Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Лектины и их биологическая активность 11
1.2. Цитокины и их основные свойства 17
1.2.1. Прово спал ительные цитокины 23
1.3. Влияние лектинов на индукцию цитокинов 43
2. Экспериментальная часть 45
2.1. Материалы и методы 45
2.1.1. Объекты исследования 45
2.1.2. Выделение, очистка и использование лектина ЛП Paenibacillus polymyxa 1460 47
2.1.3. Выделение альвеолярных и перитонеальных макрофагов 48
2.1.4. Моделирование процесса фагоцитоза 49
2.1.5. Моделирование инфекционного процесса на фоне действия лектина 49
2.1.6. Определение провоспалительных цитокинов 50
2.1.7. Статистическая обработка результатов 50
2.2. Результаты исследований и их обсуждение 51
2.2.1. Определение синтеза провоспалительных цитокинов макрофагами интактных мышей при фагоцитозе бактерий 51
2.2.2. Изучение влияния бактериального лектина ЛП P.polymyxa 1460 на синтез провоспалительных цитокинов при фагоцитозе бактерий 57
2.2.3. Исследование взаимодействия лектина ЛІІ с поверхностными рецепторами макрофагов и определение цитокинсинтезирующей активности 83
2.2.4. Влияние лектина ЛИ на цитокиновый статус мышей при моделировании инфекционного процесса 91
2.2.4.1. Влияние лектина ЛИ на цитокиновый статус мышей при моделировании стафилококковой инфекции 91
2.2.4.2. Влияние лектина на содержание цитокинов при моделировании эшерихиозной инфекции 94
2.2.4.3. Влияние лектина на содержание цитокинов при моделировании иерсиниозной инфекции 97
Заключение 101
Выводы 108
Список использованных литературных источников 109
- Лектины и их биологическая активность
- Прово спал ительные цитокины
- Выделение, очистка и использование лектина ЛП Paenibacillus polymyxa 1460
- Определение синтеза провоспалительных цитокинов макрофагами интактных мышей при фагоцитозе бактерий
Введение к работе
Актуальность работы
Внимание исследователей к различным аспектам изучения лектинов., относящихся к биологически активным белкам с широким спектром действия, связано с перспективами их использования в биологии и экспериментальной медицине. За последние годы в лектинологии наметился переход от изучения лектинов растительного и животного происхождения к изучению микробных лектинов. Значительно возрос интерес к лектинам, выделенным из непатогенных бактерий (Линевич, 1979; Лахтин, 1992; Никитина 2001; Карпунина, 2002; 2005; Шендеров, Лахтин, 2004). Эта тенденция не случайна: микробные лектины, выделенные из непатогенных бактерий, характеризуются высокой удельной активностью, большим разнообразием по углеводной специфичности и, что немаловажно, малым токсическим действием на макроорганизм. Специфически связываясь с углеводной детерминантой клеточной поверхности, лектины способны не только блокировать воздействие на клетку тех или иных неблагоприятных факторов, но и специфически активизировать внутриклеточные метаболические процессы, т.е. изменять функциональное состояние клеток и тканей (Луцик, 1985; Мухачёва, 2004; Абросимова, 2006). Являясь биологически активными веществами, бактериальные лектины потенциально могут обладать иммуномодулирующими свойствами, что и было показано в работах ряда авторов (Никитина и др., 2002; Тихомирова и др. 2003; Тихомирова, 2005).
Наиболее актуальным является направление исследований, связанное с изучением про воспалительных цитокинов. Из литературных данных известно, что в иммунном ответе на ряд инфекционных агентов огромную роль играют начальные этапы инфекционного процесса, связанные с формированием острой фазы воспалительной реакции, опосредованной синтезом провоспалительных цитокинов (Фрейдлин, 1995; Сепиашвили,
7 2003; Agace, 1993; Yao, 1995). Основными продуцентами провоспалительных
цитокинов в организме являются клетки моноцитарно-фагоцитарной
системы. Чрезвычайный интерес в настоящее время представляет проблема
! коррекции иммунного статуса, в том числе и с участием бактериальных
лектинов. Однако, сведений о влиянии лектинов микробного происхождения
на продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами в изученной
литературе обнаружено не было. Поэтому, исследование влияния лектина
Paenibacillus polymyxa 1460 на синтез провоспалительных цитокинов
является интересной и актуальной задачей.
Цель работы состояла в исследовании in vivo и in vitro влияния лектина ЛИ P.polymyxa 1460 на синтез провоспалительных цитокинов макрофагами при фагоцитозе бактерий и инфекционном процессе.
Задачи исследования:
Изучить синтез провоспалительных цитокинов перитонеальными и альвеолярными макрофагами интактных мышей при фагоцитозе бактерий in vitro.
Изучить влияние бактериального лектина ЛИ P.polymyxa 1460 in vivo на синтез провоспалительных цитокинов макрофагами мышей при фагоцитозе бактерий.
Провести сравнительный анализ действия лектина ЛИ P.polymyxa 1460 на синтез провоспалительных цитокинов при фагоцитозе грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Исследовать взаимодействие лектина ЛИ P.polymyxa 1460 in vitro с поверхностными рецепторами альвеолярных и перитонеальных макрофагов и выявить цитокинсинтезирующую активность в этих условиях. .
5. Оценить цитокиновый статус организма экспериментальных животных при моделировании стафилококковой, эшерихиозной и иерсиниозной инфекции на фоне действия лектина ЛИ P.polymyxa 1460.
8 Научная новизна
Впервые in vivo и in vitro изучено влияние лектина ЛИ, выделенного с поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий P.polymyxa 1460, специфичного к галактозамину, глюкуроновой кислоте, фруктозе-1,6-дифосфату, глюкозамину, на синтез провоспалительных цитокинов перитонеальными и альвеолярными макрофагами при фагоцитозе бактерий. Показано, что введение лектина мышам усиливает синтез макрофагами интерлейкина-1 (ИЛ-1) и фактора некроза опухоли-а (ФНО-а) при фагоцитозе in vitro бактерий Staphylococcus aureus 1006 и Escherichia coll Ca 53, но снижает при фагоцитозе Yersinia enterocolitica 295-82.
Установлено снижение содержания ИЛ-1 и ИЛ-6 в сыворотке крови экспериментальных животных при стафилококковой, эшерихиозной, иерсиниозной инфекции и ФНО-а при стафилококковой инфекции на фоне действия лектина.
Показано, что специфическое взаимодействие лектина ЛИ P.polymyxa 1460 с поверхностными рецепторами альвеолярных и перитонеальных макрофагов способствует изменению продукции цитокинов.
Практическая значимость
Полученные данные вносят существенный вклад в познание спектра биологической активности бактериальных лектинов и открывают перспективы их возможного использования в биологии и экспериментальной медицине.
По материалам диссертационной работы написаны методические рекомендации для студентов старших курсов и аспирантов, специализирующихся в области микробиологии «Изучение влияния лектинов бацилл на синтез цитокинов макрофагами» (в соавторстве с Е.И. Тихомировой, О.В. Кочергиной, Е.С. Мухачёвой и Л.В. Карпуниной), рекомендованные учебно-методической комиссией и одобренные Учёным советом биологического факультета СГУ (протокол №2 от 4 ноября 2003 г.). Материалы диссертационной работы нашли применение при чтении лекций
9 по курсу «Микробиология» для студентов и аспирантов Саратовского
государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова, по курсу
«Молекулярная иммунология» для студентов биологического факультета
Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Введение лектина ЛИ P.polymyxa 1460 мышам неоднозначно влияет на
способность макрофагов к синтезу ИЛ-1, ФНО-а при фагоцитозе in vitro
разных видов бактерий: цитокинсинтезирующая активность усиливается при
фагоцитозе S.aureus 1006 и Е.соН Са53, но снижается при фагоцитозе
Y.enterocolitica 295-82.
2. Лектин ЛИ P.polymyxa 1460 специфически взаимодействует с
поверхностными структурами альвеолярных и перитонеальных макрофагов,
изменяя их цитокинсинтезирующую активность.
3. Лектин ЛИ способствует снижению в сыворотке крови мышей ИЛ-1 и
ИЛ-6 при стафилококковой, эшерихиозной, иерсиниозной инфекции, ФНО-а
- при стафилококковой инфекции.
Апробация работы:
Материалы диссертации были представлены на: втором конгрессе «Научная молодёжь на пороге XXI века» (Россия, Томск, 2001); третьем конгрессе «Науки о человеке» (Россия, СГМУ, Томск, 2002); Международной научно-практической школы-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Россия, Санкт-Петергбург, 2002); первой и второй региональных конференциях молодых учёных: «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Россия, ИБФРМРАН, Саратов, 2002; 2004); межрегиональной научной конференции молодых учёных и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа (Россия, Саратов, 2003); объединённом иммунологическом форуме (Россия, Екатеринбург, 2004); конференциях профессорско-преподавательского
10 состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 2002, 2003, 2004 гг. (СГАУ им, Н.И. Вавилова, Саратов), региональной конференции молодых учёных «Вавиловские чтения - 2005» (Россия, Саратов, 2005); международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Россия, Ульяновск, 2006).
Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы, переименованной впоследствии с 20.09.2006 г. в кафедру микробиологии, вирусологии и иммунологии факультета ветеринарной медицины Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» в рамках научно-исследовательской темы: «Изучение биологически-активных веществ (лектинов) в регуляции метаболизма растений и животных».
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 работ.
Структура и объём работы
Диссертация состоит из введения, двух глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 123 страницах, иллюстрирована 22 рисунками и содержит 1 таблицу. Список использованных литературных источников включает 148 наименований, в том числе 66 зарубежных.
Лектины и их биологическая активность
Наряду с анализом генетической гетерогенности для типирования N. gonorrhoeae использован новый развивающийся подход, обозначенный нами как прямое белковое профилирование с использованием MALDIOF масс-спектрометрического анализа. Терминология в этой области ещё не устоялась, и в англоязычной литературе этот подход имеет разные названия: "Intact-cell mass-spectrometry", "Whole-cell mass-spectrometry" и др. [152, 156, 166, 167]. Все эти формулировки стараются подчеркнуть стремление к прямому использованию масс-спектрометрии для анализа целой клетки, т.е. без сложных процедур фракционирования, выделения и очистки отдельных клеточных компонентов. Напомним, что суть метода заключается в получении масс-спектра сложной смеси биомолекул (в частности, белков), характеризующего микроорганизм как вид или какое-либо его метаболическое состояние. Применение MALDIOF масс-спектрометрического анализа для характеристики микробной клетки уже анонсировано, например, для идентификации микобактерий [154], представителей семейства Enterobacteriaceae [151], типирования штаммов бетагемолитических стрептококков [155]. В ряде работ предлагается использовать различные матричные растворы и методики подготовки образца бактериальной культуры для масс-спектрометрического анализа [152, 154, 165], в которых демонстрируются результаты разной степени качества и информативности. Поэтому для исследования возможностей прямого белкового профилирования N. gonorrhoeae с помощью MALDIOF масс-спектрометрического анализа на первом этапе была отработана методика пробоподготовки с использованием лабораторного штамма Е. coli DH5a. В ходе тестирования трех матричных растворов показано, что использование в качестве матрицы сс-СНСА позволяет получить максимально гомогенную структуру и форму кристаллов в сравнении с двумя другими матрицами. Эта особенность играет важную роль при сохранении от спектра к спектру необходимой точности измерения масс, а также имеет решающее значение для успешного снятия масс-спектров в автоматическом режиме, с использованием алгоритма AutoExecute (Bruker Daltonics, Германия). По разработанному протоколу накоплены масс-спектры лабораторного штамма Е. coli DH5a, причём в анализ включены образцы, полученные в разное время в процессе трёх независимых культивирований. Анализ показал хорошую воспроизводимость 22 пиков в спектре, из которых 16 удалось соотнести с бактериальными белками. Таким образом, качественный состав полученных нами белковых масс-спектров соотносился с аналогичными данными, полученными ранее для штамма Е. coli К-12 (также с использованием а-СНСА в качестве матрицы). В исследовании Ryzhov и Fenselau было показано преобладание рибосомальных белков в составе регистрируемого масс-спектра, что, вероятно, связано с их локализацией в цитозоле (в отличие, от мембранных белков), присутствием в клетке в достаточно большом количестве, относительно небольшой массой, а также основностью большей части из них, ионизации и десорбции которых способствуют условия кислой экстракции и масс-спектрометрического анализа в режиме положительных ионов [166].
Аналогичные результаты получены при прямом масс-спектрометрическом анализе белковых экстрактов лабораторного штамма N. gonorrhoeae АТСС 49226, для которого также накоплена серия масс-спектров, проведен их качественный и количественный анализ. При рассмотрении набора регистрируемых значений m/z, проводили поиск в базе данных близких по значению масс известных белков гонококка, оценивали дисперсию значений m/z, относительных интенсивностей соответствующих пиков в спектре, и анализировали частоту регистрации каждого из пиков (табл. 4).
Пороговое значение частоты регистрации пика (f 0,7) введено с целью ограничения области анализа некоторым набором стабильно регистрируемых пиков, который в данном случае составил 20 значений m/z, 12 из которых удалось соотнести с массами рибосомальных белков бактерии.
Лектины - это группа белков неиммунного происхождения, обладающих общим свойством обратимо и избирательно связывать углеводы и углеводные детерминанты биополимеров без изменения их ковалентной структуры (Kocourek, Horejsi, 1983; Луцик, Детюк, Луцик, 1989). Согласно этому определению, к лектинам относятся не только поливалентные белки, способные агглютинировать клетки или преципитировать глюкоконъюгаты, но также и некоторые моновалентные белки из растительных и бактериальных токсинов (Лахтин, 1986). Специфическое связывание лектинов с углеводными рецепторами клеточных поверхностей является одним из видов углевод- белкового узнавания, которое играет большую роль в межклеточных контактах, в формировании многоклеточных организмов и межвидовых сообществ как симбиотических, так и паразитических (Линевич, 1979). В тканях человека и животных различают следующие основные типы гликоконьюгантов, которые могут выполнять функцию рецепторов лектинов: гликопротеины, гликолипиды, протеогликаны. Лектины проявляют выраженное сродство к макромолекулярным соединениям чисто углеводной природы - гликозаминогликанам и гомогликанам. Лектины классифицируют в зависимости от источника их выделения, соотношения белковой и углеводной частей, фиксированности на мембранах, специфичности к углеводам, в частности к моносахаридам, олигосахаридам и антигенным структурам (Луцик, Детюк, Луцик, 1989).
Прово спал ительные цитокины
Провоспалительные цитокины продуцируются, секретируются и действуют через свои рецепторы на иммунокомпетентные клетки на ранней стадии воспалительного ответа, участвуют в запуске специфического иммунного ответа и эффекторной его фазы. В эту группу включают ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-І2, ИЛ-18, ФНО-а, ИФ-а, МСР-1 (моноцитарный хемотаксический протеин), MIF (миграциюингибирующий фактор).
Контакт с возбудителем является сигналом секреции моноцитами/макрофагами провоспалительных цитокинов ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ФНО-а. Аутокринная стимуляция макрофагов этими цитокинами сопровождается продукцией и секрецией и других биологически активных молекул: супероксидных и нитроксидных радикалов, простогландинов, леикотриенов, а также индукцией экспрессии адгезивных молекул на поверхности фагоцитов. Мишенями паракринного действия про воспалительных цитокинов становятся эндотелиальные клетки кровеносных сосудов, на которых индуцируется экспрессия адгезивных молекул, связывающих циркулирующие нейтрофилы и моноциты. Этим обеспечивается приток циркулирующих нейтрофилов, а затем и моноцитов в очаг инфекции. Провоспалительные цитокины ИЛ-1, ФНО-о: в наномолярных концентрациях паракринно стимулируют экспрессию генов хемокинов ИЛ-8, МСР-1 и генов адгезивных молекул у эндотелиальных клеток. ИЛ-8 может функционировать как ангиогенный фактор. Между отдельными провоспалительными цитокинами наряду с синергизмом существуют довольно сложные взаиморегулирующие отношения. В частности, ИЛ-6 аутокринно ингибирует продукцию макрофагами ИЛ-1 и ФНО-о, которые являются активными индукторами синтеза ИЛ-6.
Моноциты/макрофаги способны продуцировать и секретировать более 100 различных молекул. За последние годы в центре внимания исследователей оказались секретируемые моноцитами и макрофагами цитокины, получившие собирательное название «монокины» (Тотолян, Фрейдлин, 2000).
Интерлейкин 1
Впервые этот медиатор описан в 1970 г. и был назван лимфоцитактивирующим фактором (Bach, Alter, Solliday, 1970). Название «интерлейкин-1» было впервые дано макрофагальному лимфоцитарному фактору, выполнявшему роль посредника между различными типами лейкоцитов, на Втором Международном рабочем совещании по лимфокинам, проходившем в Эрмантинге (Швейцария) в 1979 г, (Козлов, Громыхина, 1987; Петров и др., 1987). Провоспалительный цитокин ИЛ-1 - это яркий пример полифункционального цитокина, обладающего широким спектром провоспалительной, метаболической, физиологической, гемопоэтической и иммунологической активности. Источником его могут быть нейтрофилы, клетки микроглии, эндотелия, гладкомышечные клетки, фибробласты, кератиноциты, Т- и В-лимфоциты, NK-клетки, купферовские клетки в печени, клетки Лангерганса в эпидермисе; но в основном он синтезируется моноцитами и макрофагами (Lord et al, 1981; Fontana et al, 1983; Hanson, Murphy, 1984; Sauder, Dinarello, Morhen, 1984). ИЛ-1 продуцируют до 90 % моноцитов периферической крови человека и до 40-60 % тканевых макрофагов.
В настоящее время под названием ИЛ-1 объединены два полипептида с молекулярной массой 18 кД, обозначенные как ИЛ-1а и ИЛ-13 (является основной секретируемой формой ИЛ-1). Пептиды имеют гомологичными 26% аминокислот, обладают идентичным спектром биологической активности и связываются с общим рецептором (Marh et al., 1985; Зайчик, Чурилов, 2001). За редким исключением, ИЛ-1 а и ИЛ-1 /3 обладают практически идентичной активностью, поэтому далее не делается различий между ними в описании биологических свойств. Различия в биологической роли ИЛ-Ісх и ИЛ-1/3 обусловлены особенностями их продукции клетками. Если ИЛ-1а является, главным образом, медиатором местных защитных реакций, очень незначительно секретируясь в окружающую среду и существуя в основном в виде мембранной формы, то ИЛ-1/3 представляет собой секреторный цитокин, осуществляющий своё действие как местно, так и на системном уровне (Симбирцев, 1998).
Выделение, очистка и использование лектина ЛП Paenibacillus polymyxa 1460
Клетки P. polymyxa 1460 выращивали в течение 72 часов при температуре 28 С на синтетической среде Moore (1963) (на 1000 мл дистиллированной воды 20 г глюкозы; 1г К2НРО4; 0,5 г MgS04x7 Н20; 0,1 г FeCl3 6 Н20; 0,02 г Na2Mo04x2 Н20; 0,01 % дрожжевого экстракта).
Биомассу клеток P. polymyxa 1460 осаждали центрифугированием (6000 g, 10 минут), многократно пропускали через иглу шприца диаметром 0,1 мм в 1 % растворе NaCl. Неочищенный агглютинин получали путем осаждения белка 2 объемами ацетона, диализировали против дистиллированной воды в течение 15-20 часов и очищали методом гель-фильтрации на колонке размером 25x1,5 см, в качестве носителя использовали Toyopearl HW-55. Белок с колонки элюировали 0,05н глицин-НС1 буфером (рН 3,0). Выход белковых фракций регистрировали с помощыо Uvicord SII (LKB) при 280 им, спектрофотометра СФ-26, спектрофлюориметра «Флюорат-02 Панорама» в диапазоне длин волн 265 -280 нм (Мельникова, 2000; Карпунина, 2002). Количественное содержание белка определяли по методу М. Bradford (1976).
При моделировании процесса фагоцитоза лектин в концентрации 0,4 мкг/мл вводили по 0,2 мл внутрибрюшинно беспородным белым мышам-самцам весом - 18-20 г, возрастом - 2-3 месяца. Исследования проводили через 1, 3, 5 и 7 суток после введения лектина (ориентируясь на основные этапы иммунологической перестройки в организме). При моделировании инфекционного процесса in vivo лектин в концентрации 0,4 мкг/мл вводили белым мышам по 0,2 мл внутрибрюшинно за 24 часа и через 1 час после заражения.
При исследовании in vitro действия лектина, блокированного специфическими углеводами, лектин концентрацией 0,004 вносили в пробирки по 100 мкл.
Альвеолярные (АМФ) и перитонеальные (ПМФ) макрофаги выделяли из лёгких и брюшной полости на 1,3, 5 и 7 сутки после введения лектина.
Перитонеальные макрофаги забирали из брюшной полости мышей, альвеолярные макрофаги получали из лёгких мышей по общепринятой методике (Лимофоциты:..., 1990; Кондратьева, Воробьёва, Буракова, 2001). Мышей умерщвляли транслокацией шейных позвонков и, не вскрывая, в брюшную полость стерильным шприцем вводили среду с 0,5 % гидролизата лактоальбумина, затем забирали экссудат и переносили в центрифужные пробирки и получали ПМФ.
Для выделения АМФ мышь вскрывали, целиком удаляли легкие и помещали их в стерильную чашку Петри со средой с 0,5 % гидролизата лактальбумина. Затем тщательно измельчали ножницами, полученную взвесь собирали пипеткой и пропускали через нейлоновый фильтр в центрифужные пробирки.
Суспензии АМФ и ПМФ центрифугировали 15 минут при 600 g. После центрифугирования надосадочную жидкость сливали, а центрифугат заливали средой с 0,5 % гидролизата лактальбумина, затем проводили моделирование процесса фагоцитоза.
Для культивирования перитонеальных и альвеолярных макрофагов использовали среду с 0,5 % гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса, рН 7,0 производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва.
Число жизнеспособных клеток определяли методом эксклюзии трипанового синего. В равном соотношении смешивали 0,1 % раствор трипанового синего и 0,1 % раствор эозина. В 0,5 мл полученного красителя добавляли 0,1. мл суспензии клеток в концентрации 5-Ю млн клеток. Заполняли камеру Горяева и просчитывали 100 клеток. Живые клетки были бесцветны и опалесцировали, мёртвые - имели синевато-фиолетовый цвет вследствие проникновения красителя через повреждённую мембрану. Взвесь клеток считалась жизнеспособной, если мёртвые клетки составляли не более 10-13 % (Лимфоциты:..., 1990; Кондратьева, Воробьёва, Буракова, 2001). Для моделирования процесса фагоцитоза брали среду с 0,5 % гидролизата лактальбумина.
В качестве объекта фагоцитоза использовали суточные культуры штаммов; S.aureus 100 б, как пример грамположительных бактерий; E.coli Са52 и Y.enterocolitica 295-82, как пример грамотрицательных микроорганизмов.
В стерильную пробирку с макрофагами и средой с 0,5 % гидролизата лактальбумина вносили исследуемые культуры из расчёта 1 макрофаг - 50 микробных клеток. Пробирки инкубировали в термостате на 37 С в течение 30 минут, 1, 6, 12 и 24 часов; затем содержимое центрифугировали при 600 g и супернатант использовали для определения цитокинов (Кондратьева, Воробьёва, Буракова, 2001).
При моделировании инфекционного процесса использовали суточные культуры S.aureus 209-Р, E.coli 01 и Y.enterocolitica 12. Бактерии вводили белым мышам по 0,2 мл внутрибрюшинно в дозе 5 тыс. микробных клеток/мл. Лектин в концентрации 0,4 мкг/мл вводили белым мышам по 0,2 мл внутрибрюшинно за 24 часа и через 1 час после заражения. Через 1, 6 и 24 часа мышь умерщвляли транслокацией шейных позвонков, брали кровь из сердца, получали сыворотку по общепринятой методике (Кондратьева, Воробьёва, Буракова, 2001) и определяли в ней содержание провоспалительных цитокинов ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-о.
Провоспалительные цитокины ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-а, продуцируемые макрофагами в процессе фагоцитоза, определяли с помощью тест-систем иммуноферментных моноклональных, разработанных Государственным научно-исследовательским институтом особо чистых биопрепаратов (г. Санкт-Петербург) и производимых фирмами АО «Иммунодиагностика» (г. Санкт-Петербург) и ТОО «Протеиновый контур» (г. Санкт-Петербург). Действие тест-систем основано на «сендвич»-методе твердофазного иммуноферментного анализа с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента.
Определение ИЛ-Іо; ИЛ-6, ФНО-а осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя тест-систем, результаты учитывали на Multiskan Plus version 2.01 при длине волны 490 нм для ИЛ-1, 492 нм для ФНО-а и 450 нм для ИЛ-6. По значениям оптической плотности стандартных образцов строили калибровочные кривые и с учетом оптической плотности образцов определяли концентрации цитокинов.
Определение синтеза провоспалительных цитокинов макрофагами интактных мышей при фагоцитозе бактерий
Дальнейшие исследования были посвящены изучению влияния лектина ЛИ P.polymyxa 1460 на синтез цитокинов макрофагами в процессе фагоцитоза грамположительных бактерий. Представлялось целесообразным провести сравнительный анализ действия лектина ЛИ P.polymyxa 1460 на синтез провоспалительных цитокинов при фагоцитозе грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Отсутствие данных о влиянии бактериальных лектинов на синтез цитокинов макрофагами при фагоцитозе грамположительных бактерий определило наш интерес - посмотреть влияние лектина бацилл на синтез ИЛ-1 и ФНО-а в процессе фагоцитоза клеток клинического штамма S.aureus 1006. Данная культура была выбрана нами как наиболее часто встречающийся возбудитель внутрибольничных инфекций. Ранее было показано, что лектин P.polymyxa 1460 оказывал сильное стимулирующее воздействие на активность адгезии S.aureus 1006 при фагоцитарном процессе (Кочергина и др., 2002). Это было объяснено тем, что бактериальный лектин, являясь лектином-гликопротеином, специфичным в том числе и к галактозамину, мог связываться с соответствующими углеводными лигандами, имеющимися на поверхности стафилококка, либо с углеводами, находящимися на поверхности макрофагов.
Изучение влияния лектина бацилл на синтез провоспалительных цитокинов проводили на 1, 3, 5 и 7 сутки после введения мышам лектина. Макрофаги, выделенные из организма мышей через сутки после введения лектина использовали при моделировании фагоцитоза ш vitro, определяли содержание цитокинов ФНО-а и ИЛ-1 в супернатанте на разных стадиях фагоцитоза.
Достоверные результаты (р 0,01) были получены для ФНО-а, продуцируемого макрофагами через 30 минут, 1 и 6 часов инкубации с бактериями. При определении в супернатанте цитокина было установлено, что его содержание во всех пробах превышало контрольные значения: ФНО-а продуцировался макрофагами через 30 минут процесса фагоцитоза бактериальных клеток в концентрации 50 пг/мл и 100 пг/мл (для АМФ и ПМФ, соответственно), а к б часам содержание ФНО-а увеличилось до 150 пг/мл и 200 пг/мл (для АМФ и ПМФ соответственно).
Отмечено также значительное увеличение продукции макрофагами ИЛ-1 (р 0,05). Данный цитокин продуцировался АМФ в концентрации 150 пг/мл через 30 минут процесса фагоцитоза, что значительно превышало контрольные значения. Продукция перитонеальными макрофагами ИЛ-1 через 30 минут после начала фагоцитоза достигала 100 пг/мл, а к 6 часам фагоцитоза составляла 150 пг/мл. Эти данные представлены на рисунке 4.
Макрофаги, выделенные из организма мышей на 3 сутки после введения лектина, были способны к продукции цитокинов до инкубации с бактериальными клетками. Так, например, при исследовании синтеза цитокинов альвеолярными макрофагами, была обнаружена их способность к синтезу ФНО-а в значениях больше контрольных до начала фагоцитоза in vitro. Через 30 минут и 1 час инкубации альвеолярных макрофагов с бактериальными клетками этот цитокин продуцировался в концентрации 100 пг/мл, а к 6 часам его продукция увеличилась до 150 пг/мл. Синтез ФНО-а перитонеальными макрофагами был выше контрольных значений через 30 минут и 1 час фагоцитоза (150 пг/мл) и к 6 часам достиг концентрации 200 пг/мл.
Данные этого эксперимента позволили установить, что до инкубации с бактериальными клетками продукция ИЛ-1 макрофагами была выше контрольных значений и составляла 100 пг/мл и 150 пг/мл (ПМФ и АМФ соответственно), а в процессе фагоцитоза уменьшалась до контрольных значений. Данные эксперимента представлены на рисунке 5.
Альвеолярные макрофаги, выделенные через 5 суток после введения лектина, были способны к продукции ФНО-а ещё до начала фагоцитоза in vitro выше контрольных значений (150 пг/мл). Однако, затем, к 30 минутам и 1 часу процесса фагоцитоза бактериальных клеток содержание цитокина снижалось до 100 пг/мл и продолжало уменьшаться к 6 часам фагоцитоза, когда концентрация ФНО-а в супернатанте составила всего 50 пг/мл. Синтез ФНО-а ПМФ также незначительно превышал контрольные значения через 30 минут и 1 час процесса фагоцитоза, а к 6 часам находился на уровне контроля (рис. 6).
При изучении продукции ИЛ-1 макрофагами, выделенными на 5 сутки, было обнаружено, что синтез данного цитокина превышал контрольные значения ещё до начала фагоцитоза и составлял 100 пг/мл. Через 1 час после начала фагоцитоза in vitro продукция данного цитокина увеличилась до 150 пг/мл, к 6 часам ИЛ-1 синтезировался перитонеальными макрофагами на том же уровне, тогда как альвеолярные макрофаги снизили продукцию до 100 пг/мл, что, тем не менее, было выше контроля.
При исследовании синтеза цитокинов альвеолярными и перитонеальными макрофагами мышей через 7 суток после введения им лектина была обнаружена способность к продукции ФНО-а и ИЛ-1 в концентрации больше контрольных значений до начала фагоцитоза in vitro клеток S.aureus 1006. Однако, в процессе фагоцитоза бактериальных клеток наблюдалась общая тенденция к снижению синтеза цитокинов на 7 сутки по сравнению с 1,3 и 5 сутками после введения лектина (рис. 7).
![Коррекция прокоагулянтной и протеолитической активности фагоцитов у больных с посттравматическим гемотораксом [Электронный ресурс]](/i/i/4248/190233.png "Коррекция прокоагулянтной и протеолитической активности фагоцитов у больных с посттравматическим гемотораксом [Электронный ресурс] Носов Сергей Степанович")