Введение к работе
Актуальность. Дистальные отделы кишечника являются средой обитания для многочисленного и разнообразного сообщества микроорганизмов. Количество бактерий только в одном грамме содержимого толстой кишки достигает 1012 микробных клеток. Преобладающие в количественном отношении в этой экосистеме бактерии принадлежат к порядкам Bacteroidales (тип Bacteroidetes, класс Bacteroidia) и Clostridiales (тип Firmicutes, класс Clostridia) и роду Bifidobacterium (тип Actinobacteria, класс Actinobacteria, порядок Bifidobacteriales) (Hayashi et al., 2002, Qin et al., 2010). К порядку Bacteroidales относятся строго анаэробные неспорообразующие грамотрицательные палочки. Исследования последнего времени показывают, что, колонизируя кишечник, эти бактерии участвуют в метаболизме сложных полисахаридов, модулируют местный иммунный ответ и препятствуют заселению кишечника патогенными микроорганизмами (Xu и Gordon, 2003, Martens et al., 2009). С другой стороны, в случае транслокации из кишечника во внутренние, стерильные в норме, среды организма, бактерии этой таксономической группы могут вызывать тяжелые анаэробные инфекции (Wexler, 2007).
Однако, несмотря на доминирующее положение занимаемое бактериями порядка Bacteroidales в кишечнике человека наши представления о их видовом составе остаются ограниченными. Это, в свою очередь, связано с недостаточной информативностью используемых для решения этой задачи конвенциональных микробиологических методов, которые основаны, прежде всего, на изучении относительно небольшого спектра фенотипических свойств бактериальных штаммов, изолируемых из биологического материала (Song et al., 2005).
Активное внедрение молекулярно-генетических методов в практику микробиологических исследований позволило получить новую информацию о составе и свойствах микроорганизмов колонизирующих различные анатомические области тела человека (Eckburg et al., 2005, Tringe et al., 2008, Woo et al., 2008, Karlsson et al., 2011). Так, в последние годы была разработана целая палитра методов, основанных на сравнительном анализе видоспецифичных нуклеотидных последовательностей геномной ДНК бактерий, позволяющих быстро и достоверно определять таксономическую принадлежность выделяемых микроорганизмов (Olsen et al., 1993, Stubbs et al., 2000, Deng et al., 2007).
В этой связи, очевидна актуальность привлечения методов молекулярно-генетической идентификации для выяснения таксономической принадлежности бактерии порядка Bacteroidales кишечного происхождения.
Отдельным важным направлением исследований бактерий порядка Bacteroidales является изучение их генетических свойств (Salyers et al., 2000). В частности большой интерес представляют широко распространенные среди Bacteroides spp. разнообразные мобильные генетические элементы (инсерционные последовательности, транспозоны) и плазмиды (Smith et al., 1998, Soki et al., 2010). Поиск и физическое картирование таких элементов на уровне определения нуклеотидных последовательностей с их последующим сравнительным анализом и идентификацией генов и сis-элементов, ответственных за автономную репликацию, а затем и конструирование на их основе клонирующих векторов позволит создать инструментальную базу, необходимую для дальнейшего изучения генетики бактероидов и манипулирования их свойствами при помощи генно-инженерных методов.
Цель настоящего исследования: изучить видовой состав бактерий порядка Bacteroidales в микрофлоре кишечника у здоровых людей разного возраста, а также провести поиск и анализ плазмидных ДНК у выделенных штаммов бактерий этого порядка.
Задачи исследования:
-
Провести сравнительный анализ качественного и количественного состава бактерий порядка Bacteroidales, колонизирующих кишечник здоровых людей разных возрастных групп с использованием молекулярно-генетических методов.
-
Провести поиск плазмидных ДНК в штаммах бактерий порядка Bacteroidales, выделенных из кишечника здоровых людей.
-
Определить полную нуклеотидную последовательность избранной плазмиды и проанализировать ее методами биоинформатики.
-
Провести поиск генов, гомологичных обнаруженным на изученной плазмиде, среди других штаммов бактерий порядка Bacteroidales ,выделенных у здоровых людей.
-
Создать челночный клонирующий вектор E.coli-Bacteroides и оценить его способность к конъюгативному переносу из штамма E.coli в штамм Bacteroides sp.
Научная новизна. Впервые показано, что кишечник здоровых людей в высокой концентрации колонизируют не только бактерии рода Bacteroides, но и представители других родов порядка Bacteroidales, таких как Alistipes, Parabacteroides, Barnesiella, Odoribacter и Prevotella.
Впервые показано, что бактерии недавно охарактеризованного вида Bacteroides xylanisolvens являются доминирующими в кишечнике людей разного возраста. Впервые установлено, что представители рода Alistipes чаще колонизируют кишечник взрослых людей, чем детей раннего возраста.
Впервые показано, что 40,5% штаммов бактерий порядка Bacteroidales, выделенных из кишечника клинически здоровых детей, являются носителями плазмидных ДНК. Определена и аннотирована полная нуклеотидная последовательность новой плазмиды pBUN24, выделенной из штамма Bacteroides uniformis, которая является первой полностью просеквенированной плазмидой этого вида бактероидов. На основе pBUN24создан челночный клонирующий вектор E coli–Bacteroides, способный к автономной репликации в обоих типах хозяйских клеток.
Личный вклад Кулагиной Е.В. в получение научных результатов. Кулагина Е.В. непосредственно участвовала в выполнении всех этапов настоящей работы, в том числе проводила посев клинического материала, выделение и идентификацию штаммов бактерий порядка Bacteroidales, выделение и анализ плазмидных ДНК, создание челночного клонирующего вектора E.coli–Bacteroides, а также обработку полученных данных при помощи статистических методов и методов биоинформатики.
Практическая значимость работы. Создана коллекция, содержащая 119 штаммов бактерий порядка Bacterodales, выделенных из кишечника здоровых людей, включающая 21 вид микроорганизмов этого порядка. Видовая принадлежность полученных штаммов определена при помощи достоверных молекулярно-генетических методов.
Полученные сведения о возрастных особенностях видового состава бактерий порядка Bacteroidales в кишечнике у человека могут быть использованы в различных областях здравоохранения для оценки микробиологического статуса здоровых людей или пациентов с различной патологией.
Примененный для видовой идентификации бактерий порядка Bacterodales оригинальный протокол метода ARDRA может быть использован в рутинной практике идентификации анаэробных грамотрицательных споронеобразующих палочковидных бактерий.
Созданный в ходе настоящего исследования челночный клонирующий вектор E.coli–Bacteroides может быть использован в рамках фундаментальных и прикладных исследований, направленных на изучение генетики бактероидов и получение штаммов с заданными свойствами.
Положения, выносимые на защиту:
-
Наиболее часто в микрофлоре кишечника у здоровых людей разных возрастных групп среди представителей порядка Bacteroidales встречаются бактерии видов Bacteroides xylanisolvens, B.vulgatus и B.uniformis. Однако наряду с ними в высокой концентрации выделяются также представители родов Alistipes, Parabacteroides, Barnesiella, Odoribacter и Prevotella.
-
Штаммы бактерий порядка Bacteroidales, колонизируюшие кишечник здоровых людей, с частотой 40,5% являются носителями плазмидных ДНК.
-
Плазмида pBUN24, выделенная из B.uniformis, не имеет охарактеризованных гомологов среди плазмид бактерий порядка Bacteroidales и несет ряд генов, кодирующих белки, обеспечивающие репликацию и мобилизацию плазмиды, а также белки системы токсин-антитоксин.
-
Челночный клонирующий вектор E.coli –Bacteroides, обладает способностью к репликации в обоих типах хозяйских клеток и может быть использован для генетической трансформации B.vulgatus.
Внедрение результатов исследования. Предложенный в настоящей работе протокол метода ARDRA применяется в практической работе на кафедре микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова для видовой идентификации анаэробных бактерий. Штаммы, выделенные в ходе настоящей работы, используются сотрудниками кафедры микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова для изучения биологических свойств бактерий порядка Bacteroidales. Сконструированный в ходе настоящей работы челночный клонирующий вектор E.coli-Bacteroides применяется в работе кафедры микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова для изучения генетики бактероидов.
Результаты исследования включены в материалы лекционного курса и практических занятий для студентов 2-3 курсов лечебного и педиатрического факультетов на кафедре микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены на заседании научной конференции кафедры микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова 21 апреля 2011 г. протокол №10, на заседаниях секции гнотобиологии Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в 2009 и 2010 гг., а также на VI международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на русском языке, на 118 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Библиография включает 169 наименований работ, 7 отечественных и 162 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 12 таблицами.
