Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 13
1.1. Пикорнавирусы 13
1.2. Полиовирус 16
1.2.2. Полиовирусная РНК 18
1.2.3. Белки полиовируса 19
1.2.4. Полиовирусный белок ЗА 23
1.3. Апоптоз 24
1.3.1. Общая характеристика 24
1.3.2. Апоптоз, индуцируемый прямой стимуляцией «рецепторов смерти» TNFR и FAS 25
1.4. Везикулярный белковый транспорт 28
1.4.1. Общая схема 28
1.4.2.Цитоскелет и молекулярные моторы в мембранном транспорте белков 28
1.4.3. Динеин и аппарат Гольджи 30
1.4.4. Разрушение аппарата Гольджи под воздействием дрожжевого метаболита брефельдина А 31
1.5. LIS1 и его роль в регуляции функций линейна 32
1.6. Клеточные функции пирина 35
1.7. Биоактивность кверцетина 36
П. Материалы и методы 38
II. 1. Работа с культурами эукариотических клеток 38
П. 1.1. Клеточные линии, использованные в работе, и их культивирование 38
11.1.2. Трансфекция 39
II. 1.3. Упаковка лентивирусных частиц 39
И.1.4. Очистка вирионов и трансдукция 40
II.1.5. Определение эффективного титра вирусных частиц и множественности заражения клеток 41
II.2. Работа с плазмидной ДНК и клонирование 41
П.2.1. Получение химически компетентных клеток E.coli 41
П.2.2. Трансформация химически компетентных клеток E.coli 42
11.2.3. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК 43
П.2.4. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции 43
П.2.5. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей 43
П.2.6. Цитирование ДНК 43
-П.2.7. Векторы и плазмидныс конструкции, использованные в работе 44
П.2.8. Получение конструкций, экспрессирующих полипептиды полиовируса...44 П.2.9. Получение конструкций, экспрессирующих полноразмерные пирин и LIS1 и фрагменты LIS1 46
П.2.10. Получение конструкций для экспрессии РНК-шпилек для РНК- интерференции 46
П.4. Методы выделения и анализа белков 47
П.4.1. Получение тотальных клеточных лизатов 47
П.4.2. Приготовление ядерных экстрактов 48
П.4.3. Измерение концентрации белка по методу Бредфорда 49
П.4.4. Фракционирование белков, перенос на мембрану и иммунодетекция 49
П.4.5. Иммунопреципитация 51
П.4.6. Иммунофлуоресценция 52
II.4.7. Очистка белков методом аффинной хроматографии с исользованием GST
(GST-пулл-даун) 55
И.4.8. Измерение кверцетиназной активности пирина 55
II.5. Экспрессия белков in vitro 55
П.6. Индукция апоптоза с использованием TNFct и антител к FAS 55
И.7. Анализ ДНК-белковых взаимодействий методом сдвига электрофорезной подвижности 56
11.8. Метод цитофлуоресцентного анализа 56
11.9. Дрожжевая двугибридная система 57
III. Результаты и обсуждение 61
III. 1. Полиовирусные белки 2В и ЗА блокируют апоптоз, индуцированный фактором некроза опухоли. Ингибирование везикулярного транспорта белков между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи как потенциальный молекулярный механизм 61
III. 1.1. Получение мини-библиотеки плазмид, экспрессирующих неструктурные белки полиовируса 61
III. 1.2. Полиовирусные белки ЗА и 2В снижают чувствительность клеток HeLa и NIH3T3 к воздействию фактора некроза опухоли TNFa в присутствии ингибитора белкового синтеза или полиовирусной протеазы 2А 62
III. 1.3. ПВ белки 2В и ЗА подавляют везикулярный транспорт белков между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи 65
III.2. Полиовирусныи белок ЗА ингибирует TNF-зависимый апоптоз засчёт умеьшения количества TNF рецептора на клеточной поверности 66
III.2.1. Белок ЗА и брефельдин А уменьшают количество TNFR1 на клеточной поверхности 66
Ш.2.2. Полиовирусная инфекция подавляет деградацию ІкВа в ответ на обработку TNFcc 69
Ш.2.3. TNFR1 быстро исчезает с клеточной поверхности во время полиовирусной инфекции 70
П.2.4. Обработка TNFa не вызывает активацию NFKB В присутствии ЗА и брефельдина А 71
Ш.З. Поиск клеточных интеракторов полиовирусного белка ЗА методом скринирования библиотеки кДНК в дрожжевой двухгибридной системе 73
Ш.3.1. Изолирование клеточных белков, взаимодействующих с полиовирусным белком ЗА в дрожжевой двухгибридной системе 73
Ш.3.2. Подтверждение взаимодействия ЗА с пирином и LIS1 in vitro и in vivo 75
Ш.4. LIS1 как клеточный интерактор ЗА 77
Ш.4.1. Ко-локализация LIS 1 и ЗА в клетке 78
Ш.3.2. Гиперэкспрессия белка LIS1 снимает ингибирование белкового транспорта из ЭР в Гольджи полиовирусным белком ЗА 79
Ш.3.3. Гиперэкспрессия LIS1 препятствует уменьшению количества TNFR1 на клеточной поверхности, вызываемого ЗА 80
Ш.3.4. Экспрессия N- и С-концевых делеционных мутантов LIS1 уменьшает количество TNFR1 на клеточной поверхности 82
III.4. Пирин как клеточный интерактор ЗА 85
Ш.4.1. Колокализация ЗА и пирина в клетках HeLa, зараженных полиовирусом.86 Ш.4.2. Чувствительность полиовирусной инфекции к кверцетину коррелирует с экспрессией пирина в различных клеточных линиях 88
Ш.4.3. Кверцетин в высокой концентрации ингибирует развитие полиовирусной инфекции в клетках HeLa 90
И.4.4. Изменение количества пирина в клетках за счет гиперэкспрессии либо подавления методом РНК-интерференции модулирует устойчивость полиовируснои инфекции к воздействию кверцетина 91
Ш.4.5. Белок ЗА не меняет кверцетиназную активность пирина 94
IV. Модель молекулярных механизмов подавления анти-инфекционных защитных систем клетки-хозяина в экспериментальной полиовируснои инфекции 95
Выводы 97
Благодарности 98
Список работ, опубликованных по теме диссертации: 99
Список литературы: 99
- Пикорнавирусы
- Работа с культурами эукариотических клеток
- Изолирование клеточных белков, взаимодействующих с полиовирусным белком ЗА в дрожжевой двухгибридной системе
- Колокализация ЗА и пирина в клетках HeLa, зараженных полиовирусом.86 Ш.4.2. Чувствительность полиовирусной инфекции к кверцетину коррелирует с экспрессией пирина в различных клеточных линиях
Введение к работе
В процессе инфекции патогенный микроорганизм наносит повреждения органам и тканям организма-хозяина, что приводит к нарушению их функций и может повлечь за собой гибель всего организма. Организм-хозяин обладает широким арсеналом защитных анти-инфекционных средств, включая врожденный и приобретенный иммунный ответ на уровне организма и запрограммированную клеточную смерть (апоптоз) на уровне отдельной клетки, что в большинстве случаев позволяет организму эффективно справляться с инфекцией. В свою очередь, в процессе эволюции патогенные микроорганизмы приобрели способность к защите от анти-инфекционных процессов, развивающихся в пораженном организме ' .
Запрограммированная клеточная смерть, или апоптоз, является одним из методов борьбы организма-хозяина с внутриклеточными паразитами, такими как микоплазмы, токсоплазмы, облигатные внутриклеточные бактерии (хламидии, риккетсии) и вирусы. Подавление про-апоптотической программы клетки-хозяина необходимо для успешного размножения внутриклеточных паразитических микроорганизмов как на стадии репликации, так и на стадии высвобождения вновь образованных микроорганизмов (в особенности для микроорганизмов, имеющих литическую стадию развития, сопряженную с разрывом мембраны клетки-хозяина) " . Действительно, в процессе изучения взаимодействия внутриклеточных паразитов с клеткой-хозяином были обнаружены как вирусные, так и бактериальные белки, обладающие анти-апоптотическими свойствами (большой Т-антиген, Е6, vFLIP, IAP, р35, Е1В и др.). 6' 7. С другой стороны, поскольку активность белковых факторов микроорганизмов зачастую направлена на ключевые участки анти-инфекционных систем и про-апоптотических сигнальных каскадов клетки-хозяина, изучение защитных механизмов патогенных микроорганизмов
приводит к открытию новых сигнальных каскадов, вовлеченных в апоптоз, а также к более глубокому пониманию других важных аспектов клеточной физиологии.
Терапевтические анти-инфекционные методы включают стимуляцию защитных средств организма-хозяина (вакцинация, неспецифическая иммунная терапия) и непосредственное воздействие на патогенные микроорганизмы, ведущее к уничтожению либо препятствующее быстрому размножению патогена (антибиотики, бактериостатики, антивирусные препараты). Высокая способность к изменчивости позволяет микроорганизмам адаптироваться к действию лекарственных препаратов, что приводит к необходимости разработки во многих случаях принципиально новых, как более универсальных, так и более специфических, терапевтических подходов, что в свою очередь требует всестороннего изучения процессов, происходящих в пораженном организме на системном, клеточном и молекулярном уровнях. Следует отметить, что препараты, направленные на модификацию процессов, происходящих в организме-хозяине (например, активацию апоптоза в инфицированных клетках), менее зависят от изменчивости микроорганизма и потому более универсальны.
Наиболее простыми по стороению патогенными микроорганизмами являются вирусы, что делает их привлекательной моделью для изучения отношения «паразит-хозяин» на молекулярном уровне. Действительно, анти-апоптотические свойства были обнаружены для белков многих ДНК-содержащих вирусов, что привело к открытию таких важных про- и анти-апоптотических клеточных белков, как р53 и Akt ' .
Перед началом данной работы были опубликованы данные об анти-апоптотических свойствах полиовируса (семейство РНК-содержащих пикорнавирусов), однако молекулярные механизмы этих процессов были неизвестны 10~12. Позднее было показано, что течение полиовирусной инфекции сопровождается активацией элементов клеточной апоптотической
машины, однако полного развития апоптотической программы не происходит, что свидетельствует о наличии анти-апоптотических факторов в арсенале полиовируса 13. Аналогичные феномены были описаны для других членов семейства пикорнавирусов (вирусов Кокзаки , гепатита А, энцефаломиокардита и др.) " Пикорнавирусы являются самыми маленькими из известных вирусов, кодируя менее 20 белков. Таким образом, полиовирусная инфекция представляла собой новую удобную модель для изучения про- и анти-апоптотических механизмов при взаимодействии патогена с клеткой-хозяином.
Активации внутриклеточных апоптотических путей происходит в ответ на патологические изменения, производимые патогеном в клетке-хозяине, а также засчет активации специфических "рецепторов смерти" , на плазматической мембране клетки цитокинами, выделяемыми организмом в ответ на инфламматорные сигналы. Пермессивная полиовирусная инфекция приводит первоначально к запуску про-апоптотических механизмов в результате активности полиовирусных протеаз 2А, ЗС и, возможно, других белков, что сопровождается выбросом цитохрома С. Однако уже через 1,5 часа после начала инфекции сравнительно быстая апоптотическая программа подавляется и в клетке развивается более медленный цитопатический эффект, в результате чего вирус имеет достаточно времени для полного развития и производства потомства. Развитие цитопатического эффекта заканчивается лизисом клетки-хозяина и выпуском вновь синтезированных вирусных частиц 12. Экспонирование внутреннего содержимого клетки является инфламматорным стимулом. Нами было сделано предположение, что полиовирус, наряду с описанной выше способностью предотвращать развитие апоптоза, вызванного внутриклеточными стимулами, может обладать защитным механизмом против апоптоза, вызываемого активацией рецептора фактора некроза опухоли - TNFR1.
Действительно, стимуляция TNFR1 его лигандом, TNFD, приводит к одновременному запуску про- и антиапоптотических сигнальных каскадов. Анти-апоптотический путь связан с активацией NFkB с последующим синтезом его транскрипционных мишеней, которые ингибируют развитие апоптоза в клетке . Полиовирусная инфекция сопровождается подавлением кэп-зависимого белкового синтеза в результате активности протеазы 2А 18; таким образом, в клетке, зараженной полиовирусом, заблокирована анти-апоптотическая ветвь каскада, вызываемого активацией TNFR1, что делает клетку высокочувствительной к TNFct-индуцируемому апоптозу.
Данная работа посвящена изучению молекулярных механизмов подавления анти-инфекционных защитных систем клетки-хозяина в экспериментальной полиовирусной инфекции, направленных в частности против апоптоза, индуцированного фактором некроза опухоли.
В ходе исследования были поставлены следующие задачи:
Определение полиовирусных белков, защищающих клетки HeLa и НЕК293 от апоптоза, индуцированного фактором некроза опухоли в присутствии ингибитора белкового синтеза циклогексимида.
Изучение способности полиовирусных белков ЗА и 2В ингибировать транспорт TNF рецептора (TNFR) на клеточную поверхность.
Определение клеточных мишеней белка ЗА с использованием дрожжевой двухгибридной системы.
Исследование механизма ингибирования транспорта TNFR за счет взаимодействия ЗА с компонентом динеинового моторного комплекса LIS1.
Изучение влияния уровня экспрессии обнаруженной клеточной мишени ЗА - кверцетиназы пирин - на протекание ПВ инфекции.
Пикорнавирусы
Семейство пикорнавирусов (Picornaviridae, от исп. pico — малая величина и сокр. англ. RNA — рибонуклеиновая кислота ) объединяет лишённые внешней мембранной оболочки вирусы, содержащие одноцепочечную геномную РНК положительной полярности, заключенную в белковый икосаэдный капсид (IV группа по системе классификации вирусов по Балтимору 19. Пикорнавирусы являются самыми маленькими из известных вирусов (размер капсида менее 30 нм, размер генома - 7-9 тысяч нуклеиновых оснований). Размножение пикорнавирусов происходит в цитоплазме клеток бактерий, растений, животных и человека. Пикорнавирусы подразделяются на 9 родов; двумя основными категориями являются энтеровирусы и риновирусы. Каждый род пикорнавирусов представлен множеством серотипов 20 (Табл.1).
Риновирусы (от греч. rhis — нос) - наиболее распространенные инфекционные агенты, поражающие человека - являются причиной 30-50% случаев острых респираторных заболеваний (катаров верхних дыхательных путей). Известно около 100 серотипов риновирусов человека групп А и Б. Риновирус распространяется воздушно-капельным и контактным (с контаминированных поверхностей, в том числе при персональных контактах) путями. После попадания в организм человека, риновирус связывается с рецептором ICAM-1 (intracellular adhesion molecule -1) клеток респираторного эпителия верхних респираторных путей в течение 15 минут; инкубационный период длится 8-10 часов. Нижние респираторные пути поражаются реже, поскольку вирус плохо растет при температуре 37С 21.
Энтеровирусы (от греч. enteron — кишка) поражают кишечник человека и позвоночных животных, откуда они могут распространяться и поражать другие органы. Частота энтеровирусных инфекций во всем мире достигает несколький сотен миллионов случаев в год; инфекции вызывают широкий спектр заболеваний, от обычной простуды до миокардита и асептрического менингита. К энтеровирусам относятся вирусы полиомиелита (3 серотипа), вызывающие поражение центральной нервной системы и параличи, эховирусы - наиболее частая причина асептического менингита, вирусы Коксаки (группы А и Б, 30 серотипов) — возбудители энцефаломиокардита новорожденных, перикардита, конъюнктивита и других болезней человека; вирусы Коксаки группы Б поражают производящие инсулин вета-клетки панкреатической железы и могут вызывать дибет 1-го типа, а также служат причиной простудных заболеваний, осложненных кишечными расстройствами 22.
К пикорнавирусам относятся также вирусы ящура, гепатита А, энцефаломиокардита и др. При всем многообразии вызываемых заболеваний, не-структурные белки пикорнавирусов разных видов отличаются поразительным сходством. Многообразие заболеваний является следствием отличий в строении капсидных белков, которое и определяет спектр потенциальных клеток-хозяев через наличие специфических рецепторов на поверхности этих клеток, с которыми способен провзаимодействовать данный вирус. Так, геном вируса Кокзаки А21 имеет высокий уровень идентичности с полиовирусом, однако вирус Кокзаки А21 поражает верхние дыхательные пути, в то время как развитие полиовирусной инфекции приводит к поражению моторных нейронов . Действительно, рецептор вируса Кокзаки А21 (ICAM-1) экспрессируется клетками эндотелия, в то время как рецептор полиовируса CD155 присутствует, в частности, на поверхности моторных нейронов спинного мозга . Трансгенные мыши, экспрессирующие ICAM-1 человека во всех тканях, подвержены заражению вирусом Кокзаки А21. Было продемонстрировано, что инфекция этих трансгенных мышей вирусом Кокзаки А21 приводит к поражению ЦНС и развитию полиомиелита 26. В другой работе было показано, что химерный вирус, имеющий капсид полиовируса и репликационные белки вируса Кокзаки А кластера С (C-CAV), нейровирулентен в мышах, трансгенно экспрессирующих CD155 2?. Таким образом, высокогомологичные неструктурные белки различных типов пикорнавирусов имеют сходные функции.
Филогенетический анализ аминокислотной и нуклеотидной последовательностей полиовируса дает основания предположить, что полиовирус эволюционировал от предшественника вируса Кокзаки А кластера С засчет мутаций в капсидных белках, позволивших заражать клетки, экспрессирующие CD 155. Некоторые исследователи полагают, что прекращение вакцинации против современного полиовируса, находящегося на грани исчезновения из человеческой популяции, может создать условия для возникновения нового полиовирус-подобного вируса на основе C-CAV путем переключения рецепторов (ICAM-1 на CD155)
Разнообразие капсидов не ограничивается экспрессией , молекул, распознаваемых различными рецепторами: к примеру, капсид энтеровирусов обеспечивает кислотоустойчивость, что позволяет вирусам этого вида проходить через желудок и поражать кишечник 28. Таким образом, определенные риновирусы и вирусы Кокзаки, взаимодействующие с общим рецептором на поверхности эпителиальных клеток, поражают различные виды эпителия.
Работа с культурами эукариотических клеток
Краткая характеристика культур клеток, использовавшихся в работе, приведена в Таблица 5. Если не указано иначе, клетки культивировали в среде Игла, модифицированной Дюльбекко (DMEM), дополненной 2 мМ L-глутамина, 4.5 г/л глюкозы, 100Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (BioWhitacker). Культивирование проводили при 37С во влажной атмосфере с 5% С02.
Клетки рассаживали на культуральные чашки за 24 часа до трансфекции так, чтобы из плотность на момент трансфекции не превышала 70% монослоя. Трансфекцию осуществляли липосомным методом с помощью LipofectAMlNE и Plus реагентов (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя. Вкратце, трансфецируюмую ДНК и Plus реагент разводили в бессывороточной среде в рекомендуемых соотношениях и инкубировали 15 мин при комнатной температуре, затем к смеси добавляли разведенный LipofectAMlNE и для образования липосом инкубировали еще 15 мин. Тем временем на клетках меняли среду на бессывороточную. Образовавшиеся ДНК-липосомные комплексы добавляли к клеткам и инкубировали 6 часов, затем среду заменяли на полную. Для экзогенной экспрессии белков, клетки инкубировали не менее 24 часов с момента трансфекции, а для полноценной РНК-интерференции и максимального подавления мРНК-мишени shPHK экспрессировали не менее 48 часов. Если используемый вектор не содержал GFP, то для определения эффективности трансфекции параллельно трансфецировали клетки плазмидой pEGFP-Nl (Clontech). Через 24-48 часов анализировали количество клеток под микроскопом в ультрафиолетовом свете. Трансфецированные клетки при этом приобретают характерное зеленое свечение.
Для получения лентивирусных частиц использовали линию клеток НЕК293Т, обеспечивающих исключительно высокую экспрессию белков с экзогенных конструкций. Клетки рассевали в соотношении 1:4 за 16 часов до трансфекции так, чтобы на момент трансфекции их плотность составляла около 70% монослоя. Трансфекцию проводили как описано выше.
Проводили контрансфекцию следующих плазмид: собственно лентивирусной конструкции, кодирующей вирусный РНК-геном; двух (pGagl и pRev2) плазмид-помощников, обеспечивающих экспрессию всех структурных белков, обратной транскриптазы и протеазы вируса; вирионы псевдотипировали оболочечным белком G вируса везикулярного стоматита (pVSV-G), не требующим клеточных рецепторов для инициации слияния с мембраной и, таким образом, обеспечивающим высокую эффективность трансдукции и широкий спектр восприимчивых клеток. Среда с трансфецированных клеток, содержащая рекомбинантные вирионы, собиралась через 24, 36, 48 и 72 часа, фильтровалась через 0.44 мкм стерильные фильтры (Millipore) и использовалась для инфекции клеток-мишеней. Вирусные стоки хранили замороженными при -70С. Для снижения концентрации токсичных клеточных метаболитов в вирусных стоках при необходимости использовали среду с пониженным содержанием сыворотки (5% или 2.5% ЭТС).
Для заражения клеток-мишеней за 16-24 часа до обработки их рассаживали так, чтобы плотность составила 50-70% монослоя. Вирусные стоки разбавляли полной средой, для повышения эффективности инфекции добавляли катионный агент полибрен в концентрации 4-8 мкг/мл и добавляли к клеткам. Заражение проводили в минимальном объеме среды в течение 4-8 часов. Для повышения вероятности трансдукции труднозаражаемых клеток инкубацию проводили на ротационном встряхивателе (20-30 об/мин).
Для снижения токсичности вирусных стоков и повышения титра вирусных частиц при необходимости их концентрировали с помощью ПЭГ-8000. К свежесобранным вируссодержащим супернатантам добавляли 1/3 объема стерильного 40% раствора ПЭГ-8000, приготовленного на ФСБ, перемешивали и инкубировали на льду не менее 8 часов (в таком состоянии вирусные частицы стабильны по крайней мере в течение 7 дней). Связанные вирионы собирали центрифугированием при +4С, 8000 g в течение 15 мин, тщательно удаляли супернатант, а осадок ресуспендировали в ФСБ или полной ростовой среде, а аликвоты хранили в замороженном состоянии при 70С.
Известно, что эффективный титр различных параллельных вирусных препаратов, как правило, колеблется в пределах 2-3 раз. При каждом получении вирусных стоков дополнительно упаковывали лентивирусную конструкцию, экспрессирующую GFP. Для проверки титра вируса использовали клетки линии HeLa. Клетки рассаживали из расчета 1х105 клеток на лунку 12-луночной платы и заражали серийными разведениями вирусного стока в течение 4 часов. Для повышения эффективности трансдукции в препарат вируса добавляли поликатионный реагент полибрен (Sigma) до конечной концентрации 5 мг/мл. Флуоресценцию GFP оценивали через 48 часов после инфекции при помощи проточного цитометра (см. ниже). Анализу подлежали только живые клетки; регистрировали по 10000 событий.
Для оценки числа интегрированных копий провируса в геном клеток проводили ПЦР-амплификацию участка WPRE лентивирусной конструкции. В реакции использовали 100 нг геномной ДНК клеток и специфические праймеры WPRE-прямой 5 CATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTC-3 и WPRE-o6paTHbm5 -GGATTGAGGGCCGAAGGGACGTAG-3\
Изолирование клеточных белков, взаимодействующих с полиовирусным белком ЗА в дрожжевой двухгибридной системе
Клетки на чашке (субконфлюэнтный монослой), промытые 2 раза холодным буфером PBS, лизировали на снегу на 10-см чашке Петри в 350-600 мкл охлажденного лизирующего буфера RTPA (RTPA буфер: 50мМ трис-НС1 рН 7.4; 150 мМ NaCl; 1% деоксихолат Na, 1% NP-40, 0.1% додецилсульфат Na, 100 мкМ PMSF, ІмкМ пепстатин А, ІмкМ Е64) К этому буферу, непосредственно перед использованием, добавляли ингибиторы протеаз: пепстатин А, апротинин и Е64 (Sigma) до конечных концентраций 1 мкг/мл. Инкубировали на льду в течение 2-5 минут, а затем собирали скребком и переносили лизат в охлажденные 1.5-мл пробирки. Центрифугировали в течение 10 минут на холоду, супернатант переносили в чистую пробирку и хранили на -20С.
Для получения ядерных экстрактов клетки лизировались в низкосолевом буфере (20 мМ HEPES рН 7.6, 10 мМ NaCl, 1.5 мМ MgCl2, 0.2 мМ ЭДТА, 0.1% Тритон Х-100. 1 мМ ДТТ, 20% глицерин). Центрифугировали ядра 10 сек при 14000 об./мин, супернатант тщательно отбирали, а осадок растворяли в 50-100 мкл буфера NE (лизирующий буфер + NaCl до концентрации 500 мМ). Для полного лизиса пробирки качали на качалке 45 мин при 4С, затем центрифугировали 5 мин при 14000 об./мин. Надосадочную жидкость переносили в новую пробирку, и полученные ядерные экстракты хранили при -20-40С.
При подготовки образцов к электрофорезу к нужному объему экстракта добавляли половину объема буфера для нанесения (150 мМ Трис-НС1 рН 6.8, 6% SDS, 300 мМ ДТТ, 30% глицерин и 0.3% бромфеноловый синий), затем денатурировали образцы 5 мин при 95С, центрифугировали 5-10 мин при 14000 об/мин и наносили в гель.
При подготовке образцов к электрофорезу, к аликвотам белкового лизата добавляли равный объем 2х буфера для нанесения (150 мМ Трис-НС1, рН 6.8, 6% додецилсульфат натрия, 300 мМ ДТТ, 30% глицерол и 0,3% бромфеноловый синий), затем денатурировали образцы 5 мин при +95С и наносили на гель.
Электрофорез белковых экстрактов проводили в 4-12% или 4-20% градиентном полиакриламидном геле (Invitrogen) в буфере для электрофореза (25 мМ глицин, 250 мМ Трис, 0.1% SDS) и белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-P (Amersham). При этом использовали буфер для переноса (39 мМ глицин, 48 мМ Трис, 37 мкМ SDS, 20% метанол) и прибор XCell II Blot (Invitrogen). Перенос осуществляли в течение ночи при постоянном токе 40 мА. Для контроля равного нанесения белков и эффективности и полноты их переноса перед иммунодетекцией мембраны окрашивали Ponceau S и фотографировали.
Для иммунодетекции мембрану инкубировали в блокирующем ФСБ, содержащем 5% сухого обезжиренного молока и 0.1% Tween-20 в течение 40 минут при комнатной температуре. Далее проводили инкубацию со специфическими первичными антителами (в концентрации от 100 нг/мл до 2 мкг/мл в соответствии с рекомендациями производителя) в том же растворе в течение 1 часа После трехкратной отмывки мембрану инкубировали еще 1 час с видоспецифичными вторичными антителами (Santa-Cruz), конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP, horse radish peroxidase), в концентрации от 40 нг/мл до 80 нг/мл в соответствии с рекомендациями производителя После трехкратной отмывки от несвязавшихся вторичных антител комплекс «белок/первичное антитело/вторичное антитело» детектировали с помощью ECL-реагентов (Amersham) в соответствии с инструкцией производителя. Список использованных антител приведен в Таблице 7.
Ко-локализация ЗА и пирина в клетках HeLa, зараженных полиовирусом.86 Ш.4.2. Чувствительность полиовирусной инфекции к кверцетину коррелирует с экспрессией пирина в различных клеточных линиях
Кверцетиназная активность пирина была продемонстрирована для пирина, выделенного из E.Coli и из человеческих клеток. Чтобы оценить потенциальную значимость кверцетиназной активности пирина для ПВ инфекции, была изучена способность кверцетина подавлять ПВ инфекцию. Из предыдущих работ было известно, что в отличие от производного кверцетина, 3-метилкверцетина, который значительно снижает эффективность ПВ инфекции в клетках HeLa, кверцетин в концентрациях ниже бмкМ не подавляет полиовирусную инфекцию в этих клетках Рис. 21. Чувствительность полиовирусной инфекции к кверцетину зависит от типа клеточной линии, (а) Титр полиовируса в клетках HeLa и NKE, инфецированных в течение 24 ч. (МИ 1) в присутствии кверцетина в различных концентрациях; (б,в) Вестерн блот и его количественная обработка: кверцетин подавляет развитие полиовируса в клетках NKE и НЕК293 в существенно более низких концентрациях, чем в HeLa. Клетки были инфецированы ПВ (МИ 10) в течение Зч. (HeLa и НЕК293) и 5 ч. (NKE) в присутствии кверцетина в различных концентрациях (ПВ инфекция развивается более медленно в NKE). Аккумуляция ПВ белков оценивалась Вестерн блоттингом 5 мкг тотального белка с антителами, распознающими капсидный белок полиовируса. Hsp90 был использован как контроль концентрации белковых лизатов, гуанидин НС1 (ImM) - как позитивный контроль подавления ПВ инфекции; (г,д) Вестерн блот и его количественная обработка: экспрессия пирина выше в 4-5 раз в клеточной линии HeLa по сравнению с НЕК293 и NKE. 5 mg белковых лизатов клеток HeLa, НЕК293 и NKE были проанализированы с использованием антител к пирину.
Мы сравнили влияние различных доз кверсетина на протекание полиовирусной инфекции в клеточных линиях эпителиального происхождения HeLa, NKE и НЕК293 и экспрессию пирина в этих клеточных лининях.
Ингибиторный эффект кверцетина на репликацию полиовируса оценивали методом титрования (рис. 21а) и методом Вестерн-блоттинга с антителами, специфичными к полиовирусным белкам (рис. 21б,в). Клетки HeLa, NKE и НЕК293 были инфецированы полиовирусом (МИ 1) в течение 24 часов в присутствии кверцетина в различных концентрациях. Обработка клеток кверцетином снижала накопление полиовирусных белков в клетках НЕК293 и NKE. Результаты этих экспериментов показывают, что кверцетин не влияет на репликацию полиовируса в клетках HeLa в концентрациях ниже бмкМ, но ингибирует полиовирусную инфекцию более чем в 5 раз в клетках НЕК293 и NKE начиная с концентрации 2мкМ (рис. 21в).
Оценка количества пирина в клетках HeLa, NKE и НЕК293 была сделана методом Вестерн-блоттинга с использованием антител, специфически распознающих пирин. Экспрессия пирина была в 4-5 раз выше в HeLa по сравнению с NKE и НЕК293 (рис. 21в,г). Таким образом, количество пирина хорошо коррелирует с устойчивостью полиовирусной инфекции к обработке кверцетином в этих клеточных линиях.
Кверцетин в высокой концентрации ингибирует развитие полиовирусной инфекции в клетках HeLa.
Поскольку экспрессия пирина в клетках HeLa существенно выше, чем в клетках нормального эпителия почки (NKE), было проверено влияние более высокой концентрация кверцетина на репликацию полиовируса (рис. 22). Эффективность ПВИ была исследована в контрольных клетках HeLa и NKE, и в тех же клетках, обработанных высокой дозой кверцетина (бОмкМ) в течение
Кверцетин ингибирует полиовирусную инфекцию, (а) Окраска метиленовой синькой клеток HeLa и NKE, зафиксированных формальдегидом: предобработка кверцетином (бОмкМ в течение 3 часов до инфекции), ПВ инфекция (МИ 0.1) 16 часов; (б) количественное представление результатов (а).
. Изменение количества пирина в клетках за счет гиперэкспрессии либо подавления методом РНК-интерференции модулирует устойчивость полиовирусной инфекции к воздействию кверцетина.
Чтобы исключить влияние особенностей конкретной клеточной линии на кверситиназную активность пирина, а также на эффективность репликации полиовируса, и проверить непосредственный эффект увеличения либо уменьшения количества пирина на репликацию полиовируса при обработке кверцетином в контексте одной и той же клеточной линии, пирин был гиперэкспрессирован либо подавлен методом РНК-интерференции в клетках NKE и HeLa, соответственно. Были созданы конструкции на основе лентивирусного экспрессионного вектора pLVPuro и лентивирусного вектора для введения siRNA pLSLPuro, несущих ген устойчивости к пуромицину. Конструкции были упаковываны в лентивирусные частицы в клетках-упаковщиках НЕК293Т, полученный лентивирус был использован для инфекции клеток с последующей селекцией на пуромицине. Для создания контрольных линий были использованы пустой вектор pLV_Puro (NKE) и контрольная конструкция pLSL_Puro_Luc, несущая siRNA к гену люциферазы (HeLa). Полученные клеточные линии NKE_Pirin и HeLa siPirin были инфецированы полиовирусом (МИ 10) одновременно с контрольными линиями №СЕ_вектор и HeLa_siLuc в течение 3-4 часов. Различные концентрации кверцетина были добалены за 1 час до инфекции. Эффективность полиовирусной репликации оценивалась методом Вестерн-блоттинга с использованием антител, специфических к капсидному белку полиовируса. Уровень экспрессии пирина оценивался Вестерн-блоттингом с использованием антител к пирину.
Как видно из рис. 23а,б, гиперэкспрессия пирина в клетках NKE приводит к повышению устойчивости полиовирусной репликации к ингибиторному эффекту низких доз кверцетина. Действительно, в клетках NKE_Pirin, обработанных кверцетином в концентрации 2мкМ, происходит аккумуляция полиовирусных белков ЗА/ЗАВ, в отличие от контрольных клеток. Повышенное количество пирина само по себе не приводит к увеличению репликации полиовируса, следовательно, резистентность полиовирусной инфекции к воздействию кверцетина коррелирует с уровнем пирина в этих клетках. С другой стороны, в результате понижения уровня пирина в клетках HeLa, устойчивость полиовируса к кверцетину существенно уменьшилась (рис. 23). Действительно, обработка клеток HeLasiLuc в течение полиовирусной инфекции кверцетином в концентрации 2мкМ не меняла количества капсидного белка; кверцетин в концентрации бмкМ снижал количество капсида в 1,5 раза. В то же время, в клетках HeLa_siPirin (количество пирина в которых было снижено более чем в 10 раз) обработка кверцетином в концентрации 2мкМ снижала капсидный белок в 3 раза; использование концентрации бмкМ приводило к практически полному подавлению полиовирусной инфекции. Результаты Вестерн-блоттинга были
