Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обоснование эколого-иммунологического подхода к изучению резистентности (обзор литературы) 17
1.1. Современные представления об адаптации и ее механизмах 17
1.2. Особенности экологической стратегии и биотических связей микроорганизмов 30
1.3. Экологические аспекты реактивности и резистентности макроорганизма.. 41
1.4. Функциональная система иммунного гомеостаза 52
1.5. Формирование адаптивного иммунитета к инфекции и методы его оценки 58
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. Материалы и методы 74
2.1. Объекты исследования 74
2.1.1. Экспериментальные животные 74
2.1.2.Бактерии и бактериальные антигены 75
2.2 Методы исследований. 79
2.2.1. Определение резистентности организма в тесте активной защиты животных от вирулентных бактерий. 79
2.2.2.Выделение органов и клеток иммунной системы грызунов 79
2.2.3. Определение миграции и пролиферации стволовых кроветворных клеток костного мозга 81
2.2.4 .Определение электрофоретической подвижности клеток органов иммунной системы и крови 84
2.2.5. Идентификация популяций лимфоцитов органов иммунной системы грызунов 84
2.2.6. Определение антителообразующих клеток в селезенке 86
2.2.7. Определение иммуноглобулинов в сыворотке крови 88
2.2.8. Выделение альвеолярных и перитонеальных макрофагов 88
2.2.9. Определение фагоцитарной активности макрофагов 89
2.2.10. Определение синтеза эндогенных цитокинов 90
2.2.11. Определение концентрации адениловых нуклеотидов и энергетического заряда крови 90
2.2.12. Определение активности креатинфосфокиназы в плазме крови животных 91
2.2.13. Выделение субклеточных фракций (ядер и митохондрий) 92
2.2.14. Определение 1.1-оксикортикостероидов в биологических жидкостях организма грызунов 92
2.3. Методы статистической обработки полученных результатов 94
Глава 3. Активность факторов естественной резистентности организма лабораторных животных при контакте с бактериальными клетками 96
3.1. Аналитический обзор 96
3.2. Изучение экологической стратегии разных видов бактерий по отношению к факторам естественной резистентности макроорганизма 111
3.2.1. Характеристика энтеробактерий 113
3.2.2. Изучение активности процесса фагоцитоза разных видов энтеробактерий 121
3.2.3. Изучение индукции эндогенных цитокинов в процессе фагоцитоза разных видов энтеробактерий 127
3.2.4. Характеристика стафилококков 138
3.2.5. Изучение активности процесса фагоцитоза разных видов стафилококков 141
3.2.6. Изучение индукции эндогенных цитокинов в процессе фагоцитоза разных видов стафилококков 148
3.3. Обсуждение результатов 156
Глава 4. Механизмы формирования резистентности организма лабораторных животных при введении живой чумной вакцины 161
4.1. Аналитический обзор 161
4.2. Миграция из костного мозга полипотентных стволовых клеток у вакцинированных животных 165
4.3. Изменение популяционного состава и электрофоретической подвижности лимфоцитов органов иммунной системы и крови у лабораторных животных, иммунизированных живой чумной вакциной 172
4.4. Активность процесса антителообразования при первичном и вторичном иммунном ответе в организме вакцинированных лабораторных животных 212
4.5. Обсуждение результатов 217
Глава 5. Механизмы формирования резистентности организма лабораторных животных при иммунизации капсульным или соматическим антигенами чумного микроба. 221
5.1. Аналитический обзор 221
5.2. Миграция из костного мозга полипотентных стволовых клеток у иммунизированных антигенами лабораторных животных 233
5.3. Изменение популяционного состава и электрофоретической подвижности лимфоцитов органов иммунной системы и крови у иммунизированных антигенами лабораторных животных 241
5.4. Активность процесса антителообразования при первичном и вторичном иммунном ответе в организме иммунизированных капсульным антигеном лабораторных животных 247
5.5. Обсуждение результатов 251
Глава 6. Изменения в организме лабораторных животных при иммунизации лектином МБ 22 чумного микроба 254
6.1. Аналитический обзор 254
6.2. Оценка стрессорного действия лектина МБ 22 чумного микроба на организм экспериментальных животных 257
6.3. Оценка изменений энергетического статуса организма животных, иммунизированных лектином МБ 22 чумного микроба 263
6.4. Изменение популяционного состава и электрофоретической подвижности лимфоцитов органов иммунной системы и крови у иммунизированных лектином МБ 22 животных 266
6.5. Обсуждение результатов 274
Глава 7. Изучение естественной и приобретенной резистентности к чумной инфекции у инбредных и радомбредных грызунов. 276
7.1. Аналитический обзор 276
7.2. Изучение естественной резистентности и уровня иммунологической защиты в организме бестимусных мышей 286
7.3. Изучение естественной и приобретенной резистентности к чумной инфекции в организме инбредных мышей с различным Н-2 гаплотипом 291
7.4. Сравнительное изучение популяционного состава лимфоцитов органов иммунной системы и крови инбредных и радомбредных мышей в норме и при вакцинации 299
7.5. Обсуждение результатов 315
Глава 8. Эколого-иммунологические особенности формирования резистентности к чумной инфекции у полуденных песчанок 320
8.1. Аналитический обзор 320
8.2. Изучение популяционного состава и электрофоретической подвижности лимфоцитов органов иммунной системы и крови у полуденных песчанок 328
8.3. Изменения в популяционном составе лимфоцитов органов иммунной системы и крови у полуденных песчанок при иммунизации 335
8.4 Обсуждение результатов 339
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 343
ВЫВОДЫ 360
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 364
- Экологические аспекты реактивности и резистентности макроорганизма..
- .Определение электрофоретической подвижности клеток органов иммунной системы и крови
- Изучение индукции эндогенных цитокинов в процессе фагоцитоза разных видов энтеробактерий
Введение к работе
Актуальность проблемы. Процесс адаптации микроорганизмов к таким экологическим нишам, как организм человека или животных, формирует различные нормы реакции взаимодействующих сторон как следствие адаптациоге-неза к существованию в новых условиях среды. Эти процессы важны и для макроорганизма - сохранения его жизнедеятельности в условиях изменения характера физиологических, биохимических и генетических процессов, обеспечивающих гомеостаз. Выяснение механизмов этого взаимодействия является одной из важнейших проблем современной экологии (Казначеев, 1980; Ивантер и др., 1985; Нетрусов и др., 2004; Atlas, Bartha, 1998).
Приспособление бактерий к организму человека и животных происходит на разных уровнях биологической интеграции - от клеточного до популяционно-видового. При этом ключевая роль в адаптационных процессах принадлежит механизмам, реализующимся на клеточном уровне (Сиротинин, 1965; Громов, Павленко, 1989). Сведения о физиологической, биохимической и молекулярной структуре приспособительных реакций макроорганизма в ответ на действие адаптационных факторов микроорганизмов противоречивы и недостаточны, чтобы составить четкое представление об общих экологических закономерностях адаптации к действию возбудителей инфекций, а бактерий - к новой среде обитания. Признание сложности и многофакторности процесса адаптации предполагает выделение ряда компонентов, обеспечивающих поддержание функционального состояния гомеостатических систем и приспособление организма в целом в условиях инфекционной нагрузки со стороны микроорганизмов (Ковальчук, Ястребов, 2003). В связи с этим, теоретический и практический интересы представляет исследование механизмов устойчивой адаптации как под влиянием отдельных антигенных структур бактерий, так и всего ком плекса факторов патогенности, обеспечивающих жизнедеятельность бактериальных клеток. Изучение механизмов повреждения и стратегии адаптации организма человека и животных при воздействии адаптационных факторов микроорганизмов дает возможность оценить степень патогенности последних и найти подходы к разработке эффективных способов профилактики различных повреждений и заболеваний (Авербах и др., 1985; Покровский и др., 1998; Роит и др., 2000). Дальнейшее развитие представлений о механизмах адаптации как макро-, так и микроорганизма, невозможно в отрыве от изучения состояния естественной и приобретенной резистентности макроорганизма и механизмов, определяющих и регулирующих ее.
В литературе на настоящий момент отсутствуют сведения об активности ведущих механизмов естественной резистентности - процесса фагоцитоза и синтеза провоспалительных эндогенных цитокинов - в сравнительном аспекте на внедрение в макроорганизм патогенных и условно-патогенных энтеробакте-рий и стафилококков. Представляется возможным на основе этих сведений судить не только о способности бактерий к персистенции в организме, но и о характере экологической стратегии паразитизма отдельных видов.
Для получения новых данных об экологии безусловных патогенов макрр-организма, возбудителей природно-очаговых инфекций, важным, на наш взгляд, являлось исследование механизмов приобретенной резистентности в сравнительном аспекте при инфекции и иммунизации на примере возбудителя чумы и его антигенов. Чума остается модельной инфекцией, на возбудителе которой изучаются все универсальные механизмы, обеспечивающие вирулентные свойства бактерий (Проценко и др., 1983; Кутырев, 1997; Perry, Fetherston, 1997; Bmbaker, 2000; Анисимов, 2002). Одновременно с изучением этих вопросов представляется важным исследование механизмов реализации иммуноген-ных свойств возбудителя на различных функционально-структурных уровнях иммунной системы макроорганизма.
Актуальность данной проблемы и ее состояние предопределили цель работы: исследование адаптивных систем макроорганизма по уровню естественной и приобретенной резистентности на модели лабораторных животных и грызунов из природных популяций, механизмов структурно-функциональных перестроек, участвующих в мобилизации и регуляции защитных систем организма, в процессе адаптации к действию факторов патогенности бактерий с различными экологическими особенностями паразитизма.
Основные задачи исследования
1. Обосновать эколого-иммунологический подход к изучению резистентности макроорганизма при инфекции и иммунизации и выбор наиболее адекватных методов оценки естественного и адаптивного иммунитета.
2. Оценить в сравнительном аспекте экологические стратегии преодоления основных механизмов естественной резистентности макроорганизма патогенными и условно-патогенными бактериями.
3. Установить роль миграции и пролиферации стволовых кроветворных клеток при адаптации организма экспериментальных животных к живой чумной вакцине и отдельным антигенам чумного микроба; изучить ,динамику и особенности изменений в популяционном составе лимфоцитов органов иммунной системы в процессе формирования адаптивного иммунитета к чумной инфекции.
4. Определить на клеточном уровне роль антителогенеза в эффективности приобретенной резистентности к возбудителю чумы; установить взаимосвязь между характером и уровнем изменений показателей клеточного и гуморального иммунитета к чумной инфекции и его протективной активностью.
5. Изучить адаптивные реакции организма животных на введение лектина вакцинного штамма ЕВ чумного микроба по изменению показателей гормонального, метаболического и иммунного статуса.
6. Выяснить значение тимуса в развитии у животных полноценного адаптивного иммунитета к чумной инфекции на модели инбредных бестимусных мышей; установить зависимость эффективности резистентности от генотипа животного и природы иммунизирующего агента на модели инбредных мышей разных гаплотипов.
7. Провести исследования естественной и приобретенной резистентности к чумной инфекции у диких грызунов из естественных мест обитания - полуденных песчанок.
Научная новизна. Впервые научно обоснован эколого-иммунологический подход к изучению резистентности макроорганизма при инфекции и иммунизации, позволяющий оценить формирование адаптационного иммунитета и его функциональные проявления на различных уровнях организации иммунной системы, и дана оценка основным экологическим особенностям паразитизма патогенных и условно-патогенных бактерий.
Исследованы механизмы естественной и приобретенной резистентности в организме разных видов лабораторных и диких грызунов на всех уровнях биологической интеграции: молекулярном, клеточном, органном, организменном.и популяционном. Впервые поэтапно охарактеризован процесс формирования эффективного адаптивного иммунитета к чумной инфекции от пускового механизма иммунопоэза - миграции и пролиферации полипотентных стволовых кроветворных клеток - до становления в организме экспериментальных животных состояния невосприимчивости к возбудителю чумы. Установлено, что при адаптации организма экспериментальных животных к живой чумной вакцине и капсульному антигену чумного микроба происходит дозозависимое усиление миграции из костного мозга и пролиферации стволовых кроветворных клеток. Показано, что изменения в популяционном составе лимфоцитов органов иммунной системы адекватно отражают адаптивные сдвиги при формировании резистентности к чумной инфекции в организме привитых живой чумной вакциной мышей.
Впервые на клеточном уровне изучена активность антителогенеза в динамике формировании резистентности к чумной инфекции. Установлен факт незначительной стимуляции процессов пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов в антителообразующие клетки на фоне эффективной резистентности при однократном воздействии на организм экспериментальных животных живой чумной вакциной или капсульным антигеном чумного микроба.
Новым является сравнительный анализ уровня естественной и приобретенной резистентности к чумной инфекции у линейных животных разных гап-лотипов. Впервые установлено, что в основе различий естественной резистентности и инфекционной чувствительности у двух изученных подвидов полуденной песчанки лежат механизмы дифференцировки зрелых форм лимфоцитов и разная степень их функциональной активности.
Научно-практическая значимость. Предложено сочетание метода регистрации электрофоретической подвижности лимфоцитов органов иммунной системы и крови с последующей идентификацией поверхностных маркеров в клеточных фракциях, что позволяет получить их функциональные характеристики по пролиферативной активности и степени зрелости. Такое комплексное исследование состава лимфоцитов позволяет получить иммунологические параметры, которые могут быть использованы для оценки иммунного статуса организма привитых против чумы животных. Разработан эффективный диагно-стикум и внесены собственные модификации в метод пассивного локального гемолиза в геле для определения антителообразующих клеток в иммунном к чуме организме. Предложенная методика использования модели Р.В. Петрова и P.M. Хаитова (1972) с введением в организм экспериментальных животных антигенов чумного микроба через 2-3 часа после тотального облучения рекомендована для изучения вопросов стимуляции процессов миграции и пролифера ции ПСКК в иммунном к чуме организме. Полученные данные имеют значение для оценки результатов опытов при отборе новых вакцинных штаммов, составлении рациональных схем иммунизации, при экспериментальной разработке вопросов стимуляции иммуногенеза к чуме.
Внедрение результатов работы в практику. По материалам экспериментальных исследований составлены методические рекомендации: "Применение разделительного клеточного электрофореза с последующим тестированием фракций методами розеткообразования для изучения популяционного состава лимфоцитов в организме вакцинированных против чумы животных" и "Использование хлористого хрома в качестве активатора насадки капсульного антигена чумного микроба на нативные эритроциты для определения специфических АОК при иммунизации против чумы в эксперименте", которые были одобрены Ученым Советом ВНИПЧИ "Микроб" (протокол № 4 от 20.03.90) и утверждены директором института 20.03.90 года.
Издано в соавторстве научно-информационное пособие «Лектины в иммунологии» (Саратов, изд-во СГМУ, 2001), методические рекомендации «Изучение влияния лектинов на активность процесса фагоцитоза патогенных бактерий» и «Изучение влияния лектинов на синтез цитокинов макрофагами» (Саратов, изд-во СГУ, 2004).
Материалы диссертационного исследования внедрены в учебный процесс и используются при чтении лекций общих курсов «Микробиология» и «Иммунология», специальных курсов «Иммунологические аспекты экологии живых организмов», «Медицинская микробиология», «Современные методы иммунологических исследований», «Молекулярная иммунология» студентам биологического факультета СГУ им. Н.Г. Чернышевского; при чтении лекций на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии СГМУ; при чтении лекций общих и специальных курсов на кафедре микробиологии и санветэкспертизы СГАУ им. Н.И. Вавилова; на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей-бактериологов противочумной системы МЗ РФ в РосНИПЧИ «Микроб».
Апробация работы. Материалы исследования были представлены и обсуждены на 28 научных конференциях и форумах различного ранга:
- Всесоюзном совещании молодых ученых и специалистов противочумных учреждений СССР (Саратов, 1986);
- II Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы теоретической и прикладной инфекционной иммунологии. Механизмы противоинфекционного иммунитета" (Саратов, 1987);
- итоговых научных конференциях ВНИПЧИ "Микроб" (Саратов, 1983, 1989);
- конференции молодых ученых и специалистов учреждений, подведомственных РЭУ МЗ СССР, "Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций" (Ростов-на-Дону, 1989);
- Всесоюзной конференции "Молекулярные механизмы противоинфекционного иммунитета" (Звенигород, 1990);
- научно-практической конференции "Эколого-эпидемиологический надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии" (Астрахань, 1996);
- российских конференциях "Гомеостаз и инфекционный процесс" (Саратов, 1996,1998);
- юбилейной научной конференции, посвященной 90-летию СГУ и СГМУ (Саратов, 1997);
- научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997);
- 7th International Congress on Yersinia (Голландия, 1998);
- международной научно-методической конференции «Экология - образование, наука и промышленность» (Белград, 2002);
- научно-практической конференции с международным участием «Окружающая среда и здоровье» (Саратов, 2002);
- первой региональной конференции «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2002);
- международной конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Санкт-Петербург, 2002);
- Y съезде иммунологов и аллергологов России (Санкт-Петербург, 2003);
- «International workshop on optical technologies in biophysics and medicine V which were held in Saratov» (Саратов, 2003);
- объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004);
- научных конференциях биологического факультета СГУ (Саратов, 1996 -2004) и др.
Декларация личного участия автора. Экспериментальные исследования выполнялись автором лично или при непосредственном участии в составе научных групп в период с 1983 по 2004 гг. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно. В совместных публикациях вклад автора составил 50-70%.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 66 научных работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 420 страницах текста, содержит введение, восемь глав, заключение, выводы и библиографический список, включающий 422 отечественных и 204 иностранных источника. Работа иллюстрирована 55 рисунками и 52 таблицами.
Работа частично поддержана грантом Министерства образования и науки РФ № 45434 в рамках Программы «Развитие научного потенциала высшей школы».
Основные положения, выносимые на защиту
1. Эколого-иммунологический подход к изучению резистентности макроорганизма при инфекции и иммунизации предполагает проведение исследований механизмов формирования адаптационного иммунитета и его функцио нальное проявление на различных уровнях организации биологических систем: молекулярном, клеточном, органном, организменном и популяционном и позволяет дать оценку основным экологическим стратегиям паразитизма патогенных и условно-патогенных бактерий.
2. Сравнительный анализ данных по активности макрофагов, степени завершенности процесса фагоцитоза микробных клеток и индукции цитокинов дает возможность судить о характере экологической стратегии отдельных видов энтеробактерий и стафилококков по преодолению основных механизмов естественной резистентности.
3. Формирование адаптивного иммунитета к чумной инфекции в организме экспериментальных животных, иммунизированных живой чумной вакциной или капсульным антигеном чумного микроба, связано с активацией начального этапа иммунопоэза и изменениями в популяционном составе лимфоцитов органов иммунной системы.
4. По характеру действия на иммунную систему экспериментальных животных капсульный антиген чумного микроба является тимусзависимым, а основной соматический антиген - тимуснезависимым; лектин внешней мембраны вакцинного штамма Y.pestis ЕВ является дополнительным фактором, обеспечивающим контакт патогена с клетками макроорганизма, и перспективным компонентом комбинированной чумной вакцины.
5. В развитии полноценного адаптивного иммунитета к чумной инфекции обязательно участие тимусзависимой системы лимфоцитов, неравнозначность естественной и приобретенной резистентности к чумному микробу генетически детерминирована у инбредных мышей разных гаплотипов.
6. В основе различий естественной резистентности и инфекционной чувствительности у полуденных песчанок из различных мест обитания лежат механизмы дифференцировки зрелых форм лимфоцитов и разная степень их функциональной активности, которая зависит от генетически детерминированной чувствительности к отдельным антигенам чумного микроба.
Экологические аспекты реактивности и резистентности макроорганизма
Реактивность организма — это его способность адекватно реагировать на изменяющиеся условия внешней и внутренней среды. Реактивность включает в себя весь набор доступных организму адаптивных ответов, в том числе все унаследованные нормы реакции, а также ненаследуемые программы, связанные с индивидуальным онтогенетическим опытом и сохраняемые иммунологической памятью и ней-ропамятью (Адо, 1979; Березовский, 1981). При этом под нормой реакции подразумевается, по И.И. Шмальгаузену (1982), доступный индивиду диапазон ответа при разных условиях среды.
Реактивность основывается на библиотеке программ организма, но не сводится к ней, так как включает не только доступный индивиду диапазон каждой реакции, но и тенденцию к выбору определенных способов и масштабов реагирования (Адо, 1972). Учение о реактивности - это функциональная фенетика организма, поскольку изучает элементарные единицы функции - реактоны (понятие, близкое фенам) и способы их комбинации и интеграции в целостном организме. Реактивность рассматривается как атрибутивное свойство живых систем, особая биологическая форма отражения, присущая всем уровням организации живого, как индивидуальная мера приспособительных возможностей целостного организма (Зайчик, Чурилов, 1999).
Основателем первой развернутой концепции о реактивности считается Клавдий Гален, сформулировавший «правило исходного состояния организма». Гален учил, что причинный фактор вызывает болезнь, только действуя на организм, у которого сложилось особое состояние предрасположенности (Гален, 1971).
Благодаря И.И. Мечникову (1887) и П. Эрлиху (1911) дифференцировалось понятие специфической иммунологической реактивности. Эрлих считал антитела «оторвавшимися от клетки боковыми фиксирующими цепями» то есть, по современной терминологии - рецепторами. Фактически, он подчеркивал, что иммунитет — сложная форма комплементарного отражения. Ему принадлежит одно из первых обращений к принципу комплементарности или структурного однозначного соответствия между молекулами, который пронизывает все уровни субстрата реактивности. Эрлих говорил: «Corpora поп agunt nisifixata» — то есть: тела не действуют, если не распознают (Эрлих, 1911).
И.И. Мечников (1883) открыл фагоцитоз, как важнейший компонент клеточной реактивности, что затем получило свое развитие в концепции о ретикуло-эндотелиальной системе и в современном понимании трансформировалось в представление о ключевой роли системы мононуклеарных фагоцитов в управлении наиболее важными стереотипами реактивности (лихорадка, воспаление, преиммунный и иммунный ответ). Он создал сравнительно-эволюционное направление в изучении реактивности, показав, что видовая реактивность — есть сумма филогенетических находок эволюционных предков данного вида. Сравнивая ответ на повреждение у представителей различных таксономических групп, он убедился, что тип реактивности может служить критерием систематики (Мечников, 1947).
Справедливо подчеркивая роль различных систем в интеграции аппарата реактивности, представители разных научных школ в XX столетии остро полемизировали между собой. В результате сложились представления, согласно которым эндокринная, нервная и иммунная системы осуществляют интеграцию механизмов реактивности организма, как целого, влияя на все иерархические подуровни субстрата реактивности (Амосов, 1977; Корнева, 1987).
Интегральная концепция реактивности унаследовала понятие гомеостаза — способности организма существовать при значительном изменении условий обитания с сохранением устойчивого динамического равновесия со средой (Горизонтов, 1975). Э.С. Бауэр (1935) сформулировал принцип устойчивого динамического неравновесия, как кибернетической основы реактивности живого организма.
Дальнейшее обогащение учения о реактивности связано с влиянием теории функциональных систем Анохина. П.К. Анохин и его школа (1935-1971) разработали представления, согласно которым в осуществлении ответных реакций организма действуют подвижные функциональные системы процессов, влияющих друг на друга и обладающих разной анатомической характеристикой и физиолого-биохимическими особенностями. Их единство обусловлено заданным конечным результатом и направлено на достижение эффекта, соответствующего мотивации или поддерживающего в определенном диапазоне те или иные, более или менее жесткие константы. «Биологу, — писал Анохин, — в широкой степени безразлично, каким сочетанием структур и какой архитектурой физиологических процессов обеспечивается данная функция, лишь бы только она успешно приспосабливала животное к внешним условиям» (1971). По Анохину: «Системой можно назвать только такой комплекс избирательно вовлеченных компонентов, у которых взаимоотношения приобретают характер взаимодействия компонентов на получение фиксированного полезного результата. Функциональная система - это такое сочетание процессов и механизмов, которое, формируясь динамически в зависимости от данной ситуации, непременно приводит к конечному приспособительному эффекту как раз, именно, в данной ситуации».
Исходя из вышесказанного, можно считать, что реактивность организма существует в форме циклического образования и распада подобных функциональных систем. В свете теории катастроф реактивность, выглядит как индивидуальный внутренний механизм выбора системой того или иного пути в пространстве адаптивных состояний (Арнольд, 1979).
Реактивность — не количественное понятие, у одного индивида она не может быть вообще больше или, в целом, меньше, чем у другого. Она просто разная, как бывают разными два спектра излучения или две по-разному искривленные плоскости. Поскольку реактивность дискретна и подобна спектру, где отдельные линии это нормы реакции или адаптивные ответы, доступные организму, то можно говорить только о ее большей или меньшей широте или о наличии, либо отсутствии в этой библиотеке определенных программ (Баева, 1986).
Реактивность организма обычно трактуется как свойство его реагировать определенным образом на воздействие окружающей среды. Наряду с этим определением существует и ряд других, как более или менее сходных, так и отличных друг от друга. Так, А.Д. Адо (1962) понимает под реактивностью свойство организма отвечать изменением жизнедеятельности на воздействие окружающей среды. Это определение, близкое к приведенному выше, несколько шире его, так как изменение жизнедеятельности может возникнуть и в результате изменения резистентности. Ряд авторов связывает реактивность с изменением обмена веществ и конституцией (Маслов, 1960 и др.). Однако такие определения весьма неопределенны. Резистентность (от лат. resisto — противостоять, сопротивляться) - свойство твердого тела, организма противостоять различным воздействиям.
В биологической литературе термины "резистентность" и "устойчивость" обычно применяются для описания одинаковых состояний, которые также называются невосприимчивостью. Так, И.И. Мечников (1903) обозначал резистентность к инфекциям как невосприимчивость при инфекционных болезнях. В соответствии с этим D. Marine (1941) писал, что естественная резистентность и восприимчивость (чувствительность) - выражения, которые охватывают важные академические и практические концепции в экспериментальной биологии и медицине. В качестве примера можно привести радиорезистентность и радиочувствительность, а также подобные выражения в отношении других факторов внешней среды. Понятия "резистентность" и "невосприимчивость" особенно часто употребляются в иммунологии и микробиологии, где они нередко ранее выступали как синонимы иммунитета. И.И. Мечников связывал невосприимчивость не только с иммунобиологическими явлениями, но и с резистентностью, которая обеспечивалась наличием кожных покровов, слизистых оболочек, а также выделением микробов .из организма и аутотомией. Эта невосприимчивость вначале трактовалась как естественный иммунитет, а затем как резистентность организма. Иначе говоря, резистентность охватывает более широкий круг явлений сопротивляемости, чем иммунитет.
Определение электрофоретической подвижности клеток органов иммунной системы и крови
Для характеристики изменений в популяционном составе лимфоцитов использовали метод клеточного электрофореза в свободном потоке. Для электро-форетического фракционирования использовали лимфоциты крови, тимуса, селезенки и лимфатических узлов экспериментальных животных. Электродный и камерный буферы готовили по Zeiller et al. (1971). Исходную концентрацию клеток доводили камерным буфером до концентрации 2x10 клеток в 1 мл. Об электрофоретической подвижности лимфоцитов судили по расположению электрофоретической кривой распределения лимфоцитов после препаративной сортировки их на аппарате Elfor Vap-5 (Bender, Hobein, ФРГ) в соответствии с рекомендациями Малайцева и Богдановой (1977). Жизнеспособность лимфоцитов до и после разделения определяли с помощью трипанового синего. Количество лимфоцитов в исходной смеси и в полученных фракциях подсчитывали в камере Горяева и рассчитывали их процентное содержание по отношению к общему числу клеток во всех фракциях, полученных после разделения. В каждой полученной фракции лимфоцитов определяли процентное содержание Т- и В- лимфоцитов, принимая концентрацию лимфоцитов в каждой пробирке за 100%.
Количество Т- и В - лимфоцитов в крови, селезенке, лимфатических узлах и тимусе у экспериментальных животных определяли в лимфотоксическом тесте (ЦТТ) с анти Т- и анти В- сыворотками, а также методами идентификации поверхностных дифференцировочных антигенов.
Метод ЦТТ основан на способности мышиных МКА класса Ig М и IgG и комплемента оказывать цитотоксическое действие на соответствующую субпопуляцию лимфоцитов, что выявляется с помощью красителя (Практикум по иммунологии, 1988, 2001). Результаты ЦТТ учитывали в препарате "раздавлен 85 ная капля" (объектив х 20). Считали число "убитых" лимфоцитов на 200 клеток (убитые клетки окрашивались 2 % раствором эозина, существенно увеличивались и выглядели плоскими, как бы распластанными).
Идентификацию поверхностных дифференцировочных антигенов проводили методами розеткообразования. Т-лимфоциты у мышей определяли методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) по Jondal (1972) в модификации, Т-лимфоциты морских свинок определяли методом спонтанного Е-розеткообразования с эритроцитами кролика (Шварцман, Каш-кин, 1982). Реакция розеткообразования (Е-розетки), которую широко использовали для получения очищенной фракции Т-клеток до того, как в практику исследований были введены моноклональные антитела (Ройт-и др. 2000),обуслов-лена присутствием рецептора (LFA-3) на эритроцитах барана. В свою очередь молекула CD2 Т-клеточной поверхности - антиген с молекулярной массой 50 кДа, который «идентичен рецептору эритроцитов барана» (Ройт и др., 2000; Практикум по иммунологии, 2001), т.е. рецептор функционального антигена 3 лимфоцитов (LFA-3), который несут многие клетки и все АПК. Поэтому далее по тексту диссертации будет использоваться термин «СБ2-рецептор» как маркер Т-клеток.
В-лимфоциты мышей тестировали по наличию рецептора к СЗ-компоненту комплемента в тесте ЕАС-розеткообразования по Чередееву (1974). В-лимфоциты морских свинок - в тесте ЕАС-розеткообразования с эритроцитами барана,, сенсибилизированными кроличьей антиэритроцитарной сывороткой первичного иммунного ответа в субагглютинирующем разведении с Сз-компонентом комплемента по методу Jondal (1972) в модификации Гущина с соавт. (1981) с предварительной фиксацией эритроцитов глутаровым альдегидом. Розетки подсчитывали в камере Горяева, при этом учитывались клетки, на поверхности которых фиксировалось 3 и более эритроцитов. Всего подсчиты-валось не менее 300 лимфоцитов как образующих розетки, так и не образующих. Учитывая современные данные о дифференцировочных антигенах В-лимфоцитов (А. Ройт и соавт, 2000), выявляемые почти на всех В-клетках рецепторы для компонентов комплемента СЗЬ - это CR1 у мышей и его аналог CD35 - у людей. В этой связи далее по тексту мы считаем обоснованным использование аббревиатуры «CR1 - рецептор» как маркер В-клеток.
Fc-рецептор для экзогенного IgG (FcyRll, CD32) определяется на ряде клеток организма и участвует в передаче сигналов отрицательной регуляции для В-клеток (Методы иммунологических исследований, 2002). Этот рецептор определялся нами реакцией Кумбса с флуоресцирующими антителами (рис. 5).
Число антителообразующих клеток - АОК в селезенках мышей определяли методом пассивного локального гемолиза в геле реакцией Ерне (Ерне, Нор-дин, 1968) в собственной модификации. Нами были проведены специальные исследовайия с целью изучения возможности применения метода пассивного локального гемолиза в геле для выявления антителообразующих клеток в иммунном к чуме организме. Были выяснены оптимальные условия постановки реакции Ерне применительно к работе с антигенами чумного микроба и разработан экспериментальный эффективный диагностикум на основе нативных эритроцитов барана, сенсибилизированных фракцией I чумного микроба в присутствии активатора насадки - хлористого хрома.
Все опыты по определению АОК в селезенке иммунизированных животных сопровождались контролями: изучением аналогичных показателей с контрольным диагностикум ом (нативные эритроциты барана) и определением числа АОК у интактных мышей с контрольным, а также экспериментальным диаг-ностикумами.
Изучение индукции эндогенных цитокинов в процессе фагоцитоза разных видов энтеробактерий
Нами исследовалось содержание цитокинов в супернатанте культураль-ной среды в динамике фагоцитоза in vitro перитонеальными макрофагами микробных клеток энтеробактерий. В таблице 10 представлены данные о количественном содержании цитокинов в супернатанте.
Установлено, что при фагоцитозе клинического штамма Serratia sp. через 1 час контакта перитонеальных макрофагов с бактериальными клетками снижалось содержание ИЛ-1, в отличие от ИЛ-6 и ФНО-а. К 12 и 24 часам процесса фагоцитоза содержание всех определяемых цитокинов достоверно превышало исходные концентрации (до контакта с бактериями). Динамика повышения содержания ИЛ-1 до 24 часов наблюдения была сходной с динамикой определения этого цитокина при фагоцитозе контрольного штамма E.coli К-13, в отличие от ИЛ-6 (рис. 11).
При фагоцитозе микробных клеток Citrobacter sp. продукция всех цитокинов повышалась к 6 часам наблюдения и оставалась на одном уровне до 24 часов наблюдения для ИЛ-6 и ФНО-а. Содержание ИЛ-1 достоверно снижалось к 12 часам процесса фагоцитоза, однако оставалось достоверно выше исходных концентраций (см. рис. 11).
Процесс фагоцитоза микробных клеток Е. agglomerans сопровождался повышением содержания в супернатанте всех определяемых цитокинов к 12 часам, к 24 часам их концентрация незначительно снижалась, оставаясь достоверно выше исходных значений (см. рис. 11).
При фагоцитозе микробных клеток Е. coli Са-52, также как и клинического антибиотикоустойчивого штамма Е. coli ЭПКП О-127 и контрольного антибио-тикочувствительного штамма Е. coli К-13, отмечена сходная закономерность индукции ИЛ-1, а именно достоверное превышение исходной концентрации с 6 до 24 часов исследования. Содержание ИЛ-6 динамично повышалось к 12 часам процесса фагоцитоза разных штаммов кишечной палочки (см. рис. 11). Однако при фагоцитозе контрольного штамма Е. coli К-13 его содержание снижалось к 24 часам наблюдения, в отличие от более высоких значений при фагоцитозе Е. coli ЭПКП. Динамика синтеза ФНО-а была сходной при фагоцитозе всех штаммов кишечной палочки.
Для Y. enterocolitica отмечена незначительная индукция провоспалитель-ных цитокинов до 12 часов процесса фагоцитоза. Достоверное превышение исходной концентрации было отмечено только через 24 часа наблюдения для ИЛ-1 (м. рис. 11).
Аналогичные исследования были проведены нами при моделировании процесса фагоцитоза in vitro альвеолярными макрофагами энтеробактерий. Данные представлены в таблице 11.
Показано, что при фагоцитозе АМФ клинического штамма Serratia sp. к 1 часу процесса фагоцитоза in vitro достоверно повышалось содержание только ИЛ-6, для которого отмечено последующее незначительное снижение к 6 и 24 часам наблюдения. Для ИЛ-1 отмечено достоверно высокое содержание через 30 минут контакта с бактериальными клетками, после чего до 12 часов наблюдения его индукция не превышала исходных значений.
Лишь к 24 часам содержание ИЛ-1, также как и ФНО-а, было достоверно высоким по сравнению со всеми предыдущими данными (рис. 12).
Процесс фагоцитоза микробных клеток Citrobacter sp. сопровождался фазными изменениями в содержании провоспалительных цитокинов. Превышение исходных значений ИЛ-1 и ИЛ-6 было отмечено через 30 минут, 6 и 24 часа, а ФНО-а через 12 и 24 часа контакта макрофагов с бактериальными клетками (см. рис. 12).
Индукция синтеза ИЛ-1 и ИЛ-6 отмечена с 1 часа фагоцитоза микробных клеток Е. agglomerans. Достоверное превышение исходных концентраций ИЛ-1 было через 1, 6 и 24 часа наблюдения, а ИЛ-6, также как и ФНО-а, с 6 до 24 часов наблюдения (см. рис. 12).
При фагоцитозе Е. coli ЭПКП индукция ИЛ-1 динамично повышалась с 1 по 24 час наблюдения, достоверно превышая исходную концентрацию. Для ИЛ-6 отмечено повышенное содержание только через 1 час контакта макрофагов с бактериями, во все последующие часы его концентрация не превышала достоверно исходные значения. Установлена индукция ФНО-а в динамике фагоцитоза бактерий. Для музейных культур Е. coli К-13 и Е. coli Са-52 отмечена сходная закономерность повышения индукции ИЛ-1 с 6 по 24 час наблюдения. При этом через 24 часа процесса фагоцитоза содержание ИЛ-1 было значительным (200-250 пг/мл) для всех штаммов кишечных палочек. Индукция ИЛ-6 и ФНО-а была аналогичной, хотя и менее выраженной (см. рис. 12).
Процесс фагоцитоза микробных клеток Y. enterocolitica сопровождался резким повышением содержания ИЛ-1 через 1 час с последующим снижением до исходного уровня к 6 часам, достоверное повышение его концентрации через 12 и 24 часа не достигало значений 1 часа. Индукция ФНО-а отмечена с 6 часов процесса фагоцитоза, когда концентрация этого цитокина была более высокой (см. рис. 12).
