Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Экология микроорганизмов репродуктивного тракта женщин (Обзор литературы) 14
1.1. Микросимбиоценоз репродуктивного тракта женщин 14
1.1.1. Лактобациллы - доминантные микроорганизмы вагинального биотопа 14
1.1.2. Ассоциативная микробиота репродуктивного тракта женщин
1.2. Местный иммунитет репродуктивного тракта женщин 42
1.3. Факторы, оказывающие влияние на состояние микроэкологии репродуктивного тракта женщин 49
1.4. Микроэкологические нарушения и инфекционные состояния репродуктивного тракта женщин 55
1.5. Современные подходы к коррекции микроэкологических нарушений репродуктивного тракта женщин
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 64
2.1. Общие данные 64
2.2. Характеристика штаммов микроорганизмов 65
2.3. Методы выделения микроорганизмов 65
2.4. Методы идентификации выделенных штаммов микроорганизмов
2.5. Характеристика состояния микросимбиоценоза репродуктивного тракта женщин
2.6. Лабораторная диагностика трихомонадной инфекции
2.6.1. Микроскопическое исследование 69
2.6.2. Культуральное исследование 69
2.7. Изучение биологических свойств бактерий 70
2.7.1. Метод определения антилизоцимной активности микроорга низмов 70
2.7.2. Метод определения антикомплементарной активности микроорганизмов 72
2.7.3. Метод определения антилактоферриновой активности микроорганизмов 74
2.7.4. Метод изучения способности лактобацилл сорбировать лизо-цим 75
2.7.5. Метод определения лизоцимной активности лактобацилл 77
2.7.6. Метод определения чувствительности лактобацилл к антибиотикам 79
2.7.7. Метод определения адгезивной способности лактобацилл 80
2.7.8. Метод определения бактериоциногенности и бактериоцино-чувствительности лактобацилл 81
2.7.9. Метод определения продукции лактобациллами перекиси водорода
2.8. Методы определения факторов естественной резистентности.. 83
2.8.1. Определение количества лейкоцитов и нейтрофилов в церви-кальном секрете 83
2.8.2. Определение лизоцима в цервикальном секрете 84
2.8.3. Метод количественного определения SIgA, Scom, IgG, IgM, IgA, IgE, C3 компонента комплемента и лактоферрина в цервикальной слизи 85
2.9. Методика изучения изменения биологических свойств Staphy lococcus epidermidis и Escherichia coli под влиянием метаболи тов вагинальных лактобацилл 86
2.10. Определение роста S. aureus при совместном влиянии метаболитов Corynebacterium minutissimum и перекиси водорода 87
2.11. Методика изучения влияния эстриолсодержащих препаратов и комбинированных оральных контрацептивов на микрофлору репродуктивного тракта при дисбиозе 88
2.12. Методы статистической обработки полученных результатов... 88
ГЛАВА 3. Характеристика лактобацилл, как доминантных микроорганизмов репродуктивного тракта женщин 90
3.1. Вагинальная лактофлора в норме и при дисбиотических состояниях 90
3.2. Характеристика прямого антагонизма вагинальной лактофло ры 105
3.3. Косвенный (непрямой) антагонизм вагинальных лактобацилл.. 112
3.4. Потенцирование лактобациллами эндогенных факторов защиты организма хозяина 126
ГЛАВА 4. Взаимодействие ассоциативных микроорганизмов и факторов местного иммунитета репродуктивного тракта женщин при воспалительных заболеваниях 132
ГЛАВА 5. Характеристика микросимбиоценоза репродуктивного тракта женщин при воспалительных заболеваниях 142
5.1. Вагинальный микросимбиоценоз при воспалительных заболеваниях придатков матки и трихомонадной инфекции 142
5.2. Микрофлора биотопов репродуктивного тракта женщин при эндометрите 156
5.3. Сравнительная характеристика вагинального микросимбиоценоза в норме и при различных воспалительных заболеваниях... 178
ГЛАВА 6. Значение нарушений ассоциативного симбиоза репро дуктивного тракта женщин при воспалительных заболе ваниях 185
7. Заключение 206
8. Выводы 224
9. Литература
- Факторы, оказывающие влияние на состояние микроэкологии репродуктивного тракта женщин
- Метод определения антилизоцимной активности микроорга низмов
- Определение роста S. aureus при совместном влиянии метаболитов Corynebacterium minutissimum и перекиси водорода
- Микрофлора биотопов репродуктивного тракта женщин при эндометрите
Введение к работе
Актуальность проблемы
С современных позиций ассоциативный симбиоз представляет собой многокомпонентную интегральную систему, включающую хозяина в качестве макропартнера, стабильный доминантный микросимбионт и ассоциированные микросимбионты с разнонаправленными воздействиями, определяющими формирование, стабильность существования и продуктивность симбиоза в целом (Бухарин О.В. и др., 2007). Этой концепции соответствует ассоциативный симбиоз репродуктивного тракта женщин, включающий как факторы иммунитета хозяина, взаимодействующие с микроорганизмами, так и доминантные бактерии – лактобациллы и многочисленные ассоциативные микроорганизмы, имеющие существенное значение, как в норме, так и при инфекционной патологии.
Микросимбиоценоз репродуктивного тракта женщин – многокомпонентная система, находящаяся в динамическом равновесии. Относительное постоянство микросимбиоценоза определяется наличием колонизационной резистентности организма, которая зависит от качественных и количественных характеристик нормофлоры и факторов естественной резистентности биотопа.
В настоящее время открытым остаётся вопрос о симбиотических взаимодействиях лактобацилл, ассоциативных микроорганизмов и макроорганизма в реализации колонизационной резистентности. Являясь доминантным таксоном, лактобациллы вносят весомый вклад в бактериальную составляющую колонизационной резистентности хозяина, хотя известно, что отдельные биовары лактобацилл не всегда обладают полным набором факторов антагонизма и осуществляют достаточную защиту биотопа. Этот важный момент определяет необходимость исследования биологических свойств лактобацилл и комплексную оценку их участия в реализации колонизационной резистентности репродуктивного тракта женщин. Интерес представляет и изучение не только прямой антагонистической активности лактобацилл за счет продукции различных антибактериальных субстанций таких как органические кислоты, лизоцим, бактериоцины, перекись водорода, но и выявление возможности этих микроорганизмов подавлять персистентный потенциал условно-патогенных аллохтонных микроорганизмов. С позиций ассоциативного симбиоза, колонизационная резистентность организма может осуществляться посредством взаимодействия доминантных лактобацилл с другими представителями микросимбиоценоза репродуктивного тракта женщин, а это открывает новые перспективы, как для расшифровки бактериальных механизмов колонизационной резистентности репродуктивного тракта женщин, так и для биотехнологической разработки штаммов пробиотических микроорганизмов с комплексным воздействием на аллохтонную микрофлору.
Учитывая, что факторы персистенции ассоциативных патогенных и условно-патогенных бактерий способствуют их выживанию в организме хозяина и формированию длительно текущего инфекционного процесса и развитию дисбиотических состояний, изучение подавления экспрессии персистентных свойств бактерий различными биотическими и абиотическими факторами лежит в основе рационального подхода в борьбе с патогенами женского репродуктивного тракта. Представляет интерес и исследование взаимодействия ассоциативных микроорганизмов с организмом хозяина через взаимосвязь факторов его местного иммунитета и персистентного потенциала бактерий. Если к этому присовокупить, что колонизационная резистентность биотопов, рассматриваемая как результат действия нормофлоры и факторов защиты макроорганизма, где мощное защитное действие факторов естественной резистентности может быть связано с их взаимным потенцированием (Кокряков В.Н., 2006), то совместное влияние доминантных микроорганизмов и факторов эндогенной защиты хозяина требует дополнительного изучения.
Наконец, снижение колонизационной резистентности организма, способствующее дисбиотическим состояниям и воспалительным заболеваниям женского репродуктивного тракта, делает проблему исследования колонизационной резистентности биотопов актуальной ещё и потому, что выявление нарушений ассоциативного симбиоза репродуктивного тракта женщин, открывает новые возможности в прикладном аспекте для диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний и коррекции микроэкологических нарушений.
Вышеизложенное явилось основанием для формулирования цели и задач настоящего исследования.
Цель и задачи исследования
Цель исследования – охарактеризовать бактериальные механизмы колонизационной резистентности на модели репродуктивного тракта женщин и определить значение симбиотических взаимодействий макроорганизма, доминантных и ассоциативных микроорганизмов в его защите.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать бактериальные механизмы колонизационной резистентности репродуктивного тракта женского организма и оценить роль доминантных микроорганизмов в её реализации.
-
Выявить значение симбиотических взаимодействий в условиях микросимбиоценоза доминантных и ассоциативных микроорганизмов для поддержания колонизационной резистентности репродуктивного тракта женщин.
-
Охарактеризовать взаимосвязь факторов местного иммунитета и персистентного потенциала бактерий как основу взаимодействия ассоциативных микроорганизмов с организмом хозяина.
-
Определить характер нарушений ассоциативного симбиоза при инфекционно-воспалительных заболеваниях репродуктивного тракта женщин.
-
Оценить значение показателей состояния ассоциативного симбиоза репродуктивного тракта женщин для диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний и коррекции микроэкологических нарушений.
Научная новизна
Колонизационная резистентность – физиологический феномен, направленный на поддержание микроэкологического гомеостаза, являющийся результатом симбиотических взаимодействий организма хозяина и автохтонной микрофлоры. Представлена рабочая классификация бактериальных механизмов колонизационной резистентности репродуктивного тракта женщин, включающая: препятствие адгезии, антагонистическое действие нормофлоры за счет продукции антибактериальных субстанций, подавление персистентных свойств аллохтонных микроорганизмов и потенцирование (усиление) эндогенной антимикробной защиты организма.
Колонизирующая способность лактобацилл как доминантной микрофлоры репродуктивного тракта женщин связана с выраженностью их адгезии и способностью сорбировать лизоцим. Показатель микробной обсеменённости (ПМО) прямо коррелировал со значениями указанных признаков. Микроорганизмы, выделенные при эубиозе, характеризовались выраженным колонизирующим потенциалом, высокой лизоцимной активностью и низкой антибиотикорезистентностью по сравнению со штаммами, выделенными при дисбиозе.
Оценено значение бактериоциногении и бактериоциночувствительности в формировании видовой структуры лактофлоры, где наиболее часто встречающиеся виды лактобацилл характеризовались высокой бактериоциногенией и низкой бактериоциночувствительностью.
Для оценки стабильности состояния микросимбиоценозов предложен «Способ определения колонизационной резистентности экологической ниши тела человека» (Патент РФ № 2175673), основанный на выявлении антагонистического действия аутохтонной микрофлоры по отношению к ассоциантам тест – штаммам S.aureus и E.coli.
Разработан метод определения способности микроорганизмов ингибировать бактериальную каталазу (Патент РФ № 2180353) и метод количественного определения продукции перекиси водорода для выявления антагонистически активных лактобацилл в отношении аллохтонных бактерий на основе способности перекись продуцирующих лактобацилл ингибировать бактериальную каталазу.
Выявлено модифицирующее действие метаболитов лактобацилл на активность каталазы, персистентные характеристики и прирост биомассы S. epidermidis и E. coli. Супернатанты лактобацилл оказывали более выраженное ингибирующее действие на активность каталазы по сравнению с клеточными экстрактами. Наибольшее снижение значений антилизоцимной активности (АЛА) и антикомплементарной активности (АКА) S. epidermidis происходило при воздействии клеточных экстрактов, а у E. coli указанные свойства снижались преимущественно под влиянием супернатантов.
Острые воспалительные заболевания репродуктивного тракта женщин или обострение хронических протекают на фоне снижения колонизационной резистентности, что проявляется в абсолютном или относительном увеличении количества ассоциативных условно-патогенных микроорганизмов, возрастании у них значений персистентных характеристик с последующей ответной реакцией со стороны факторов естественной резистентности организма.
Выявлены эффекты стимуляции антагонистической активности представителей нормальной микрофлоры репродуктивного тракта женщин и её ингибирование у патогенов фрагментами пептидогликана лактобацилл (Патент РФ № 2376381), что обосновывает использование регуляторов антагонизма на основе пептидогликанов в качестве биопрепаратов для повышения колонизационной резистентности биотопов человека
Нормализующее действие эстриолсодержащих препаратов на ассоциативный симбиоз вагинального биотопа репродуктивного тракта женщин (Патент РФ № 2161971), основанное на увеличении количества доминантных лактобацилл и снижении факторов персистенции условно-патогенных ассоциативных микроорганизмов, способствует восстановлению колонизационной резистентности организма, за счёт реализации функции доминантной микрофлоры и объясняет механизм действия эстрогенов на вагинальный микросимбиоценоз.
Теоретическая и практическая значимость
Получены новые данные, расширяющие патогенетические представления о механизмах симбиотических взаимоотношений доминантных, ассоциативных микроорганизмов и макроорганизма в реализации колонизационной резистентности биотопов репродуктивного тракта женщин.
Практическая ценность работы характеризуется возможностью использования биологических характеристик лактофлоры для дифференциации штаммов по их способности поддерживать колонизационную резистентность репродуктивного тракта женщин. Исследованные свойства лактобацилл: продукция перекиси водорода, способность ингибировать каталазу и факторы персистенции (АЛА и АКА) аллохтонных микроорганизмов могут быть использованы в качестве критериев отбора пробиотических штаммов. Предложены методические подходы к определению указанных биологических характеристик лактобацилл.
Для повышения эффективности ранней диагностики дисбиотических состояний в клинической и лабораторной практике рекомендован разработанный «Способ определения колонизационной резистентности экологической ниши тела человека», позволяющий определить уровень колонизационной резистентности биотопов человека.
Результаты работы по применению эстриолсодержащих препаратов для восстановления колонизационной резистентности положены в основу способа коррекции дисбиотических состояний репродуктивного тракта женщин.
Материалы работы использованы в медицинской практике Областного центра планирования семьи и репродукции (г. Оренбург), а также внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии ГОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии Росздрава.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Колонизационная резистентность – физиологический феномен, направленный на поддержание микроэкологического гомеостаза за счет симбиотических взаимодействий автохтонной микрофлоры и организма хозяина в целях препятствия колонизации аллохтонных микроорганизмов.
2. Нарушения ассоциативного симбиоза при инфекционно-воспалительных заболеваниях репродуктивного тракта женщин однотипны и характеризуются снижением колонизационной резистентности организма, что проявляется в дефиците доминантных микроорганизмов и усилении персистентного потенциала ассоциативных микроорганизмов.
3. Лактобациллы как доминантные микросимбионты репродуктивного тракта женщин реализуют бактериальные механизмы колонизационной резистентности хозяина, включающие – препятствие адгезии патогенов, антагонистическое действие нормофлоры путем продукции антибактериальных субстанций, подавление персистентного потенциала аллохтонных бактерий и потенцирующий (синергидный) эффект совместно с факторами эндогенной антимикробной защиты хозяина.
4. Нарушения ассоциативного симбиоза – биологическая основа инфекции репродуктивного тракта женщин, где выявление микроэкологических изменений в биотопах определяет прогнозирование характера течения инфекционного процесса и пути его коррекции в целях профилактики.
Апробация работы
Основные положения работы доложены на: III - VI Российских научных конференциях «Персистенция микроорганизмов», г. Оренбург, 2000, 2003, 2006, 2009; Российских научных конференциях «Репродуктивное здоровье населения» г. Оренбург, 1999,2001, 2005; г. Челябинск, 2002; Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания», г. Москва, 2004; Конференции «Фундаментальные науки - медицине» по программе фундаментальных исследований Президиума РАН, г. Москва, 2004; Международной научной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», г.Москва, 2006, 2009.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 30 работ, в том числе 19 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 4 патента РФ на изобретения и 3 монографии.
Объем и структура диссертации
Факторы, оказывающие влияние на состояние микроэкологии репродуктивного тракта женщин
Идентификация вагинальных лактобацилл по фенотипическим признакам на основании утилизации Сахаров и других биохимических тестов не позволяет точно идентифицировать эти микроорганизмы. Использование RAPD ПЦР и секвенса 16s рибосомальной ДНК (Vasquez А. et al., 2002), мультиплексной ПЦР (Kiss Н. et al., 2007) и полного анализа ДНК (Antonio M.A.D. et al., 1999) позволяет достаточно точно идентифицировать лактобациллы, определить гомологию штаммов выделенных от одного индивидуума или гомологию в пределах одного вида. Данные по распространенности видов вагинальных лактобацилл могут отражать соотношение видов некультивируемых лактобацилл.
Видовая характеристика лактофлоры у беременных женщин. Охарактеризована вагинальная лактофлора у здоровых женщин в первом триместре беременности (Kiss Н. et al., 2007). Было обследовано 200 беременных женщин в возрасте от 18 до 35 лет. Выявление лактобацилл проводили у 126 женщин, вагинальная лактофлора которых соответствовала норме по критериям Nugent R.P. et al. (1991). Использование результатов бактериологического метода исследования, мультиплексной и RAPD ПЦР, показало, что частота выделения лактобацилл составляет 57% (у 72 из 126 женщин). Наиболее часто встречались виды/,, gasseri (26.4%) и L. crispatus (23.6%), у 4.2% женщин эти виды были выделены совместно. L. jensenii был определен у 19,4% женщин, a L. rhamnosus -9,7%. Виды L. acidophilus, L. plantarum и L. salivarius не были выделены. В работах Vasquez A. et al. (2002) and Antonio M.A.D. et al. (1999) также приведены данные, указывающие на то, что лидирующее положение по частоте выделения принадлежит видам L. jensenii, L. crispatus и L. gasseri. По данным других авторов доминантными являются виды L. acidophilus и L. fermentum, а затем следуют L. brevis, L. jensenii, L. casei (Reid G. et al, 1996). Использование молекулярно-генетических методов идентификации микроорганизмов позволило выявить доминирование таких видов, как L. crispatus, L. jensenii и L. iners (Reid G. et al, 1996; Burton J.P. et al., 2003).
Частота обнаружения вагинальных лактобацилл у женщин в 1 триместре беременности может соотноситься с распространенностью этих бактерий в популяции небеременных женщин (Kiss Н. et al., 2007).
Wilks М. et al. (2004) определили видовой состав лактофлоры в вагинальном биотопе у 73 женщин в сроке гестации 20 недель. Для идентификации до вида проводили секвенирование 16s рДНК. Было выделено 92 изолята лактобацилл. У 12 женщин лактобациллы не были выделены, от 33 женщин было получено по 1 изоляту, от 26 - по 2 изолята, и по 1 женщине имели 3 или 4 изолята лактобацилл. После идентификации выделенных штаммов было установлено, что 27 из них принадлежали к виду L. gassei, 21 - L. crispatus, 16 — L. vaginalis, 15 - L. jensenii, 2 - L. oris и no 1 штамму принадлежали к видам L. casei, L. rhamnosus, L. fermentum, L. delbrueckii, L. reuteri, L. acidophilus. Таким образом, по результатам данного исследования основными видами вагинального биотопа у женщин при сроке гестации 20 недель являлись L. gassei, L. crispatus, L. vaginalis, L. jensenii.
Антагонистическая активность лактобацилл и их роль в колонизационной резистентности. Известно, что лактобациллы продуцируют большое количество различных веществ, которые ингибируют рост и размножение других микроорганизмов и, таким образом, регулируют численность популяции обитателей некоторых экологических ниш тела человека: рта, кишечника, кожи, влагалища. Благодаря наличию таких характеристик, как поддержание кислой среды (рН 4,5) за счет продукции лактата (Skarin A., Sylwan J., 1986), секреция Н202 (Klebanoff S.J. et al., 1991), бактериоцинов (Ocana V.S. et al., 1999), лактобациллы осуществляют локальное антимикробное действие против патогенов.
Такие вещества как молочная, уксусная, пироглютаминовая кислоты (Niku-Paavola M.L. et al., 1999; Strom К. et al., 2002), бактериоци-ны (Jimenez-Diaz R. et al., 1995) и перекись водорода являются биологически активными веществами с высокой потенциальной возможностью реагировать с липидами, протеинами, нуклеиновыми кислотами и другими молекулярными структурами клетки, вызывая окислительное повреждение клетки (Imlay J.A., 2002).
Лактобациллы образуют биоплёнку, покрывающую слизистую влагалища и защищающую таким образом от внедрения микроорганизмов благодаря реализации различных антибактериальных механизмов (Lepargneur J.-P., Rousseau V., 2002).
Ингибирование роста патогенов. Органические кислоты. Гликоген - важный источник углерода в вагинальном биотопе, он образуется вагинальным эпителием под действием эстрогенов и в течение менструального цикла его количество изменяется. Вагинальные лактобациллы утилизируют гликоген или глюкозу (являющуюся продуктом гидролиза гликогена под действием эпителия, лактобацилл или других микроорганизмов) до образования органических кислот, преимущественно молочной кислоты и поддерживают рН среды около 4,0 (Boskey Е. et al., 1999; Berrebi A., Ayoubi J.M., 1999). Клетки вагинального эпителия также гид-ролизуют гликоген до молочной кислоты. Исследованиями последних лет показано, что более 50% лактата, обнаруживаемого в вагинальной жидкости, принадлежит к D-изомерам. Известно, что клетки человека не способны синтезировать L-формы молочной кислоты, тогда как бактерии продуцируют L- или D-изомеры, или смесь L-D-изомеров. Таким образом, лактобациллы являются основным продуцентом молочной кислоты в вагинальном биотопе (Boskey Е. et al., 2001).
Метод определения антилизоцимной активности микроорга низмов
Антикомплементарную активность (АКА) микроорганизмов изучали по методу Ю.А.Брудастова (1992), основанному на тестировании убывания активности комплемента под влиянием бактериальных экзо-метаболитов при парциальном гемолизе эритроцитов в агаровом геле.
На поверхность предварительно охлажденного до 4С 1% ком-плементчувствительного слоя агара, содержащего сенсибилизированные эритроциты барана в концентрации 0,25 млрд/мл и приготовленного на стандартном веронал-мединаловом буфере (Кэбот Э., Мейер М., 1968) по шаблону наносили стандартные капли супернатантов исследуемых штаммов бактерий объемом 10 мкл. Пластины с агаром инкубировали на холоду до полного впитывания супернатантов, и затем по тому же шаблону наносили по 10 мкл комплемента. Далее пластины инкубировали при 4 С в течение 18-24 часов для диффузии и реализации антикомплементарных свойств бактериальными продуктами. Проявление зон гемолиза осуществляли при 37 в течение 60 минут и останавливали погружением пластин в холодный (8-10 С) веронал-мединаловый буфер. Измерение поглощения света в зонах гемолиза производили при длинах волн 600-640 нм (денситометр ДМ-1, светофильтр №4). При этом ряды зон гемолиза выравнивались параллельно направлению движения предметного столика прибора, установка темнового тока осуществлялась со гласно инструкции к прибору, установку конца шкалы (100% пропускания) производили по зоне гемолиза, полученной нанесением на агар с эритроцитами сапонина, вызывающего 100% гемолиз в месте нанесения. Денситограмма представляла собой кривую, состоящую из чередующихся участков, соответствующих поглощению негемолизирован-ного комплементчувствительного слоя (фоновый уровень) и уровням поглощения отдельных зон гемолиза. Вычисление функционально активного комплемента в соотвествующеи зоне гемолиза производили следующим образом. Измеряли на денситограмме падение поглощения для соответствующей зоны гемолиза (в мм), относили полученную величину к величине падения поглощения в зоне со 100% гемолизом и получали таким образом степень падения поглощения в каждой зоне гемолиза. Затем по полученному эмпирическим путем уравнению Y=0.27 1nX+1.02, где X - полученная величина степени падения поглощения в зоне гемолиза, a Y - степень гемолиза в последней, и уравнению Крога (Кэбот Э., Мейер М, 1968) с коэффициентом 1/п=0.27 (соответствует используемой концентрации эритроцитов) производили перерасчет оптического параметра в величину активности комплемента, выраженную в гемолитических единицах (СН50). За величину АКА принимали разность между активностью в контрольных зонах гемолиза, где вместо супернатанта применяли питательный бульон, и активностью в соответствующих штаммам опытных зонах гемолиза, разность, перерас-читанную умножением на 100 на 1 мл супернатанта. Таким образом, за 1 единицу антикомплементарной активности (1 анти-СН5о) принимали такую активность супернатанта суточной бульонной культуры бактерий исследуемого штамма, которая при контакте 1 мл супернатанта с 1 мл сыворотки обеспечивала инактивацию 1 гемолитической единицы комплемента. 2.7.3. Метод определения антилактоферриновой активности микроорганизмов
Антилактофериновую активность (АЛФА) микроорганизмов определяли по методу О.В. Бухарина с соавт. (2005) .
Суточные агаровые культуры микроорганизмов засевали в мясо-пептонный бульон. После инкубации в течение 18-24 часов от бактериальных клеток отделяли супернатант, центрифугированием при 3000 8000 об/мин в течение 20 минут на холоде. 150 мкл супернатанта смешивали со 150 мкл приготовленного раствора лактоферрина в лунках стерильного планшета. Параллельно с опытными готовили контрольные пробы: в лунки планшета вносили 150 мкл раствора лактоферрина и 150 мкл стерильного мясопептонного бульона. Пробы инкубировали при 37С в течение 24 часов, после чего отбирали по 50 мкл от опытных и контрольных проб.
Опытные и контрольные пробы в обеих сериях опыта разводили в 5 раз, до объема 250 мкл) рабочим раствором фосфатно-солевого буфера с твином. Для достоверности получаемых результатов опыт и контроль проводился в трех сериях.
Концентрацию лактоферрина в пробах определяли с использованием реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия). В лунки первого ряда планшета с иммобилизованными антителами к лактофер-рину вносили по 100 мкл растворов калибровочных и контрольного образцов. В остальные лунки планшета вносили по 100 мкл анализируемых образцов. Планшет выдерживали в течение 30 мин при температуре 37С, после чего содержимое лунок удаляли энергичным вытряхиванием в кювету с дезинфицирующим раствором. Лунки планшета промывали 3 раза рабочим буферным раствором и дважды - дистиллированной водой. Далее во все лунки добавляли по 100 мкл раствора конъюгата антител с пероксидазой хрена, выдерживали в течение 30 мин при температуре 37С, после чего содержимое лунок удаляли вытряхиванием, лунки про мывали 3 раза рабочим буферным раствором и дважды - дистиллированной водой. Затем во все лунки добавляли по 100 мкл раствора тетра-метилбензидина. Стрипы выдерживали в течение 20 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте. По истечении указанного времени во все стрипы добавляли по 100 мкл стоп-реагента (2 н. серная кислота). Регистрацию результатов в стрипах с опытной и контрольной пробами проводили на фотометре ИФА - ОЭП Россия при длине волны 450 нм. По результатам измерения строили график в координатах: ось абсцисс - концентрация лактоферрина в калибровочных образцах (нг/мл), ось ординат - соответствующее значение оптической плотности. Концентрацию лактоферрина в опытных и контрольных пробах определяли по калибровочному графику. Найденные по графику значения концентрации лактоферрина умножали на коэффициент разведения проб, т.е. на 5 и выражали результат в нг/мл.
Определение роста S. aureus при совместном влиянии метаболитов Corynebacterium minutissimum и перекиси водорода
У женщин больных трихомонозом, ВЗПМ, трихомонозом в сочетании с ВЗПМ отмечено возрастание гуморальных факторов защиты репродуктивного тракта: лактоферрина, лизоцима, СЗ компонента комплемента, иммуноглобулинов и секреторного компонента.
Значительный рост лактоферрина, обладающего функцией связывания железа может иметь защитный эффект при трихомонадной инфекции. Было установлено, что железо является фактором способствующим устойчивости к комплементу. Demes P. et al. (1988) обнаружили отличия свежих изолятов трихомонад по их чувствительности или устойчивости к комплемент-зависимому лизису в сыворотке крови. Авторы отметили появление чувствительности у комплемент резистентных свежих изолятов при их длительном культивировании in vitro. Резистентность к комплементу находится в зависимости от высокой концентрации железа, которое конечно в большом количестве поступает во время менструации. Также известно о регуляции железом экспрессии цистеиновых протеиназ, которые участвуют в разрушении СЗ компонента комплемента на эпителиальных поверхностях (Alderete J. F. et al, 1995). Способность разрушать комплемент трихомонадами может объяснять факт слабого возрастания концентрации комплемента в цервико-вагинальном секрете при трихомонозе по сравнению с воспалительными заболеваниями придатков матки.
Как видно из представленных результатов, трихомонадная инфекция вызывает выраженную реакцию со стороны клеточных и гуморальных факторов местной защиты, сопоставимую с таковой при воспалительных заболеваниях придатков матки. Выявлено абсолютное и относительное увеличение количества нейтрофилов в пуле лейкоцитов вагинального биотопа.
Дополнительными данными о состоянии местного иммунитета послужили результаты оценки вагинальных мазков у женщин с инфекци-онно-воспалительными заболеваниями и протозойной инфекцией. Было выявлено несколько типов микроскопической картины. Они характеризовались наличием или отсутствием морфотипов лактобацилл, представителей ассоциативной микрофлоры, типичной микроскопической картиной бактериального вагиноза. Причем описанные характеристики вагинального мазка можно было наблюдать как на фоне лейкоцитарной реакции, так и при её отсутствии.
Микроскопическая оценка лейкоцитоза позволила получить дополнительную информацию к данным о состоянии вагинального микро-симбиоценоза при с инфекционно-воспалительных заболеваниях. В данном случае лейкоцитоз являлся проявлением микроэкологических нарушений биотопа и был выявлен в сочетании со всеми 4 типами микро-симбиоценоза. Заслуживает внимание наличие лейкоцитов на фоне нормального или сниженного количества лактобактерий. Полученные данные дополняют известные классификации микроскопической характеристики биоценоза влагалища (Кира Е.Ф., 2001; Donders G.G.G. et al., 2000), которые не учитывают наличие лейкоцитоза на фоне доминирования в мазке морфотипов лактобацилл.
Известно, что трихомонадная инфекция характеризуется лейкоцитозом поскольку врожденный иммунитет, включающий хемотаксис и ограниченный выход нейтрофилов, может быть более важным в контроле за трихомонадной инфекцией, чем приобретенный иммунитет (W0I-ner-Hanssen P. et al., 1989). Вместе с тем отсутствие лейкоцитарной реакции не противоречит данным о существовании вялотекущих бессимптомных форм трихомоноза, сложных для диагностики (Дмитриев Г.А., 2003). Приблизительно половина женщин с трихомонозом не имеют симптомов заболевания. Следовательно, если эти женщины не обращаются к врачу, диагноз может быть не поставлен (Schwebke J.R., Burgess D., 2004).
Ранее был предложен термин «трихомонадоносительство». Распространение трихомонадоносительства достигает 19,6-84,8% и, по 136 видимому, чаще встречается у мужчин. У женщин это явление обнаружено в 56,1% случаев (Овчинников Н.М. с соавт., 1987). Известно, что бактериальный вагиноз, как один из типов микроэкологических нарушений, характеризуется отсутствием лейкоцитарной реакции, являющейся одним из диагностических признаков данного дисбиоза вагинального биотопа. Учитывая высокую распространенность бактериального вагиноза и выраженную реакцию факторов местного иммунитета у женщин данной группы, а также исходя из полученных результатов микроскопии вагинальных мазков, свидетельствующих о наличии лейкоцитоза при бактериальном вагинозе, что не характерно для данного типа микроэкологических нарушений, мы в дальнейшем предприняли попытку дать характеристику факторов местного иммунитета обследованных женщин с бактериальным вагинозом.
Бактериальный вагиноз у женщин с трихомонадной инфекцией и у женщин с трихомонадной инфекцией в сочетании ВЗПМ характеризовался соответственно увеличением показателей местного иммунитета: лейкоцитов до 19,2х109/л и 17,6х109/л, нейтрофилов до 13,3х109/л и 11,8х109/л, лактоферрина до 1728,3 мкг/мл и 1589,2 мкг/мл, лизоцима до 30,6 мкг/мл и 31,1 мкг/мл, комплемента до 32,7 мкг/мл и 28,4 мкг/мл, а также всех классов иммуноглобулинов при сопоставлении с аналогичными показателями у женщин с бактериальным вагинозом группы сравнения, где количество лейкоцитов составило 5,4x109/л, нейтрофилов 3,22x109/л, лактоферрина 659,3 мкг/мл, лизоцима 20,2 мкг/мл, комплемента 16,3 мкг/мл. Однако, сопоставление данных с этими же показателями женщин обследованных групп без бактериального вагиноза, показывает снижение местной защиты на фоне бактериального вагиноза и у женщин группы сравнения и у больных трихомонозом.
Микрофлора биотопов репродуктивного тракта женщин при эндометрите
При анализе полученных результатов было выявлено, что у 75% вагинальных, 70% цервикальных штаммов и у 86%, выделенных из полости матки штаммов аэробных и анаэробных микроорганизмов (стрептококки, энтерококки, КОС, бифидобактерии) уровень антилизоцимной активности (АЛА) был невысоким (0,11 - 0,28 мкг/мл ОД).
Уровень антикомплементарной активности (АКА) более чем у 70% исследованных штаммов аэробных и анаэробных микроорганизмов, выде 163 ленных из влагалища, цервикального канала и полости матки составлял от 1,1 до 4,4 анти СН50.
Значения антилактоферриновой активности (АЛФА) микроорганизмов, вьщеленных из влагалища, цервикального канала, полости матки составили от 2,6 до 6,3 ЕД. В8889 - полость матки
Таким образом, анализ результатов проведенного исследования показал, что из влагалищного, цервикального биотопов и полости матки здоровых женщин были выделены аэробные и анаэробные микроорганизмы. Наиболее часто выделялись лактобактерии, коринебактерии, коагулазоотрицательные стафилококкикки, бактероиды, эубактерии и бифидобактерии. Видовое разнообразие микрофлоры влагалища более широко представлено по сравнению с цервикальным каналом и полостью матки, что подтверждается и рядом исследователей (Ларсен Б., 1988; Баев О.Р., Стрижаков А.Н., 1997). Степень обсемененности биотопов репродуктивного тракта была наибольшей у лактобацилл, бифидобактерии и стрептококков. Выявлена широкая распространенность факторов персистенции у штаммов аэробных и анаэробных микроорганизмов, выделенных из биотопов репродуктивного тракта здоровых женщин, при этом уровень антилизоцимной, антикомплементарной и анти-лактоферриновой активностей был невысок.
При изучении микрофлоры биотопов репродуктивного тракта женщин с острым эндометритом были получены следующие результаты. Отмечена низкая частота выделения лактобацилл из влагалища (61,8%), тогда как частота выделения условно-патогенных микроорганизмов значительно возросла (Табл. 5.3.). Из представителей условно-патогенных аэробных микроорганизмов чаще других были выделены грамположительные кокки: энтерококки, стафилококки, стрептококки. Коагулазоотрицательные (КОС) стафилококки были изолированы из влагалища у 58,2% женщин с острым течением эндометрита, у 25,5% женщин из цевикса и у 20,0% женщин из полости матки. Коагулазоположительные (КПС) стафилококки встречались реже в 14,5% случаев в Частота выделения стрептококков из влагалища была наибольшей (25,5%) по сравнению с цервикальным каналом (20,0) и полостью матки (10,9). Для энтеробактерий также было характерно наиболее частое выделение из влагалища (18,2%), тогда как из цервикса и полости матки данные микроорганизмы были изолированы в 7,3% и 5,5% случаев соответственно. Коринебактерии были выделены только из влагалища у 21,8% женщин. Рассматривая анаэробный спектр микроорганизмов, изолированных из влагалищного биотопа у женщин с острым течением эндометрита было установлено, что наиболее часто выделяли бактероиды в 25,5% и эубактерии в 30,9% случаев. В церви-кальном канале данные микроорганизмы встречались с меньшей частотой, которая для бактероидов составила 7,3%, а для эубактерии - 3,6%, из полости матки указанные микроорганизмы были выделены в одинаковом проценте случаев (10,9).
Частота встречаемости микроорганизмов и показатель микробной обсе-мененности (ПМО) биотопов репродуктивного тракта здоровых женщин
Определение видового состава влагалищной микрофлоры в группе женщин с острым течением эндометрита показало, что основные доли приходятся на лактобациллы (16,9%) и коагулазоотрицательные стафилококки (15,8%). На остальные микроорганизмы приходится от 4%до 8,4% вагинальной микрофлоры (Рис. 5.13).
В видовом составе аэробной микрофлоры цервикального канала пациенток с острым течением эндометрита основные доли приходятся на энтерококки (26,9%), коагулазоположительные стафилококки (22,3%) и стрептококки (17,5%). Наибольшую долю составляют энтерококки (83,3%) . КОС составили 14,28%) штаммов. На долю других микроорганизмов в структуре микрофлоры цервикального канала приходится от 3,2% до 9,5% (Рис. 5.14.).
Определение видового состава микрофлоры полости матки больных с острым эндометритом показало, что больший процент составили энтерококки (28,7% ) и коагулазоотрицательные стафилококки , а стафилококки (18,6%о). На долю стрептококков, бактероидов и эубактерий приходится по 10,2%). Другие микроорганизмы составляют от 3,4%) до 8,5%) видового состава микрофлоры полости матки (Рис. 5.15.).
