Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 10
1.1. Нефтяное загрязнение и его опасность для гидро-бионтов 10
1.2. Происхождение, строение, классификация и свойства гуминовых веществ 18
1.3. Распространение и роль гуминовых веществ в биосфере 26
1.4. Способы получения и применение гуминовых веществ 33
1.5. Некоторые аспекты взаимодействия гуминовых веществ с экотоксикантами 40
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 46
2.1. Объекты исследований 46
2.2. Используемые вещества 49
2.3. Методы исследований 51
2.3.1. Метод биотестирования основанный на регистрации выживаемости тест-объектов 52
2.3.2. Оценка токсичности анализируемых проб основанная на регистрации реакции всплытия дафний 52
2.3.3. Оценка влияния химических соединений на D. magna 53
2.3.4. Методика постановки экспериментов по действию различных соединений на нителлу 53
2.3.5. Методика постановки экспериментов по действию различных веществ на ряску 54
2.3.6. Методика постановки экспериментов по действию различных веществ на семена пшеницы 54
2.3.7. Изучение влияния диализа на токсичность гумата 55
2.3.8. Изучение влияния нефтепродуктов и гуматов на изменение гидрофобности поверхности бактериальных спор 55
2.3.9. Влияние ГВ и ПАВ на количество капель в эмульсиях нефтепродуктов 56
2.3.10. Метод измерения размера капель эмульсий 57
2.3.11. Спектроскопия ЯМР ,70 в изучении механизма взаимодействия гуматов и нефтепродуктов 57
2.3.12. Метод люминесцентной микроскопии 57
2.3 Л 3. Статистическая обработка данных 58
ГЛАВА 3. Исследование влияния препаратов гуминовых веществ на тест-объекты 59
ГЛАВА 4. Ослабление токсичности нефти, нефтепродуктов и их индивидуальных ингредиентов под действием гуминовых веществ 66
ГЛАВА 5. Влияние гуминовых веществ на токсичность нефте продуктов для наземных растений и гидрофитов 84
ГЛАВА 6. Исследование путей ослабления гуматами токсического действия нефтепродуктов 97
ВЫВОДЫ 105
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 106
ПРИЛОЖЕНИЯ 133
- Нефтяное загрязнение и его опасность для гидро-бионтов
- Методика постановки экспериментов по действию различных веществ на ряску
- Спектроскопия ЯМР ,70 в изучении механизма взаимодействия гуматов и нефтепродуктов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Загрязнение природной среды нефтью и нефтепродуктами - наиболее актуальная экологическая проблема конца XX - начала XXI вв. Нефтегенные загрязняющие вещества обнаруживаются повсюду и повсеместно: в водоемах, почвах, подземных водоносных горизонтах, в воздухе, и имеют поистине глобальное распространение (Гриценко, Акопова, Максимов, 1997; Бачурин, 2000; Ручкинова, Вайсман 2003; The ecological impacts of ..., 1997). По масштабам распространения и уровням химических нагрузок на все компоненты ландшафтов ни один другой загрязнитель не может сравниться с нефтью (Гурвич, 1997; Паренаго, Давыдова, 1999; Одинцова, 2003; Beswick, 1996). Поэтому с ростом антропогенной нагрузки на водные объекты все больший интерес представляют работы по поиску путей детоксикации различных соединений. На нашей планете существуют гигантские запасы гуминовых веществ (ТВ) (Кононова, 1963; Камнева, 1974; Романкевич, 1977; Варшал и др., 1988; Глазковская, 1988; Орлов, 1992; Орлов, 1997; Калабин, Каницкая, Куш-нарев, 2000). В настоящее время во всем мире наблюдается повышенный интерес к ГВ, совершенствуются технологии производства, расширяется сырьевая база, в которую вовлекаются все новые виды углей, торфов, сланцев, пелоидов и других источников.
Многочисленными исследованиями установлено стимулирующее действие гуминовых соединений на рост и развитие растений, повышение их устойчивости к неблагоприятным факторам окружающей среды (Христева и др., 1985; Уланов, 1993; Муравьева, Кадошникова, Михеев, 1995; Кшникаткина, Ларина, 1996; Lozek, Varga, 1998). В результате повышается урожайность сельскохозяйственных культур, улучшается качество растениеводческой продукции (Аль-Осман, Григор'ев, 1992; Жукова, 1995; Костюк, Андрушкив, Мельник, 1995; Шевченко, 1996). Это связано с тем, что гуматы являются определяющим фактором плодородия почв, обладают способностью пролонгированного действия и ослабления воздействия неблагоприятных факторов. Действие гуминовых
5 препаратов не ограничивается влиянием на обмен веществ растений. При систематическом использовании препаратов улучшается структура почвы, ее буферные и ионообменные свойства, активизируется деятельность почвенных микроорганизмов, минеральные элементы переводятся в доступную для растений форму (Бондаренко, 1989; Булли, Антонова, Олейник, 1994; Якименко, Орлов, Аммосова, 1995; Аммосова и др., 1996; Гусева, 1996; Шаяхметов, Гиля-зетдинов, Нугуманов, 2000; Andrzejewski, 1993). Гуминовые препараты повышают способность растений противостоять болезням, засухе, переувлажнению, переносить повышенные дозы солей азота в почве (Пшеничук, 1987; Сокол, Стенина, Матевосян, 1987; Серова, Шанбанович, Гесь, 1995; Ямчук, Болнова, 1995; Серова и др., 1996; Трусевич, 1998).
Гуматы находят все большее распространение не только в растениеводстве, но и в животноводстве. Доказано, что гуматы способствуют ускорению роста скота, снижению заболеваемости и падежа животных, повышению устойчивости их организма к неблагоприятным условиям среды, а также к токсинам в кормах (Лотош, 1985; Кулешов, 1987; Родэ, Терентьев, Ларионов, 1994; Акатьева, 1997; Грищук, 1997; Маслов, 1998; Прокофьева, 1999; Шаяхметов и др., 2000; Hampl, Herzig, Vicek, 1994). Гуматы не обладают аллергирующими и канцерогенными свойствами. К тому же гуминовые препараты обеспечивают экологическую чистоту сельскохозяйственной и животноводческой продукции на фоне ионизирующей радиации и загрязнения окружающей среды гербицидами, пестицидами, соединениями тяжелых металлов и другими токсичными веществами (Горовая, 1993; Анисимова, Перминова, Лебедева, 1998; Шаяхметов, Ги-лязетдинов, Нугуманов, 2000; Шаяхметов и др., 2000; Соколов, Бокова, 2002).
При этом следует отметить, что, хотя препараты гуматов давно применяются на практике, крайне недостаточно изучены физиологические аспекты и механизмы воздействия гуматов на организмы. Гуминовые препараты, поступающие на рынок, существенно различаются по своим свойствам и активности, что зависит от вида сырья, способа производства препарата и формы готового
продукта (Лиштван, Абрамец, 1993; Наумова и др., 1993; Безуглова, 2000; Ка-лабин, Каницкая, Кушнарев, 2000).
Особого внимания заслуживают адаптогенные свойства ГВ, обусловленные их способностью связывать радионуклиды, ионы тяжелых металлов, пестициды, гербициды и другие экотоксиканты (Линник, Набиванец, 1986; Мур, Рамамурти, 1987; Косьянова, Орлов, Аммосова, 1993; Линник, Щербань, 1999; Перминова, 2000; Линник, Васильчук, 2001; Campbell, Evans, 1987; Courtijn, Vandecasteel, Dams, 1990).
Имеются сообщения о возможности ослабления ГВ токсического действия некоторых загрязнителей на организмы (Шульгин, Шаповалов, Пуцикин, 1998; Chin, Aiken, Danielsen, 1997; Anisimova, Perminova, Lebedeva, 1998; Per-minova et al., 2000; Steinberg et al., 2000). Показано, что ҐВ могут в некоторых случаях снижать токсичность, как тяжелых металлов, так и отдельных органических соединений (Перминова и др., 1994; Салеем Каид, 2004; McCarthy, Jimenez, Barbee, 1985; Servos, Muir, 1989; Stackhouse, Benson, 1989; Oris, Hall, Tylka, 1990; Day, 1991; Haitzer et al., 1998; Perminova, Grechishcheva, Petrosyan, 1999). В то же время описано и усиление токсического действия некоторых соединений в присутствии ГВ (Антонова, Черных, Стом, 2000; Stewart, 1984; Servos, Muir, 1989; Oikari, Kukkonen, Virtanen, 1992; Steinberg et al., 1994; Lorenz et al., 1996). Таким образом, роль ГВ в изменении биологической активности разнообразных химических веществ, загрязняющих окружающую среду, весьма плохо изучена и до некоторой степени противоречива. До настоящего времени остаются очень слабо разработанными направления по использованию гуматов для детоксикации конкретных загрязнителей окружающей среды, за исключением тяжелых металлов. До наших исследований практически отсутствовали исследования посвященные использованию ГВ для ослабления негативного действия нефтей, нефтепродуктов и их индивидуальных составляющих и, прежде всего алифатических углеводородов, на долю которых приходится от 50 до 95 % от всех углеводородов нефти (Квасников, Клюшникова, 1981).
7 Цель и задачи исследований: изучить возможность ослабления ГВ токсичности нефтей, нефтепродуктов и их индивидуальных ингредиентов. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
изучить в лабораторных условиях влияние различных концентраций ГВ на тест-объекты;
проанализировать влияние нефти, нефтепродуктов и их индивидуальных ингредиентов на тест-организмы;
исследовать совместное действие гуматов и нефтепродуктов на биотесты и выявить возможность ослабления токсичности нефтяных углеводородов под влиянием препаратов ГВ;
исследовать механизмы, лежащие в основе антидотного действия гуматов по отношению к нефти и нефтепродуктам.
Положения выносимые на защиту:
ГВ снижают токсичность эмульсий нефтей, нефтепродуктов, индивидуальных алифатических, ароматических и нафтеновых углеводородов нефти, как для беспозвоночных животных, так и для растительных организмов.
ГВ приводят к обратимости токсических эффектов на дафниях вызываемых действием эмульсий нефтепродуктов и углеводородов нефти.
Препараты ГВ и ПАВ вызывают повышение гидрофильности поверхности тест-организмов. При одновременном присутствии ГВ и детергентов происходит взаимоусиление их способности выступать антагонистами углеводородов нефти.
В основе антидотной активности ГВ по отношению к нефтепродуктам лежит их способность выступать в роли поверхностно-активных агентов, снижая гид-рофобность поверхностей тест-организмов.
Научная новизна и теоретическое значение. Впервые проведено комплексное экспериментальное исследование влияния большого числа различных препаратов ГВ на эффекты нефтей, нефтепродуктов, входящих в их состав индивидуальных алифатических, ароматических и нафтеновых углеводородов как на беспозвоночные животные (выживаемость дафний и циклопов, всплытие на
8 поверхность Cladocera), так и на растительные тесты (увеличение числа листьев ряски, движение цитоплазмы нителлы, прорастание семян пшеницы, рост в длину корней и стеблей проростков пшеницы). Выявлено, что нефтепродукты повышают гидрофобные свойства поверхности тела тест-организмов. Препараты ГВ и ПАВ увеличивают гидрофильность поверхности тест-организмов, а также уменьшают размеры и число капель в эмульсиях углеводородов нефти. Показано, что при определенном соотношении концентраций самые различные препараты ГВ, неионогенные ПАВ (Tween-20, Triton Х-100), а еще в большей степени их смеси ослабляют или даже полностью предотвращают негативное влияние нефти, нефтепродуктов, индивидуальных алифатических, ароматических и нафтеновых углеводородов на растительные и животные тест-организмы. Препараты ГВ и ПАВ вызывают обратимость токсических эффектов углеводородов нефти на поведенческие реакции дафний. Установлено, что ГВ действуют на эффекты нефтепродуктов на биотесты как аналоги детергентов. Доказано, что в основе механизма определяющего способность препаратов ГВ ослаблять токсические эффекты нефтепродуктов на тест-организмы лежат их поверхностно-активные свойства, благодаря которым снижается гидрофоб-ность поверхностей тест-организмов, инициированная углеводородами нефти.
Практическая значимость работы. Проведенные исследования показали принципиальную возможность практического использования препаратов ГВ для снижения токсичности нефти и нефтепродуктов. Найдены оптимальные соотношения концентраций препаратов гуматов с нефтепродуктами для ослабления негативного эффекта углеводородов нефти на тест-объекты. Данные препараты ГВ при дальнейшем изучении могут быть рекомендованы в качестве де-токсицирующих агентов для рекультивации загрязненных углеводородами нефти сред. Выявлены концентрации ГВ оказывающие стимулирующее, угнетающее и нейтральное действие на растительные и животные организмы.
Материалы диссертации используются в учебном процессе для чтения курсов лекций на биологическом и географическом факультетах ИГУ ("Эко-
9 токсикология", "Прикладная экология", "Рациональное природопользование", "Водная токсикология", "Биология с основами экологии").
Результаты работы включены в отчеты лаборатории водной токсикологии НИИ биологии при ИГУ по грантам РФФИ (№99-04-49612 и 02-04-49976); по НТП "Государственная поддержка региональной научно-технической политики Высшей школы и развития ее потенциала", проект № 477.
Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на научной конференции "Природные ресурсы Забайкалья и проблемы природопользования" (Чита, 2001); Международной научно-практической конференции "Почва как связующее звено функционирования природных и антропогенно-преобразованных экосистем" (Иркутск, 2001); Молодежной научной школе "Нефть и газ в современном мире: геолого-экономические и социально-культурные аспекты" (Иркутск, 2001); Международной конференции "Природные условия, история и культура Западной Монголии и сопредельных регионов" (Ховд, MP, 2001); 4-ой Межрегиональной научно-практической конференции "Сибресурс-2002" - "Интеллектуальные и материальные ресурсы Сибири" (Иркутск, 2002); III Международной научно-практической конференции "Состояние биосферы и здоровье людей" (Пенза, 2003); Всероссийской научно-практической конференции "Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе" (Иркутск, 2003); 2nd International Scientific Practical Conference "Earthworms and Soil's Fertility" (Vladimir, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 137 страницах и состоит из введения, 6 глав, выводов и списка литературы. Список литературы включает 256 источников, в том числе 79 иностранных. Работа иллюстрирована 35 таблицами, 2 рисунками и 4 приложениями.
Нефтяное загрязнение и его опасность для гидро-бионтов
Огромные масштабы использования ископаемого сырья в различных областях промышленности, деятельность металлургических, химических, нефтеперерабатывающих и других предприятий сопровождается интенсивным загрязнением окружающей среды. Все антропогенные воздействия на атмосферу или литосферу выходят на гидросферу через атмосферные осадки, почвенный сток, подземные воды и другие процессы, связанные с круговоротом воды (Дваладзе, Поздняков, Самуйленков, 2000; Калюжин, Коломытцев, 2000; Уварова, 2000; Московченко, Валеева, 2001).
Загрязнение природной среды нефтью и нефтепродуктами - наиболее актуальная экологическая проблема конца XX - начала XXI вв. Нефтегенные вещества обнаруживаются повсеместно: в открытых водоемах, почвах, подземных водоносных горизонтах, в воздухе, составляя основную часть общего органического загрязнения окружающей среды (Черняховский, Гейвандов, 2002). Потери нефти и нефтепродуктов в процессе функционирования предприятий происходят в различной форме и различным путем. Велико число прорывов магистральных и внутрипромысловых нефтепроводов, в результате которых на рельеф, в поверхностные водоемы и, что труднее всего поддается ликвидации, в болотные угодья попадает большое количество нефти и нефтепродуктов. К сожалению, стремление нефтяников скрывать такие аварии, а тем более объемы потерь, не позволяет иметь надежных данных о подобных происшествиях. Практически под любым объектом, связанным с добычей, переработкой, транспортировкой, хранением, реализацией нефти и нефтепродуктов, образуется зона загрязнения грунтов и подземных вод разнообразными углеводородами нефтяного ряда.
Нефтяное загрязнение земной поверхности относится к числу наиболее опасных, поскольку оно принципиально изменяет свойства почв, а очистка от нефти очень сильно затруднена (Почвенно-экологический мониторинг и охрана почв, 1994). Последствия можно без преувеличения назвать чрезвычайными. Нефть обволакивает почвенные частицы, почва не смачивается водой, гибнет микрофлора, растения не получают должного питания. Наконец, частицы почвы слипаются, а сама нефть постепенно переходит в иное состояние, ее фракции становятся более окисленными, затвердевают, и при высоких уровнях загрязнения почва напоминает асфальтоподобную массу. Бороться с таким явлением очень трудно. При малых уровнях загрязнения помогает внесение удобрений, стимулирующих развитие микрофлоры и растений. В результате нефть частично минерализуется, некоторые ее фрагменты входят в состав гуминовых веществ, и почва восстанавливается. Но при больших дозах и длительных сроках загрязнения в почве происходят необратимые изменения. Тогда наиболее загрязненные слои приходится просто удалять. В почвах медленнее нарастают токсичные уровни загрязняющих веществ, но зато они дольше в ней сохраняются, негативно влияя на экологическую обстановку целых регионов (Орлов, 1996). Но влияние загрязнения почв бывает не столь заметным и очевидным, как загрязнение гидросферы.
Быстрое развитие нефтедобывающего и нефтеперерабатывающего комплексов при несовершенном уровне технологических процессов при добыче, транспортировке и переработке нефти является основным фактором воздействия на окружающую среду, и, вследствие этого, утечки нефти и нефтепродуктов с нефтеперерабатывающих заводов, баз горюче-смазочных материалов, при транспортировке по трубопроводам приводят к загрязнению водной среды нефтью и нефтепродуктами (Гусейнов, Алекперов, 1989; Кормак, 1989; Акимова, Чурсина, Малахов, 1995; Земенков, Кутузова, Коваленко, 1997; Шеметов, 1997; Матимов, Шпарковский, Муравейко, 1998; Техногенное загрязнение природных вод углеводородами и его экологические последствия, 2001).
Нефтяные углеводороды попадают в водную среду из самых различных источников. Еще до широкого использования нефти человеком она в малых концентрациях постоянно присутствовала в водах Мирового океана (Кульский, Даль, 1978). Подсчитано, что и сейчас ежегодно в моря поступает до 12 млн. тонн углеводородов при естественных выходах нефти и газа на морском дне или на побережье (Гриценко, Акопова, Максимов, 1997). Углеводороды выделяют также многие организмы: некоторые виды водорослей, губок, кораллов, различные виды моллюскор (Миронов, 1985). Другие морские обитатели, такие, как микроорганизмы, используют эти соединения в качестве углеродного питания. Естественные поступления нефтяных углеводородов в водоемы до вмешательства человека уравновешивались их естественной убылью. Ныне антропогенное поступление нефти и нефтепродуктов в Мировой океан достигает огромных размеров и значительно превышает их естественный приток (Гриценко, Акопова, Максимов, 1997 Техногенное загрязнение природных вод углеводородами и его экологические последствия, 2001). По разным данным от 75 до 96% нефтяного загрязнения гидросферы дают постоянные поступления малых количеств сырой нефти и очищенных нефтепродуктов при ее добыче, транспортировке, хранения, переработки нефти и использовании нефтепродуктов (Гурвич, 1997). По оценкам специалистов, ежегодно по всему миру в воды рек, морей и океанов попадает десятки миллионов тонн нефти и нефтепродуктов (Миронов, 2000). Анализ съемок полученных с искусственных спутников Земли показывает, что около [30 % поверхности Мирового океана загрязнено сегодня нефтью и нефтепродуктами.
Нефть представляет! собой сложную смесь алканов (парафиновых или ациклических углеводородов), цикланов (нафтенов) и аренов (ароматических углеводородов), различной молекулярной массы, а также кислородных, сернистых и азотистых производных углеводородов (Квасников, Клюшникова, 1981). По современным представлениям нефть, дистиллятные и остаточные нефтепродукты представляют собой нефтяные дисперсные системы (НДС) в которой дисперсной фазой являются асфальтены, смолы, парафины (Сюняев, Сафиева, 1995; Алексеев, Леоненко, Сафонов, 1997). Основным свойством НДС, вследствие сильно развитой межфазной поверхности, является склонность к изменению своей дисперсности под влиянием внешних факторов (температуры, химических реагентов и т.д.). В одних случаях это может привести к повышению коллоидно-химической стабильности нефтепродуктов, в других - к расслоению исходной системы, вследствие этого после попадания нефти в воду, она подвергается разделению внутри водного бассейна рядом путей:
Распространение - это процесс, путем которого разлитая нефть передвигается, и сама разбавляется на поверхности воды. Пленка нефти может перемещаться под действием водных течений или ветра. Таким образом, нефть и нефтепродукты могут распространяться на десятки и сотни километров от места разлива (Миронов, 1985І; Бембель и др., 1997; Smith, 1968). Степень распространения нефтяного пятна зависит от вязкости разлитой нефти и условий окружающей среды (сила ветра, турбулентность, присутствие льда на поверхности воды).
Методика постановки экспериментов по действию различных веществ на ряску
Эксперименты с ряской проводили в лабораторных условиях при температуре 23 +2 С. Опыты ставили в стаканчиках объемом 50 мл. Для экспериментов отбирали растения ряски с одной развитой и одной развивающейся лопастью (Король, 1979; Stom, Roth, 1981).
Опыты ставили по следующей схеме:
1) Контроль (отстоянная вода);
2) Эмульсии нефтепродуктов;
3) Эмульсии нефтепродуктов с добавлением ГВ.
О действии испытуемых веществ судили по приросту лопастей через 10 суток. Контролем служил рост растений в отстойной воде. Результаты экспериментов выражали как прирост лопастей в процентах к общему количеству.
Эксперименты по влиянию исследуемых веществ на рост проростков семян пшеницы ставили в лабораторных условиях при комнатной температуре 20-23 С. Оценку биологической активности гуматов проводили по их воздействию на прорастание семян и дальнейший рост корней и проростков пшеницы по методике (Stom, 1982). Для экспериментов и контроля использовали отстойную водопроводную воду.
В экспериментах с пшеницей для опытов отбирали одинаковые по размеру семена. Водные растворы испытуемых веществ по 10 мл наливали в чашки Петри (диаметр 10 см), где на фильтровальной бумаге предварительно были разложены семена в количестве 30 штук. В контрольные чашки наливали тот же объем отстойной воды.
В первой серии опытов оценивали токсичность химических соединений по трем критериям: всхожести семян через 24 часа; приросту в длину центральных корней и стеблей проростков через 5 суток.
Во второй серии экспериментов исследовали влияние смесей препаратов ГВ с токсикантами на всхожесть семян через сутки; прирост в длину корешков и стеблей проростков через 5 суток.
Для каждого варианта опытов было проведено 2-3 независимых экспериментов с 3 аналитическими повторностями.
Для выяснения того, связана ли токсичность повышенных концентраций препаратов гуматов с самими ГВ или с их низкомолекулярными соединениями, входящими в состав препаратов, оценивали токсичность гуматов до и после диализа. В качестве мембран для диализа препаратов ГВ использовалась целлофановая пленка (из гидратцеллюлозы). Диализ проводился в 20-ти литровых емкостях в течение суток при комнатной температуре.
Для изучения механизма влияния ГВ на нефтепродукты применяли тест на гидрофобность, основанный на изучении гидрофильно-гидрофобных свойств бактериальных клеток (Rosenberg, Gutiik, Rosenberg, 1980).
Бактериальные споры смывали с питательной среды дистиллированной водой и доводили до оптической плотности 0,6-0,7. Концентрацию спор во взвеси определяли на приборе КФК-2 при А,=400 мкм. Для измерения использовали кюветы толщиной 1 см.
Гидрофобность оценивали спектрофотометрически по количеству спор, перешедших из бактериальной суспензии в гексадекан. К 8 мл бактериальной суспензии приливали 2 мл гексадекана, перемешивали в течение 2 мин и отстаивали в течение 10 мин. Затем отбирали со дна водную фазу и определяли плотность бактериальной суспензии.
Относительную гидрофобность рассчитывали по формуле:
Г=(ДгД»п/Д )х100,
где Дк - оптическая плотность исходной бактериальной суспензии,
Доп - оптическая плотность бактериальной суспензии после смешивания с гексадеканом,
Г - индекс гидрофобности, %.
При обработке бактериальной суспензии нефтепродуктами к 100 мл исходной бактериальной суспензии приливали 10"1 мл нефтепродукта, затем смесь перемешивали в течение 10 мин. Для удаления нефтепродуктов бактериальную суспензию центрифугировали при 8 000 об./мин., затем надосадочную жидкость сливали, доливали равным объемом дистиллированной воды, ресус-пендировали и снова центрифугировали в том же режиме. После второго центрифугирования суспензию ресуспендировали и доводили оптическую плотность до исходного показателя (0,6-0,7). При обработке бактериальной суспензии гуматами к 100 мл исходной бактериальной суспензии приливали равный объем раствора гумата с концентрацией 5x10" г/л. Дальнейшую обработку проводили, так же как и с нефтепродуктами.
Спектроскопия ЯМР ,70 в изучении механизма взаимодействия гуматов и нефтепродуктов
Вначале изучали влияние различных концентраций препаратов гуматов на биотесты. По результатам этих экспериментов были найдены концентрации гуматов не оказывающие влияния на тест-функции изученных объектов, инги-бирующие и стимулирующие их.
Как видно из материалов таблицы 3.1, при суточной экспозиции растворы препарата "Гумат-80" не оказывали видимого влияния на D. magna в концентрациях 10 и 5х10-1 г/л. При повышении концентрации гумата в растворе до 1 г/л и 2 г/л через 24 часа экспозиции выживало лишь 69 и 50% тест-объектов соответственно. В концентрации данного препарата 4 г/л гибель 100% рачков наблюдали уже через 4 часа после постановки эксперимента.
Самым токсичными из всех исследованных препаратов ГВ в концентрации 5x10" г/л оказался препарат "Гумэл". При суточной экспозиции выживаемость тест-объектов составила всего 77% (табл. 3.1).
Все другие исследованные препараты ГВ в концентрации 5x10" г/л не оказывали видимого влияния на дафний.
Сходные результаты по действию препаратов ГВ были получены и на других тест-объектах Simocephalus vetulus и Cyclops kolensis (приложения А, Б).
Все препараты ГВ наряду с органическими составляющими содержат и неорганические соединения. Для примера в таблице 3.2 дан химический состав препарата "Гумат-80". А при анализе препарата "Aldrich" выявлены следующие элементы в (%): Na - 2; F - 1,4; С - 3; Са - 0,5; А1 - 0,4; Mg - 0,05; К - 0,04; Ва, Si, Ті 0,02 каждого; Сг, Си, Ga, Li, Mn, Sr, В, Zr 0,005 каждого. Все другие металлы практически не обнаруживались.
Для выявления роли низкомолекулярных фракций в токсичности повышенных концентраций препаратов гуматов для тест-объектов мы провели ряд экспериментов с разделением препаратов гуматов на высокомолекулярные и низкомолекулярные фракции с помощью диализа.
Затем были проведены токсикологические исследования по влиянию высокомолекулярных фракций оставшихся после диализа на тест-объекты.
Как видно из материалов таблицы 3.3 все испытуемые препараты ГВ после диализа были нетоксичны для D. magna даже при самой высокой из исследованных концентраций - 4 г/л. Например, препарат "Гумат-80" в концентрации 4 г/л после диализа не оказывал токсического влияния на рачков после 24-х часовой экспозиции. До диализа в таких растворах все дафнии погибали через 4 часа (табл. 3.1 и 3.3). Аналогичным образом диализ уменьшал зооцидность и всех других исследованных препаратов ГВ (табл. 3.1 и 3.3).
После диализа уменьшалась токсичность препаратов ГВ и для других тест-объектов - Simocephalus vetulus и Cyclops kolensis (приложения В, Г).
Таким образом, токсичность повышенных концентраций препаратов гу-матов связана, прежде всего, с низкомолекулярными соединениями, диффундирующими через целлофановую мембрану.
Как видно из результатов экспериментов представленных в таблице 3.4, токсический эффект препаратов "Гумат-80", "Экстра" и "Гумат +7" на рост центрального корня проростков пшеницы проявлялся при концентраций 6 г/л и выше. В более низких концентрациях препарат Тумат-80" не только не угнетал роста главного корня, но и вызывал стимуляцию ростовых процессов. Так, например, при концентрации препарата "Гумат-80" 4 г/л увеличение длины центрального корня было на 32% выше по сравнению с контролем (вода).
Более чувствительным объектом к действию ГВ оказался представитель гидрофитов - ряска малая. Данные по влиянию гумата на ее рост представлены в таблице 3.5. Как видно из материалов таблицы, рост ряски полностью инги 64 бировался гуматом в концентрации 3 г/л. В концентрации 1 г/л гумат не оказывал влияния на рост ряски (прирост лопастей оставался на уровне контроля).
