каолинита, монтмориллонита, слюд (ди- и триэктаэдрических) и вермикулита.
Научная новизна.
Впервые в сформированных ассоциативных цианобактериально-актиномицетных талломах установлено присутствие протонов «свободной» (доступной) воды. Выявлено сохранение жизнеспособности клеток цианобактерии в ассоциативном талломе при экстремально низком давлении влаги (-96,4 МПа, aw=0,50). Впервые обнаружено образование L-подобных форм актиномицетов в экспериментальном цианобактериально-актиномицетном талломе и при отсутствии подобных клеточных структур в монокультурах актиномицетов. В экспериментальных цианобактериально-актиномицетных ассоциациях установлены ультраструктурные и физиологические изменения в клетках цианобактерии, что выражается в появлении клеток с частично нарушенной клеточной стенкой и нарушения процесса фотосинтеза. Выявлено расширение спектра и усиление антибиотической активности экспериментального таллома по сравнению с монокультурами актиномицетов и цианобактерии.
Зарегистрировано биодеградационное изменение кристаллической решетки глинистых минералов с выносом части элементов минерального питания (К, Mg, А1) под влиянием развития модельных цианобактериально-актиномицетных ассоциаций. Выявлено, что интенсивность процесса зависит от кристаллохимических особенностей минералов и от компонентного состава ассоциации. Впервые зафиксировано трансформирующее влияние цианобактериально-актиномицетного таллома на структурное состояние минералов различной размерности.
Практическая значимость.
Практическая значимость проведенных исследований заключается в возможности использования новых сведений об экологии актиномицетов и цианобактерии для создания устойчивых симбиотических цианобактериально-актиномицетных ассоциаций с широким спектром антибиотической активности. Последние могут быть использованы в агробиотехнологиях создания микробных препаратов, подавляющих патогенную микрофлору и ускоряющих рост и развитие растений. Цианобактериально-актиномицетные ассоциации могут также найти применение в разработке технологии биоремедиации загрязненных почв и рекультивации нарушенных почвенных комплексов. Экспериментальное моделирование взаимодействий цианобактериально-актиномицетных талломов с минеральным субстратом используется при раскрытии механизмов деструкции минералов-индикаторов процессов почвообразования и корообразования. Материалы работы использованы в курсе лекций «Биология почв» и «Строение, развитие, экология актиномицетов для студентов» факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.
Личный вклад автора заключался в участии на всех этапах проведения диссертационной работы, в постановке и проведении экспериментов, получении исходных
данных и их статистической обработке, обсуждении результатов исследований, написании статей.
Публикации.
По результатам исследования опубликовано 25 печатных работ, из них 5 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации результатов диссертационных работ.
Апробация работы.
Основные положения работы были доложены на XV и XVI Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), на V Всероссийском съезде Общества почвоведов (Ростов-на-Дону, 2008), на V и VI молодежных школах-конференциях с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009, Москва, 2010), на 1st Workshop on Plant Molecular, the Biotechnology summer school (Гданьск, Польша, 2009), на The joint 5l Postgraduate Course and Minisymposium of AB-RMS (Миккели, Финляндия, 2010), на заседании в Центральном доме ученых «Минералы и наше здоровье» (Москва, 2010), на XV международной школе-конференции «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2011), на международной конференции «Микробиология в решении современных проблем сельскохозяйственного производства» (Санкт-Петербург, 2011), на международном симпозиуме «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011), на IV международном симпозиуме «Биокосные взаимодействия в природных и антропогенных системах» (Санкт-Петербург, 2011), в международной школе-конференции и симпозиуме «Soil biodiversity and life: the contribution of soil to sustainability of life» (Вагенинген, Нидерланды, 2012).
Объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, экспериментальной части (объекты и методы исследования, результаты и обсуждение), выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 111 страницах текста, содержат 14 рисунков и 3 таблицы. Список литературы включает 198 источников, в том числе 112 на иностранном языке.
Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям -профессору кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова, д.б.н. Г.М. Зеновой и профессору кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, д.б.н. Е.С. Лобаковой; ведущему научному сотруднику института почвоведения имени В.В. Докучаева, д.с.-х.н. Н.П. Чижиковой; заведующему кафедрой биологии почв, чл.-корр. РАН И.Ю. Чернову и всем сотрудникам кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова; ведущему научному сотруднику кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, д.б.н. И.О. Селях; старшему научному сотруднику Института физико-химической биологии имени
А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова, к.б.н. Е.О. Омаровой; сотрудникам кафедры биофизики биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Симбиотические взаимоотношения цианобактерий и актиномицетов с микро- и макроорганизмами
Цианобактерии и актиномицеты способны вступать во взаимоотношения с широким кругом организмов, в том числе между собой (Socha et al, 2006), и при этом формировать различные ассоциации в природных и экспериментальных условиях (Звягинцев, Зенова, 2001; Лобакова и др., 2001). Известно формирование симбиотических ассоциаций актиномицетов с другими микроорганизмами (Калакуцкий, Агре, 1977), животными (Бызов и др., 1993; Poulsen et al, 2005), зелеными водорослями (актинолишайники) (Звягинцев, Зенова, 2001), растениями (Coombs, Franco, 2003). Изучение взаимного влияния актиномицетов и их организмов-партнеров в ассоциациях показало, что актиномицеты в условиях формирования ассоциации могут вступать в положительные симбиотические взаимоотношения и при этом менять свою морфологию, функциональную активность и т.д. (Kalakoutskii at al, 1990; Звягинцев, Зенова, 2001).
Широко известно формирование симбиозов цианобактерий с другими организмами – с грибами (лишайники), с диатомовыми водорослями, губками или асцидиями (Cyanobacteria in symbiosis, 2002; Thacker et al, 2012). В последнее время внимание исследователей привлекают симбиозы цианобактерий с растениями (синцианозы), в роли макропартнера в таких симбиозах выступают мхи-печеночники и роголистники, водные папоротники рода Azolla, голосеменные порядка Cycadales, и покрытосеменные рода Gunnera (Rai et al, 2000; Bergman, Osborne, 2002). Симбиотические взаимоотношения в природе. Ассоциативный симбиоз.
Непрерывность существования жизни на Земле определяется способностью организмов к формированию симбиозов, являющихся скорее правилом, нежели исключением для различных биоценозов (Osborne, Bergman, 2002). В литературе понятие «симбиоз» употребляется чаще всего как синоним термина «мутуализм», что подразумевает существование длительного пространственного контакта между симбионтами и образование особых симбиотических морфологических структур – резервуаров – клубеньков, полостей, в которых происходит размножение, накопление микросимбионтов, где они выполняют свою основную метаболическую функцию (Проворов, 2001; Douglas, 1994). C экологической точки зрения к симбиотическому взаимодействию можно также отнести протокооперацию (взаимовыгодное сожительство организмов) и комменсализм (взаимодействие, при котором один из видов получает какую-либо пользу, не принося при этом другому ни вреда, ни пользы). Однако в природе в симбиозах реализуются все возможные типы взаимоотношений компонентов, и какой из них превалирует на данном этапе – лишь вопрос времени (Rai, 1990; Douglas, 1994). Показано также, что некоторые компоненты мутуалистического симбиоза могут проявлять и черты паразитического взаимодействия (Cafaro, Curre, 2005; Poulsen et al, 2005). Основной причиной сложности в применении термина “симбиоз” является трудность в определении пользы или вреда, реализуемого компонентами по отношению друг к другу. Одним из возможных критериев симбиотического характера взаимодействия может являться появление в симбиозе нового качества (эмерджентности), не характерного для партнеров в свободноживущем состоянии (Савинов, 2011).
В последние годы происходит изменение парадигмы симбиоза. На смену представлениям о нем как о двухкомпонентной системе приходит понимание симбиозов как многокомпонентных систем, в которых, помимо доминантного микросимбионта, участвуют несколько ассоциативных симбионтов (так называемых, минорных микросимбионтов). Ассоциативные микросимбионты, присутствующие, как правило, на всех стадиях развития макросимбионта, играют значительную роль в формировании, стабильном существовании и продуктивности симбиоза в целом (Бухарин и др., 2007).
Ассоциативное взаимодействие характеризуется наличием положительного взаимоотношения между организмами, но не предполагает формирования облигатных и высокоспециализированных связей между партнерами, которые могут относиться при этом к разным царствам (грибы, животные, бактерии, растения) (Проворов, 2001; Douglas, 1994). В связи с этим меняется взгляд на известные и ставшие уже классическими симбиозы растений с бактериями семейства Rhizobiaceae, актиномицетами рода Frankia и микоризными грибами (Добровольская, 2002). Обсуждается также вопрос о трехкомпонентости симбиоза папоротника Azolla с цианобактерией Anabaena azollae и бактериями рода Arthrobacter (Lechno-Yossef, Nierzwicki-Bauer, 2002).
В силу того, что в последнее десятилетие для всех известных растительных симбиозов открыты новые многочисленные сопутствующие микроорганизмы, назрела необходимость в выявлении и понимании роли таких ассоциативных микроорганизмов симбионтов в функционировании симбиоза в целом.
Результаты по исследованию комплексов ассоциативных микросимбионтов с азотфиксирующими цианобактериями (Лобакова, 2006) позволяют утверждать наличие значительного позитивного воздействия ассоциативных симбионтов на развитие растения-хозяина и симбиоз в целом. Присутствие в симбиозе бактериальных ассоциантов способствует: 1) улучшению минерального питания растений – соединениями фосфора, калия и азота (результата ассоциативной азотфиксации) (Mashalha et al., 2000); 2) интенсификации инфицирования хозяина доминантным микросимбионтом посредством локального выделения фитогормонов (цитокининов, гиббереллинов, ауксинов) в местах локализации ассоциативных микросимбионтов и/или синтеза ферментов, разрущающих клеточные стенки растений и обеспечивающих продвижение доминантного микросимбионта вглубь тканей растения-хозяина (Боронин, 1998; Steenhoudt, Vanderleyde, 2000); 3) защиты растения и симбиоза в целом от патогенных микроорганизмов.
Цианобактерии в симбиотических взаимоотношениях с другими организмами Взаимоотношения цианобактерий с гетеротрофными бактериями Доказательством высокой способности цианобактерий вступать в симбиотические отношения с другими организмами может быть тот факт, что сохранить в коллекции аксеничные штаммы цианобактерий очень трудно. Многие цианобактерии до сих пор не удается получить в аксеничном состоянии, например, Gloeothrichia natans и Microcoleus chthonoplastes. У последней была обнаружена облигатная зависимость от Pseudomonas nautica; отсутствие псевдомонады приводило к ингибированию цианобактерии продуктами фотосинтеза, такими как перекись водорода и кислород, т.к. цианобактерии не обладают каталазной активностью (Kevbrin et al., 1994). В природе цианобактерии находятся в биологической системе с гетеротрофными бактериями, заселяющими структурированную слизь, окружающую одиночные клетки и трихомы цианобактерий. Слизистые чехлы на поверхности у некоторых видов переходят в кожистые пленки, называемые перидермом. Исследование слизи у N. сommune показало, что внешние слои ее трансформируются в видимые инвагинации, которые могут быть для бактерий “ловчими мешками”. Наряду с многочисленными функциями (физико-химическая сорбция, участие в хелатинизации, облегчение движения гормогониев, защита от высыхания и избыточной инсоляции, запасание веществ, уменьшение парциального давления кислорода, защита от фагоцитоза и механических повреждений и др.) слизь играет роль “инкубационной камеры” для бактериальных спутников, благоприятной сферой их обитания. Среди бактериальных ассоциантов цианобактерий установлено наличие актиномицетов. Ассоциативные бактерии, входящие в состав цианобактериальных сообществ, выполняют стабилизирующую роль по отношению к автотрофному звену, что выражается в стимуляции роста цианобактерии, а также в интенсификации образования хлорофилла и азотфиксации (Заварзин, Колотилова, 2001; Домрачева, 2005).
Взаимодействие актиномицетов с различными организмами
В настоящее время накоплен обширный материал по взаимодействию микроорганизмов с минеральным субстратом. Показано, что процесс выветривания силикатных пород зачастую сопряжен с синтезом/новообразованием глинистых частиц (Konhauser et al, 1994; Наймарк и др, 2009).
Исследования бактериальных поселений на гранитных или известняковых поверхностях опор мостов в пресных водоемах показали формирование на поверхности биопленок тонкодисперсной примеси, сходной с шамозитом, глауконитом и каолинитом (Konhauser et al, 1994). Показано, что в подземных полостях с пресной водой в аэробных условиях на стенках горных пород в биопленках образовывался гематит, а в анаэробных условиях бактериальные поселения индуцировали формирование тонкодисперсного сидерита (Наймарк, 2009).
В лабораторных экспериментах проанализировано разрушение гранитов в анаэробных условиях под воздействием микробной ассоциации, состоящей из литотрофных и органотрофных микроорганизмов, включающих железо- и сульфатредуцирующие бактерии (Tuck et al., 2006). Бактерии демонстрировали активный рост на раздробленной породе без добавления органических веществ (основой среды служила вода из подземного источника), а в ходе эксперимента было отмечено оплетение частицы породы бактериальными нитями, при этом поверхности клеток были покрыты мельчайшими частичками смектитов и хлоритов. В параллельном эксперименте, в котором динамику всех параметров среды (рН, химический состав, температура) поддерживали идентичной той, что создавалась микроорганизмами в «биотических» экспериментах, растворение гранита шло существенно медленнее, а формирования глинистых частиц не происходило.
Известны результаты экспериментов по разрушению базальтового стекла в морской воде (Alt, Mata, 2000). При поселении бактерий на базальтовом стекле по трещинам и дефектам породы формируются шаровидные структуры упорядоченного строения и размером около 0.4 – 10 мкм и содержащие в себе некоторое количество монтмориллонит-сапонита с примесью слюды. Растворение базальтового стекла и извлечение из него необходимых элементов, предположительно, обусловлено действием органических кислот, продуцируемых бактериями (Alt, Mata, 2000). При этом разрушение базальта сопровождалось высвобождением аморфного кремния. Впоследствии при определенной концентрации ионов Mg2+ и OH- аморфные фазы трансформировались в глинистые минералы.
В опытах по разрушению тефрита (базальтового стекла) цианобактериями Konhauser с соавт. (2002) было обнаружено, что клетки цианобактерии были покрыты частицами аморфного кремния, а также микроскопическими агрегатами Al, Fe и K, прикрепленными к внешнему чехлу клетки. Стехиометрическая организация коагрегатов напоминала смектит. Между цианобактериальной пленкой и минералом регистрировалось присутствие аморфного кремния и твердого кальцита. Механизм данного процесса представляется следующим: цианобактерии активно повышают рН в околоклеточном пространстве, в результате чего происходит выщелачивание из минерального субстрата катионов металлов и кремния. Далее свободные ионы связываются с полисахаридным матриксом и с сидерофорами клеточной стенки, возникающее при этом локальное увеличение концентрации катионов притягивает растворенные ионы кремниевой кислоты (Schultze-Lam, Beveridge, 1994). Таким образом, клеточная стенка цианобактерий выступает в роли центра нуклеации железа и алюмосиликатов.
Показано, что один и тот же минеральный субстрат по-разному изменяется при поселении на нем различных монокультур и ассоциаций микроорганизмов. Так, минералогический состав каолина при инкубации на нем Bacillus mucilagenosus оставался прежним. Однако клетки B.cereus, помещенные на образец каолина, способствовали разрушению слюды за счет адсорбции ионов железа (Styriakova et al., 2003). При выращивании бактериального сообщества (аэробные и анаэробные бактерии, включая железоредукторы) на породе каолина, содержащей около 50 % каолинита, отмечен быстрый вынос ионов железа, формирование пирита, окислов и гидроокислов, а также новообразование тонкодисперсной фракции иллита. При этом снижалась степень упорядоченности каолинита (Турова, 1997; Каравайко, 2004). Подобный результат был получен и в опыте с цеолитом (Styraikova et al., 2003).
Культуры B.stearothermophilus и B.mucilaginosus избирательно растворяют минералы, входящие в состав кимберлита. При действии B.stearothermophilus растворению подвергается главным образом серпентиновый материал, что сопровождается более интенсивным выносом в раствор Mg по сравнению с Са и Si. При росте B.mucilaginosus в раствор выносится в основном Ca и в меньшей мере Mg, в связи с чем регистрируется растворение хлоритов, доломитов и кальцитов (Каравайко, 2004).
В экспериментах с бактериальной ассоциацией цианобактерии Anabaena variabilis и актиномицета Streptomyces rubiginosohelvolus было изучено преобразование образца породы биотитово-вермикулитового состава (Чижикова и др., 2009). Отмечено, что действие бактериальной ассоциации существенно отличается от влияния на минеральный сусбтрат монокультур ее компонентов. Так, цианобактерии снижали содержание в породе вермикулита, при этом структура биотита не изменялась. Актиномицеты трансформировали биотит в биотито-вермикулитовое образование, уменьшая при этом количество вермикулита в породе. Совместное выращивание цианобактерии и актиномицета на породе привело к суммированию указанных эффектов, кроме того, зарегистрирован переход небольшого количества вермикулита в смектит.
Экспериментально показано, что на взаимодействие микроорганизмов с глинистыми минералами влияет не только присутствие того или иного элемента и его доступность в минеральном субстрате, но и существование некоторого оптимума содержания в нем элементов. К примеру, рост фосфат-мобилизующей бактерии Bacillus subtilis при культивировании на среде с Са3(РО4)2 существенно стимулировало добавление в среду минералов монтмориллонита и палыгорскита в концентрации 0,2-1,0 %. При этом повышение концентрации монтмориллонита до 2 % сопровождалось ингибированием роста бактерии. В данном эксперименте показано, что монтмориллонит и палыгорскит коллоидной дисперсности оказывали более выраженное рост-стимулирующее действие на культуру бактерий, чем порошкообразные (Курдиш, Бега, 2006).
Таким образом, ускоренная трансформация минерального субстрата при участии микроорганизмов представляется неоспоримым фактом. При этом различные виды и сочетания микроорганизмов по-разному влияют на один и тот же минеральный субстрат.
Электронно-микроскопические исследования биоминеральных взаимодействий Электронно-микроскопическими исследованиями поверхности минералов, подвергшихся действию микроорганизмов, получены наглядные доказательства микробной трансформации минерального субстрата в виде каверн, ямочек, нарушения целостности минеральных зерен. С помощью трансмиссионного электронного микроскопа показано изменение морфологии иллита под влиянием бактерии Shewanella putrifaciens от тонких иголочек до более крупных по размеру пластинок. Выращивание бактерии на хлорите и нонтроните способствовало возникновению толстого гало на поверхности исследуемых минералов. По-видимому, это связано с бактериальной редукцией Fe (III) и, как следствие, адсорбцией на поверхности минерала продукта реакции Fe (II) (Deb et al., 2007).
Прямое и косвенное влияние микроорганизмов на процессы выветривания минералов
Сравнительный анализ антагонистической активности монокультур цианобактерии A. variabilis и стрептомицетов S. pluricolorescens и S. cyaneofuscatus, а также двучленных ассоциативных талломов (цианобактерия-актиномицет), демонстрирует изменение антимикробных свойств талломов ассоциаций по сравнению с монокультурами их компонентов (табл. 2). Отмечено усиление антимикробной активности ассоциативных талломов с каждым из двух актиномицетов в отношении бактерий Rhodococcus sp., Micrococcus sp., Aquaspirillum sp., Bacillus brevis, актиномицетов Streptomyces sp. №175, грибов Fusarium sp. Показано, что в случае таллома, в котором в качестве мицелиального компонента присутствовал актиномицет S. pluricolorescens, происходит расширение антимикробного спектра и проявление антибиотической активности в отношении следующих тест-культур микроорганизмов: бактерий Methilobacterium sp., Flavobacterium sp., Janthinobacterium sp.; грибов Penicillium sp.; дрожжей Metchnokowia pulcherrima, Монокультуры цианобактерии и актиномицетов и цианобактериально-актиномицетной ассоциации A.variabilis и S.cyaneofuscatus подобных свойств к перечисленным тест-культурам не проявляли (табл. 2).
Наблюдение за изменением значений рН культуральной жидкости показало подщелачивание среды в процессе роста ассоциативного таллома и монокультур S. pluricolorescens и A. variabilis (рис. 7). При этом значения рН среды при развитии ассоциативного таллома находились между значениями, наблюдаемыми при культивировании монокультур актиномицета и цианобактерии. Таким образом, в процессе роста ассоциации значение рН среды становится все более оптимальным для жизнедеятельности одновременно обоих компонентов ассоциативного таллома. 10.0 I
В зрелом ассоциативном талломе (21 сут.), по сравнению с талломом более молодого возраста (10 сут.), обнаружено изменение хода процесса фотосинтеза, зафиксированное с помощью метода электронного парамагнитного резонанса. Отмечено медленное снижение сигнала ЭПР1 (сигнал от окисленных центров хлорофилла P700) исследуемого образца зрелого таллома (рис. 9). Подобный характер спектра может свидетельствовать о нарушении потока электронов от фотосистемы (ФС) II к ФС I, т.е. об изменении фотосинтеза в цианобактерии, входящей в состав ассоциативного таллома. Известно, что ФС II не работает в специализированных азотфиксирующих клетках – гетероцистах. Очевидно, полученные результаты можно объяснить увеличением количества гетероцист в нитях цианобактерии и, возможно, более быстрым старением цианобактерии в ассоциации с актиномицетом по сравнению с монокультурой, т.к. известно, что с возрастом количество гетероцист в нитях цианобактерии возрастает (как следствие истощения со временем питательной среды и, в частности, уменьшением в ней нитратного азота) (Баулина, 2010). Сравнение сигналов ЭПР1 в талломе ассоциации и в монокультуре цианобактерии демонстрирует 6-кратное увеличение амплитуды сигнала в случае ассоциативного таллома, что может свидетельствовать об увеличении биомассы цианобактерии при контакте с актиномицетом по сравнению с монокультурой (рис. 10).
Показано, что в клетках цианобактерии в талломе экспериментальной ассоциации, выдерживаемой в течение 1-2 недель в условиях давления влаги -96,4 МПа (аw 0.50), сохранялся хлорофилл, о чем свидетельствует собственная флуоресценция клеток цианобактерии, наблюдаемая в люминесцентном микроскопе (рис. 11). Отмечено, что количество флуоресцирующих клеток цианобактерии в ассоциативном талломе недельного возраста превышает таковое в монокультуре на 20 %. В двухнедельном талломе эта разница составляет уже около 70 % (рис. 12).
Возможно, за сохранение хлорофилла в клетках цианобактерии при высушивании таллома ассоциации ответственна обнаруженная в лиофильно высушенном талломе фракция свободных протонов (протонов «свободной воды»). Методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР высокого разрешения и ЯМР спиновое эхо) было показано, что в лиофильно высушенных образцах цианобактериально-актиномицетной ассоциации, сформированной A. variabilis и стрептомицетом S. pluricolorescens, присутствует фракция подвижных протонов (2.7% от веса образца, Т2= 16 мс), которая сохраняется и при низких температурах. В спектре протонного резонанса лиофильно высушенного образца ассоциации наблюдается сигнал с химическим сдвигом около 5 м.д. относительно тетраметилсилана (0 м.д.), что характерно для фракции свободных протонов (рис. 13). В лиофильно высушенных клетках монокультур стрептомицета и цианобактерии фракция свободных протонов не обнаружена.
Ультраструктурные изменения актиномицетов и цианобактерии в экспериментальном ассоциативном талломе
Известно, что в почвах слюды представляют собой долговременный источник питательных элементов (К, Mg, Fe и т.д.), освобождаемых в раствор в процессе выветривания. Однако слюды по-разному ведут себя по отношению к выветриванию. Нами показано, что в случае диоктаэдрической слюды – мусковита, отмечено лишь малое структурное преобразование решетки минерала по сравнению биотитом, относящемуся к триоктаэдрическому ряду слюд. Полученные данные могут быть объяснены кристаллохимическими особенностями минералов и, прежде всего, различной ориентацией ОН-групп октаэдров внутри трехслойного пакета слюд ди- и триоктаэдрического типа. Известно, что в триоктаэдрических слюдах ОН-группы ориентированы таким образом, что ион водорода этой группы находится в непосредственной близости от положительно заряженного иона калия (К), и между ними возникают силы электростатического отталкивании, способствующие более быстрому разрушению решетки минерала (Соколова и др., 2005). Более быстрому освобождению калия из кристаллических решеток триоктаэдрических слюд способствует также наличие в диоктаэдрических слюдах изоморфного замещения некоторой части гидроксильных групп ионом F-, что обеспечивает развитие электростатического взаимодействия между этим анионом и межпакетным калием.
Глинистые минералы, унаследованные от почвообразующей породы, подвергаются биогенному влиянию во всех почвах, при этом происходит их трансформация, ведущая в некоторых случаях к полному разрушению минерала (Чижикова и др., 2009). Способность микроорганизмов извлекать элементы из силикатов направлена на обеспечение их потребностей в минеральном питании (Звягинцев, Зенова, 2001), извлекаемые элементы влияют на многие метаболические процессы микроорганизмов.
Известно, что возраст первых находок литифицированных цианобактериальных сообществ – строматолитов, определяется как 3,5 млрд. лет, что совпадает с началом в докембрии гидроземного процесса почвообразования как первого единого почвообразовательного процесса на Земле (Чижикова и др., 2009). Таким образом, зафиксированные кристаллохимические преобразования минералов, входящих в состав пород, могут служить аналогами трансформационных преобразований, происходящих в далекие геологические эпохи. В результате этих процессов на сформированных субстратах поселялись более высокоорганизованные организмы, растения, ускоряющие процесс почвообразования.
Заключение
Сформированы экспериментальные ассоциативные талломы, компонентами которых являются гетероцистообразующая цианобактерия Аnabaena variabibilis Kutz. АТСС 29413 и актиномицеты Streptomyces pluricolorescens FR837629 и Streptomyces cyaneofuscatus FR837630. Микроскопические исследования экспериментального ассоциативного таллома выявили появление L-подобных форм актиномицетов, отсутствующих в монокультурах и наличие дефектов в клеточных стенках цианобактерии.
Отмечены физиологические изменения цианобактерии и актиномицетов в экспериментальном талломе: замедление спада электронно-парамагнитного резонансного (ЭПР) сигнала, что свидетельствует о нарушении потока электронов от ФС II к ФС I в мембранах цианобактерии, то есть об изменении фотосинтетической работы тилакоидов цианобактерии в ассоциации по сравнению с монокультурой цианобактерии. Отмечено существенное увеличение биомассы цианобактерии в талломе ассоциации по сравнению с монокультурой цианобактерии. Установлено сохранение собственной флуоресценции хлорофилла в клетках цианобактерии при экспонировании ассоциативного таллома в условиях экстремальной влажности (аw 0,50) при отсутствии флуоресценции при экспонировании монокультуры цианобактерии в адекватных условиях. Очевидно, ксеротолерантность цианобактерии в талломе ассоциации связана с присутствием свободной воды, обнаруженной методом ЯМР. Установлено расширение спектра антимикробного действия ассоциативного таллома к тест-культурам микроорганизмов по сравнению с монокультурами цианобактерии и актиномицетов. Появление L-подобных форм у актиномицета, наличие изменений в ультраструктуре фотосинтетического аппарата цианобактерии, наряду с изменением экофизиологических свойств компонентов ассоциации, свидетельствует о симбиотическом характере взаимодействия компонентов в экспериментальном ассоциативного таллома.
Показано, что под влиянием жизнедеятельности монокультур цианобактерии и стрептомицетов, а также формируемых ими ассоциативных талломов происходит заметное кристаллохимическое преобразование решетки глинистых минералов, причем наибольшее биодеградационное влияние на структурное состояние минеральной составляющей было отмечено при выращивании цианобактериально-актиномицетных ассоциаций. Отмечено увеличение выхода в раствор ряда элементов под влиянием развития ассоциативного цианобактериально-актиномицетного таллома.
Способность микроорганизмов к извлечению элементов из структуры силикатов обусловлена их потребностями в минеральном питании. Значение процесса биодеструкции минерального субстрата наиболее ярко проявляется в биоценозах на ранних стадиях почвообразования, когда горная порода является практически единственным источником зольных элементов питания. Трансформационное преобразование глинистых минералов под влиянием микробных сообществ, выраженные в разной степени, происходит и в современном почвенном профиле. Результатом такого структурного изменения унаследованных от почвообразующей породы минералов является изменение комплекса физико-химических свойств почвы - порозности, катионообменной способности почв, воздухопроницаемости, что, в конечном счете, определяет почвенное плодородие.
Являясь первопоселенцами на выветриваемых скальных породах, сообщества цианобактерий и актиномицетов принимают активное участие в процессах первичного почвообразования а, будучи обязательным компонентом сообщества почвенных микроорганизмов, оказывают многогранное влияние на свойства почвы и на ее минералогический состав.
