Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
Микрофлора кишечника и ее роль в обеспечении состояния здоровья организма-хозяина
Глава 2. Микробные биопрепараты в системе мер по коррекции бактериоценоза кишечника при дисбактериозах
Глава 3. Обезьяны как модель для изучения разных форм клинической патологии человека
Часть 2. Собственные исследования
Глава 4. Материалы и методы
4.1. Методы выделения и культивирования изучаемых микроорганизмов
4.2. Методы изучения антагонистической активности свежевыделенных и лабораторных штаммов би-фидобактерий
4.3. Методика изучения активности кислотообразования
4.4 Методика инструментального забора проб для бактериологического исследования содержимого желудка
4.5. Методы статистической обработки результатов исследований
4.6. Общий объем выполненных исследований.
Глава 5. Показатели микрофлоры кишечника обследованных обезьян разных видов и разных возрастных групп
5.1. Видовой и возрастной состав наблюдаемых животных
5.2. Результаты бактериологических исследований содержимого толстой кишки обезьян в разных наблюдаемых группах
5.3. Видовой состав выделенных штаммов бифидо-бактерий в разных возрастных группах обезьян разных видов
5.4. Результаты бактериологических исследований содержимого желудка у клинически здоровых обезьян карантинной группы
Глава 6. Характеристика штаммов бифидобактерий, выделенных при исследованиях микрофлоры ки шечника обезьян
6.1. Интенсивность роста и морфология колоний би-фидобактерий при культивировании в кукурузно-лактозной питательной среде 58
6.2. Антагонистическая активность свежевыделенных штаммов бифидобактерий в отношении эталонных тест-культур 59
6.3. Активность кислотообразования 63
Глава 7. Разработка способов коррекции микрофлоры ки шечника при дисбактериозах у обезьян с применением новых биологических препаратов .. 64
7.1. Изучение коррекционной активности культуры бифидобактерий штамма B.adolescentis.... 64
7.2. Доклиническое изучение комплексного имму-ноглобулинового препарата КИП при диарейных заболеваниях у обезьян 70
Заключение 73
Выводы 84
Список литературы 86
Приложение 107
- Микробные биопрепараты в системе мер по коррекции бактериоценоза кишечника при дисбактериозах
- Методы выделения и культивирования изучаемых микроорганизмов
- Видовой и возрастной состав наблюдаемых животных
- Интенсивность роста и морфология колоний би-фидобактерий при культивировании в кукурузно-лактозной питательной среде
Введение к работе
Часть 1. Глава 1.
Обзор литературы
Микрофлора кишечника и ее роль в обеспечении
состояния здоровья организма-хозяина
Микробные биопрепараты в системе мер по коррекции бактериоценоза кишечника при дисбактериозах
Процесс становления симбиотической микрофлоры кишечника, свойственной здоровому человеку, начинается с первых часов жизни новорожденного. Наряду с лактобациллами и бифидобактериями, попадающими в пищеварительный тракт ребенка при прохождении через родовые пути, в его ротовую полость, а затем в кишечник поступают микроорганизмы из окружающей среды (12; 22; 48; 68; 120; 121; 158; 168).
Облигатно анаэробные бифидобактерии, в сочетании с менее многочисленными представителями биоценоза толстой кишки - лактобациллами и биологически полноценными эшерихиями (E.coli) большинством исследователей причисляются к защитной облигатной микрофлоре кишечника человека. Вместе с тем, видовой состав нормальной микрофлоры нельзя считать окончательно установленным, и ряд положений по этому вопросу носит дискуссионный характер, несмотря на длительную историю изучения (120; 122; 140; 144; 152; 153)..
Накоплен значительный экспериментальный и клинический материал, свидетельствующий об участии микрофлоры в ряде жизненно важных функций макроорганизма.
Одной из ведущих функций индигенной микрофлоры является ее участие в обеспечении колонизационной резистентности, под которой понимается защита от доступа патогенного начала к эпителиальным клеткам стенки кишечника и последующего его проникновения во внутреннюю среду организма-хозяина. В реализации этого феномена важное значение имеет защитный му-козный барьер кишечника, покрывающий сплошным слоем эпителиальные клетки и заполняющий пространства между ворсинками. Являясь продуктом совместного функционирования макроорганизма и симбиотической микрофлоры, этот барьер включает в себя слизь, продуцируемую клетками эпителия, секреторный иммуноглобулин A (S IgA), микробные клетки аутофлоры и их низкомолекулярные метаболиты. Микробные клетки мукозной флоры, за счет адгезии к эпителиальным клеткам кишечника, повышают колонизационную резистентность, конкурируя с патогенами за рецепторы эпителиальных клеток, препятствуя пенетрации ими слизистой и оказывая непосредственный антибактериальный эффект (3; 5; 7; 13; 15; 55; 104; 146).
Установлено участие бактерий нормальной микрофлоры в ферментативной деятельности пищеварительного тракта. Напротив, в организме безмикробных животных отмечены разнообразные отклонения от нормы в процессах переваривания пищи и общем обмене веществ. С функцией бактериоценоза кишечника связаны расщепление и утилизация пищевых веществ, продукция энзимов, участвующих в метаболизме белков, жиров, углеводов, нуклеиновых кислот, теплопродукция и терморегуляция, восполнение энергетических потребностей макроорганизма. Микрофлора способствует нормальному течению метаболических процессов в тканях макроорганизма. Макроорганизм широко использует продукты метаболизма бактерий-симбионтов (47; 68; 80; 105; 106; 120).
Симбиотическая микрофлора кишечника участвует в рециркуляции желчных кислот, холестерина, ряда макро- и микроэлементов (кобальт, цинк), всасывании солей кальция и железа, регулирует моторную активность толстой кишки, поддерживает водный, газовый, ионный гомеостаз организма, связывает и разрушает токсические субстанции, инактивирует избыток пищеварительных ферментов. Известно подавление микробами нормального биоценоза передачи неблагоприятной генетической информации, которую несут патогенные бактерии, и в частности разрушение факторов множественной лекарственной устойчивости и аллергенов (47; 68; 80; 115; 176).
Бактериальной флоре пищеварительного тракта приписывают определенное участие в синтезе витаминов. Обсуждается вопрос о включении в обмен веществ макроорганизма продуцируемых в кишечнике витаминов группы В, в частности В12, и других. Большое значение придается образованию р-аланина, необходимого для синтеза пантотеновой кислоты (витамина В3). В опытах на собаках выявлено выделение с мочой витамина В] (тиамина) в количествах., значительно превышающих его содержание в пище, что рассматривается как доказательство усвоения витамина, синтезированного бактериями кишечника. Имеются данные об участии нормальной микрофлоры кишечника в процессах обеспечения организма человека витамином К, фолиевой кислотой, рибофлавином и пиридоксином. Вместе с тем, ряд исследователей высказывает серьезные сомнения по поводу возможности утилизации макроорганизмом витаминов, синтезируемых бактериями симбиотической флоры. Эта позиция связана с распространенным мнением о невозможности всасывания витаминов из толстого кишечника у людей (68; 80; 120).
Наряду с витаминами, микроорганизмы симбиотической флоры продуцируют и такие биологически активные вещества, как бактериоцины, микроцины, антибиотики.
Убедительно доказана весьма существенная роль микрофлоры кишечника и становления местного и общего иммунитета. Установлено влияние низкомолекулярных метаболитов, продуцируемых микрофлорой, на синтез и секрецию секреторного IgA. Непосредственным стимулом пролиферации синтезирующих IgA клеток в слизистой кишечника являются микробные антигены. Показано, что IgA, синтезируемый плазмоцитами, поступает в виде димера к базальной мембране энтероцитов и захватывается ими. В энтероцитах происходит синтез секреторного компонента и соединение его с поступившим IgA. Образовавшийся секреторный иммуноглобулин S-IgA поступает в полость кишечника и осуществляет важную функцию по обеспечению резистентности макроорганизма.
Методы выделения и культивирования изучаемых микроорганизмов
Различные заболевания как инфекционной, так и неинфекционной природы, а также многие другие неблагоприятные факторы (изменение климатических условий, лучевые воздействия, погрешности в режиме питания, ухудшение общего физиологического статуса, соматические расстройства, применение лекарственных средств, возрастное одряхление организма и др.), действуя прямо или опосредованно, оказывают отрицательное влияние на сложную микроэкологическую систему макроорганизма. Это проявляется нарушениями физиологически оптимальных количественных соотношений между отдельными представителями бактериоценоза, в пользу активации условно-патогенной микрофлоры (9; 10; 30; 31; 41; 44; 83).
Попытки предупредить или воздействовать искореняющим образом на уже развившийся дисбактериоз при помощи средств антимикробной терапии не обеспечивают благоприятных результатов, а, напротив, еще более усугубляют уже начавшийся дисбиотический процесс. Это определяет необходимость применения средств коррекционной бактериальной терапии, направленных на восстановление нормальной микрофлоры. Данное положение распространяется в равной мере и на тактику ведения хирургических больных, получающих антимикробные препараты во время подготовки к операциям на органах пищеварительного тракта (9; 33; 45; 46; 119; 128; 140).
Начало исследованиям по разработке средств бактериальной терапии путем использования живых культур молочнокислых и бифидобактерий было положено работами И.И. Мечникова и его школы. Предложенный И.И. Мечниковым лактобациллин представлял собой культуру болгарской палочки в сочетании с молочнокислым стрептококком. Уже в те годы И.И. Мечников, его ученик H.Tissier и П.В. Циклинская отмечали целесообразность применения живых культур бифидобактерий для лечения грудных детей, страдающих диспеп-тическими расстройствами (67; 113; 177). Дальнейшие исследования по разработке и применению средств бифидотерапии нашли свое отражение в работах Г.Л. Нахмансон, Л.Г.Перетца, Е.Н.Вогулкина, которые предложили и с успехом применяли для лечения детей первого полугодия жизни и взрослых препарат «Бифидомбактерин» в форме культуры на солодовой и молочной среде (71; 80). Низкая стабильность этого препарата в нативной форме не дала возможности внедрить его в те годы в лечебную практику. С развитием метода лиофилиза-ции живых культур микроорганизмов (в 60-70-е годы) эта проблема была разрешена разработкой технологии получения сухого бифидумбактерина (21; 22). Практика отечественного здравоохранения располагает в настоящее время также двухкомпонентным бифидосодержащим биопрепаратом - «Бификол» (85; 96).
Потребности медицины в биологических препаратах для восстановительной бактериальной терапии значительно возросли в эпоху массового применения противомикробных лекарственных средств (антибиотики, сульфаниламиды и др.), которые наряду с подавлением патогенных бактерий, оказывают губительное воздействие и на полезную симбиотическую микрофлору. Это, в свою очередь, создает благоприятные условия для бесконкурентного размножения условно-патогенных микроорганизмов - протеев, клебсиелл, энтеробак-тера, цитробактера, грибов рода Кандида, стафилококков и др.
На протяжении последних десятилетий в развитии исследований по созданию лечебных микробных биопрепаратов наибольшее внимание уделяется бифидосодержащим состава, что соответствует доминирующей роли бифидобактерий в биоценозе кишечника человека всех возрастов. Широким фронтом ведутся работы по углубленному изучению представителей разных видов рода Bifidobacterium с целью формирования поливидового арсенала производственных штаммов, отвечающего задачам конструирования медицинских биопрепа ратов и лечебно-диетических продуктов разного назначения (39; 65; 66; 99; 141; 145; 157; 159; 160).
Большого внимания заслуживают работы по подбору и селекции биологически активных штаммов бифидобактерий, которые способны сквашивать молоко и, таким образом, могут быть использованы при изготовлении заквасок для кисломолочных продуктов (100; 101; 109; 130).
Развитие исследований по подбору производственно ценных штаммов бифидобактерий для использования в микробиологической и молочной промышленности координируется общегосударственными целевыми программами. В итоге этих исследований к настоящему времени предложен ряд биологически активных штаммов, рекомендуемых для производства, в том числе штаммы, обладающие устойчивостью к антибиотикам (62; 81; 82; 130). Согласно экспериментальному изучению ин витро и ин виво, а также проведенным клиническим наблюдениям, антибиотикоустойчивые штаммы бифидобактерий характеризуются замедленным ростом, однако сохраняют свое терапевтическое действие и антагонистическую активность против патогенных микроорганизмов. Это определяет возможность их применения одновременно с антибиотикотерапией (81; 82).
Видовой и возрастной состав наблюдаемых животных
Становление медицинской приматологии как самостоятельной области экспериментальной науки, охватывающей различные направления медико-биологических исследований на обезьянах, связано с именем выдающегося русского ученого И.И.Мечникова. Обосновав теоретические предпосылки медицинской приматологии, Мечников первым обратил внимание исследователей на уникальное биологическое сходство обезьян с человеком и продемонстрировал высокую ценность этой модели для изучения патогенеза сифилиса, брюшного тифа и других инфекций, а также исследований в области геронтологии. Он же сформулировал идею создания питомников обезьян специально для медицинских исследований, что послужило стимулом к организации «ранних» питомников и коллекций этих животных в ряде стран мира и способствовало важным открытиям в области изучения инфекций. Так, при содействии Мечникова К.Ландштейнером и Э.Поппером на макаках впервые был воспроизведен полиомиелит и установлена его вирусная этиология (1908-1909), а Ш.Никол ем на модели шимпанзе продемонстрирована клиника сыпного тифа (1909). Фундаментальный труд В.М.Бехтерева «Основы учения о функциях мозга» (1906) в значительной степени базируется на наблюдениях, проведенных на обезьянах.
К настоящему времени сфера использования обезьян в медико-биологических исследованиях весьма широка и многогранна (8; 49; 50; 111). Она охватывает такие области фундаментальной науки, как нейрофизиология, неврология, психология, психиатрия, патология сердечно-сосудистой системы, физиология и патология старения, болезни обмена, эндокринология, офтальмология, стоматология, эмбриология и тератология, акушерство и гинекология, генетика, иммунология, иммунопатология и аллергология, экспериментальная онкология, фармакология и токсикология, инфекционная патология и другие (19; 24; 25; 161; 16; 174; 175).
Важно подчеркнуть, что для области инфекционной патологии обезьяны представляют собой в ряде случаев единственную и незаменимую модель, поскольку только на них могут быть воспроизведены некоторые нозологические формы, свойственные человеку. К числу таких форм относятся бактериальные инфекции - брюшной тиф, паратиф В, шигеллезы, эшерихиозы, сифилис, гонорея, лепра, а также трахома и другие хламидиозы; инфекции, вызываемые вирусами, - гепатиты, полиомиелит, натуральная и ветряная оспа, корь, краснуха, эпидемический паротит, инфекционный мононуклеоз, лихорадка денге, венерическая лимфогранулема; паразитарные инфекции - малярия всех форм, трихо-мониаз, шистосомоз, филяриатоз, а также микоплазменная атипичная пневмония, уреоплазменные уретриты и др. (49; 126; 134; 138; 139; 156; 164; 170).
Примером успешного использования обезьян при изучении одной из наиболее сложных и актуальных проблем инфекционной патологии, какой являются вирусные гепатиты, может служить недавно опубликованная работа Л.И. Корзая (1999), посвященная исследованию гепатита А, занимающего первое место в общей структуре инфекционных гепатитов в России. Известные ранее модели гепатита А на шимпанзе, тамаринах и панамских ночных обезьянах внесли весомый вклад в изучение данной инфекции, однако значительные трудности экономического и организационного плана требовали подбора более доступной модели для продолжения исследований по детализации вопросов патогенеза и иммуногенеза гепатита А, в частности, продолжительности и прочности иммунитета, роли в нем клеточных факторов, длительности сохранения вируса в организме, продолжительности его выделения в среду, сохранения в иммунном организме, возможности его внепеченочнои локализации, что весьма существенно для понимания как патогенеза, так и эпидемиологии инфекции.
Автору удалось воспроизвести вирусный гепатит А на низших обезьянах Старого Света - павианах гамадрилах и макаках резусах, более доступных и экономичных. С использованием данной модели были изучены специфические факторы гуморального иммунитета при первичном и повторном инфицирова нии вирусом гепатита А, показана возможность хронизации инфекции и перси-стенции возбудителя; установлено, что при отсутствии морфологических изменений, а в сыворотке - иммуноглобулинов класса М возможно длительное выделение вируса с фекалиями. Полученные результаты имеют важное значение для понимания природы возбудителя гепатита А, вопросов патогенеза и иммуногенеза инфекции (43).
На модели обезьян ведутся фундаментальные исследования по расшифровке механизмов функционирования различных звеньев клеточного и гуморального иммунитета, включающие фенотипическую характеристику нормальных лимфоидных клеток, в частности Е- и В- лимфоцитов и их активации. Это необходимо для понимания механизмов регуляции иммунного ответа, их активации, трансформации и малигнизации, природы иммунодефицитных состояний при различных патологических процессах, а также для разработки путей рациональной иммунокоррекции и иммунотерапии. Уникальное биологическое сходство обезьян с человеком определяет большую значимость сведений о функционировании различных систем, в том числе клеточного иммунитета, у обезьян, а также в сравнительном аспекте в отряде приматов, включая человека (116).
Интенсивность роста и морфология колоний би-фидобактерий при культивировании в кукурузно-лактозной питательной среде
При исследованиях микрофлоры содержимого толстой кишки обезьян пользовались принятыми в медицине приемами, изложенными в Методических рекомендациях по клинической бактериологии и диагностике дисбактериоза кишечника (26; 30).
Материалом для бактериологических исследований служили пробы све-жевыделенных фекалий обезьян в количестве 1 г, которые гомогенизировали в стерильной фарфоровой ступке с 9 мл-ми стерильного буферного раствора. Из полученного исходного разведения материала (1:10) готовили ряд последовательных десятикратных разведений до 10"11 в том же буферном растворе. Из приготовленных разведений делали высевы на соответствующие селективные и дифференциально-диагностические среды (среды Левина, Плоскирева, Эндо, Калины, желточно-солевой агар, среда Сабуро, селективный агар Хенеля, среда МРС, кровяной агар с цистином).
Ведущая роль бифидобактерий в обеспечении физиологических функций пищеварительного тракта определяет необходимость обязательного количественного учета этих микроорганизмов при каждом бактериологическом исследовании микрофлоры кишечника.
Как известно, до недавнего времени рекомендуемой для этих целей питательной средой оставалась печеночно-цистиновая - ПЦС (26). Вместе с тем, обеспечение указанной средой широкой сети практических лабораторий является малореальной задачей как в силу дефицитности исходного сырья - говяжьей печени, так его нестандартности и сложности приготовления среды. Одним из недостатков ПЦС является также ее невысокая ростовая активность и нестандартность по этому показателю отдельных партий, что требует предварительной подтитровки.
В последние годы в практике работы бактериологических лабораторий находит применение сухая «Бифидум-среда» ГНЦ прикладной микробиологии (30), основу которой составляют панкреатический гидролизат казеина и экстракт пекарских дрожжей. Данная среда близка по рецептуре к утвержденной в составе технологической документации на бифидумбактерин казеиново-дрожжевой среде КДС. Однако доступность названной сухой среды для практических лабораторий в ряде случаев ограничена, что сохраняет актуальность исследований по подбору эффективных и экономичных сред для работы с би-фидобактериями.
Важным условием доступности среды для широкой сети практических лабораторий и гарантированной надежности получаемых результатов в ходе решения диагностических задач является упрощение ее состава и процесса изготовления, повышение стандартности и улучшение ростовых свойств.
На решение поставленной задачи направлена разработка питательной среды оригинального состава - кукурузно-лактозной (КЛС), осуществленная МНИИЭМ и Всероссийским НИИ молочной промышленности. В качестве базового субстрата среда содержит выпускаемые отечественной промышленностью сухой пептон и экстракт кукурузы, которые достаточно стандартны, доступны для лабораторий любого уровня оснащения и централизации, просты в работе и недороги. По результатам апробации в бактериологических лабораториях медицинского профиля КЛС была рекомендована Лабораторным советом Минздрава к использованию в микробиологических лабораториях при проведении исследований на дисбактериоз с целью выделения и количественного учета бифидобактерий.
В разделе нашей работы по выделению и количественному учету бифидобактерий была проведена апробация эффективности КЛС при исследованиях микрофлоры кишечника обезьян. В качестве эталонов для сравнения были использованы печеночная среда (ПЦС) по прописи, приведенной в Методических рекомендациях (26), и казеиново-дрожжевая (КДС), утвержденная в составе технологической документации на бифидумбактерин. Все три среды применялись в форме полужидких (содержали 0,2 % агара). Среды разливали в пробирки по 9 мл и перед посевом прогревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин с целью регенерации. После охлаждения до комнатной температуры в среды засевали пробы исследуемого материала в объеме 1 мл из его разведений 10" 5 - 10"п. Инкубацию осуществляли при 37 С в течение 48-72 ч.
При дифференциации выделяемых штаммов бифидобактерий до вида пользовались набором углеводов (1 %) следующего состава: арабиноза, ксилоза, маннит, лактоза, целлобиоза, сорбит, салицин, трегалоза, крахмал. Основу среды составляли мясная вода 0,3 %, бактопептон 1 %, NaCl 0,5 %; в качестве индикатора использовали бромкрезолпурпур (1,6 %-ный спиртовой раствор) - 2 мл.
Эксперименты по характеристике антагонистической активности изучаемых штаммов бифидобактерий проводили в условиях плотных и жидких питательных сред. В первом случае пользовались методом «отсроченного антагонизма», принятым в технологической документации на бифидумбактерин.
Культуры штаммов, изучаемых на наличие антагонистической активности, взятые в 3-й генерации, засевали штрихами на плотную среду по диаметру чашки Петри. Посевы инкубировали при 37 С в анаэростате в течение 96 ч. Затем на чашки подсевали культуры тест-штаммов, также штрихами, перпендикулярно линии роста испытуемых антагонистов, не касаясь ее. В опытах использовали культуры тест-штаммов, свежевыращенные в течение 18-20 ч. Посевы инкубировали при 37 С в течение 20-24 ч, после чего проводили оценку антагонистической активности испытуемых штаммов по диаметру зон задержки роста тест-микробов.
