Содержание к диссертации
Введение
I Обзор литературы 10
1. Характеристика ключевых элементов иммунной системы животных в норме и при инфекционной патологии 10
1.1. Количественные показатели и функциональная характеристика эритроцитов периферической крови 11
1.2. Сведения о фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови животных 12
1.3. Количественные показатели и функциональная характеристика эозинофилов и базофилов периферической крови животных 18
1.4. Иммунологическая характеристика лимфоцитов периферической крови животных 20
1.5. Характеристика комплементарной активности сыворотки крови животных 24
2. Характеристика алеутской болезни норок 28
2.1. Эпизоотология алеутской болезни норок ...28
2.2. Характеристика вируса алеутской болезни 32
2.3. Патогенез алеутской болезни норок 35
2.4. Клинические признаки при алеутской болезни норок 38
2.5. Патологоанатомичєские изменения при алеутской болезни норок...39
2.6. Диагностика алеутской болезни норок 40
2.7. Лечение и профилактика алеутской болезни норок 42
II Собственные исследования
1. Материалы и методы исследования 45
2. Усовершенствование техники и параметров постановки методов определения иммунного статуса норок 49
2.1. Отработка режимов выделения лимфоцитов градиентным центрифугированием периферической крови норок 49
2.2. Технология приготовления эритроцитарных маркеров и определение продолжительности инкубации компонентов реакции для выявления розеткообразующих лимфоцитов периферической крови норок 51
2.3. Определение длительности инкубации компонентов реакции для выявления максимально возможной интенсивности поглощения частиц латекса нейтрофилами периферической крови норок 55
2.4. Отработка дозы нитросинего тетразолия и длительности инкубации компонентов НСТ-теста (теста нитросинего тетразолия) 62
2.5. Выявление длительности экспозиции компонентов ЦСТ-теста (цинк-сульфатного теста) для определения максимально возможного
количества иммунных белков в сыворотке крови норок 66
3. Изучение иммунного статуса здоровых норок и спонтанно инфицированных вирусом алеутской болезни 68
3.1. Определение гематологического статуса здоровых норок и спонтанно инфицированных вирусом алеутской болезни 68
3.2. Изучение гуморальных факторов иммунитета у здоровых норок и инфицированных возбудителем алеутской болезни 77
3.2.1. Количество В-лимфоцитов в периферической крови здоровых
норок и инфицированных патогеном алеутской болезни 77
3.2.2. Количество иммунных белков в сыворотке крови здоровых норок
и спонтанно инфицированных возбудителем алеутской болезни 80
3.2.3. Комплементарная активность сыворотки крови здоровых норок и спонтанно инфицированных вирусом алеутской болезни 80
3.3. Клеточные факторы иммунитета здоровых норок и спонтанно инфицированных возбудителем алеутской болезни 84
3.3.1. Количество Т-лимфоцитов в периферической крови здоровых норок и спонтанно инфицированных вирусом алеутской болезни 84
3.3.2. Функциональная активность Т-лимфоцитов периферической крови здоровых норок и спонтанно инфицированных патогенном алеутской болезни в реакции бластгрансформации с использованием фитогемагглютинина 87
3.3.3. Количество лимфоцитов-киллеров в периферической крови здоровых норок и спонтанно инфицированных возбудителем алеутской болезни 89
3.3.4. Количество активных нейтрофилов периферической крови здоровых норок и спонтанно инфицированных вирусом алеутской болезни в реакции поглощения гранулоцитами частиц латекса 92
3.3.5. Функциональная активность нейтрофилов периферической крови здоровых норок и инфицированных вирусом алеутской болезни, определяемая в тесте нитросинего тетразолия 97
III Обсуждение результатов исследования 100
IV Выводы 109
V Практические предложения 112
VI Список литературы 113
- Сведения о фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови животных
- Технология приготовления эритроцитарных маркеров и определение продолжительности инкубации компонентов реакции для выявления розеткообразующих лимфоцитов периферической крови норок
- Определение гематологического статуса здоровых норок и спонтанно инфицированных вирусом алеутской болезни
- Количество активных нейтрофилов периферической крови здоровых норок и спонтанно инфицированных вирусом алеутской болезни в реакции поглощения гранулоцитами частиц латекса
Введение к работе
В последние десятилетия иммунология прочно заняла место одной из ведущих фундаментальных биологических дисциплин (Ю.Н. Федоров и др., 2000). Несмотря на достигнутые успехи научных исследований в этой области, многие вопросы остаются слабо изученными. К настоящему времени иммунная система норок изучена недостаточно (Л.Б. Узенбаева, В.А. Илюха, 2001). В доступной литературе малочисленны сообщения об изучении естественной резистентности и иммунной реактивности у норок. В связи с этим необходимы исследования иммунной системы норок для понимания процессов функционирования иммунного гомеостаза и разработки эффективных методов диагностики, лечения и профилактики инфекционных и незаразных болезней зверей (А.В. Таранин, Е.Ю. Зеленов, 2001; Е.Б. Файзулоев, 2002).
Алеутская болезнь норок (вирусный плазмоцитоз) — наносит зверо
водству значительный экономический ущерб в связи с потерей качества
пушнины, низким выходом щенков, высокой смертностью зверей и ши
роким распространением болезни (И.И. Дукур, 1984; Н.И. Архипов и др.,
1987; B.C. Слугин, 1998; В.Б. Резников, 1999; Н.И. Петрова, 2000; A.M.
Литвинов, Н.А. Яременко, 2001; Т.А. Рыжова и др., 2002). Согласно
последним отчетным данным Департамента ветеринарии Минсельхоза России процент зверохозяйств, благополучных по алеутской болезни норок, составляет 15-17 (A.M. Литвинов, Н.А, Яременко, 2001). У взрослых зверей болезнь характеризуется развитием иммунокомплексного патологического процесса, у новорожденных щенков - острой интерстициаль-ной пневмонией (S. Alexcandersen, 1990; М. Bloom et ah, 1990, 1994; B.C. Слугин, 2002, 2003).
Все это послужило основанием для выбора темы диссертации и проведения исследований в соответствии с утвержденным планом НИР ИВМ
ОмГАУ по темам: «Видовая и возрастная характеристика физиологических функций и нейрогуморальной регуляции висцеральных систем животных и птиц» - номер государственной регистрации 01.2.103074; «Теоретическое обоснование, разработка и внедрение эффективных методов, средств диагностики н профилактики болезней пушных зверей, собак и кошек»
- номер государственной регистрации 01.9.70003202.
Цель исследования - дать комплексную характеристику показателей естественной резистентности и иммунной реактивности здоровых норок и спонтанно инфицированных вирусом алеутской болезни. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
усовершенствовать технику и параметры постановки иммунологических методов определения иммунного статуса норок;
определить количественные показатели эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, гематокрита, СОЭ периферической крови здоровых норок и спонтанно инфицированных вирусом алеутской болезни;
изучить количественные показатели розеткообразующих Т-» В-лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров в периферической крови здоровых норок и спонтанно инфицированных возбудителем алеутской болезни;
определить функциональное состояние гуморальных факторов иммунитета у здоровых норок и больных вирусным плазмоцитозом;
исследовать функциональную активность клеточных факторов иммунитета у здоровых норок и спонтанно инфицированных возбудителем алеутской болезни.
Научная новизна:
усовершенствованы методы определения иммунного статуса у норок;
проведено комплексное иммунологическое обследование здоровых и больных вирусным плазмоцитозом норок, разводимых на территории Омской области: определен гематологический статус, изучены количествен-
ные показатели розеткообразующих лимфоцитов, комплемента, иммунных белков, функционально активных нейтрофилов периферической крови;
- предложен комплекс иммунологических тестов для исследования
функциональной активности различных звеньев иммунитета норок;
- определено, что причиной формирования болезней иммунных ком
плексов у норок, инфицированных вирусом алеутской болезни, является
не только стимуляция функциональной активности гуморальных факторов
иммунитета, но и угнетение клеточных факторов и комплемента.
Теоретическая в практическая значимость работы. Предлагаемые способы определения иммунного статуса норок с помощью количественных и функциональных методов исследования могут быть использованы в качестве дополнительных тестов при диагностике инфекционных болезней, для оценки тяжести течения и прогнозирования исхода патологических процессов, а также в качестве критериев оценки племенных качеств норок при бонитировке.
Иммунологические показатели у здоровых норок и больных вирусным плазмоцитозом могут служить фоновыми величинами для оценки иммунного статуса зверей при различных патологических состояниях, влиянии иммуномодуляторов, вакцин и др. воздействий на иммунную систему.
Внедрение результатов исследования. Полученные при исследовании данные используются в учебном процессе при проведении лаборатор-но-практических занятий со студентами и слушателями ФПК на кафедрах нормальной и патологической физиологии, микробиологии вирусологии и иммунологии. Результаты исследований явились основанием для подачи двух заявок на изобретение и разработки двух методических рекомендаций по темам «Методы оценки иммунного статуса норок», утвержденных на заседании подсекции «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины РАСХН и
«Определение экономической эффективности ветеринарных мероприятий при болезнях пушных зверей клеточного содержания», утвержденных методической комиссией ветеринарного факультета ИВМ ОмГАУ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ОмГАУ (2001, 2002, 2003); на методической комиссии биологического цикла ИВМ ОмГАУ (2001, 2002, 2003); на заседании Общества физиологов ОмГМА (2002,2003); на международной конференции ИВМ АГАУ (Барнаул, 2002); на региональной научной конференции молодых ученых аграрных вузов Сибирского Федерального округа (ИВМ ОмГАУ, Омск, 2003).
Публикации. Основные положения диссертации изложены в шести статьях.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, списка литературы. Работа иллюстрирована двумя таблицами, 32 рисунками. Список литературы включает 234 источника, из них 117 иностранных.
Основные положения, выносимые на защиту:
усовершенствование методов определения иммунного статуса норок;
количественные показатели гематологического статуса здоровых норок и спонтанно инфицированных вирусом алеутской болезни;
результаты исследования гуморальных и клеточных факторов иммунитета у здоровых норок и спонтанно инфицированных возбудителем алеутской болезни.
Обзор литературы По данным ряда авторов (Л.Б. Узенбаева, В.А. Илюха, 2001; А.В. Таранин, Е.Ю. Зеленов, 2001; Е.Б. Файзулоев, 2002) иммунная система норок мало изучена. Поэтому при написании обзора литературы по вопросам функционирования иммунной системы в норме и при патологии мы использовали материалы, посвященные изучению иммунного статуса не только пушных зверей, но и других видов животных, включая человека,
Сведения о фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови животных
По данным ряда авторов (J.K. Spotznagel, 1975; К.П. Кашкин, 3.0. Караев, 1984; Н.М. Бережная, 1988, R. Lehreret al., 1993) нейтрофильные гранулоциты обладают всеми функциями фагоцитирующих клеток -хемотаксис, адгезивность, способность захватывать и убивать бактерии. Для реализации своих функций нейтрофилы обладают тремя типами цито-плазматических гранул. Первичные (азурофильные) гранулы содержат большое количество кислых гидролаз, миелопероксидазу, кислые му-коиды, лизоцим, эластазу, катионные белки. Вторичные (специфические) гранулы содержат лизоцим, лактоферрин, коллагеназу. Третичные гранулы отличаются от вторичных наличием в них кислой фосфотазы.
Хемотаксис - начальный этап фагоцитоза, заключается в сближение фагоцитирующей клетки и объекта, происходит в результате активного движения фагоцита к агенту. При хемотаксисе происходит образовалием псевдоподий гиалоплазмы и передвижение лейкоцита в направлении объекта фагоцитоза (W.S. Ramsey, 1972; H.U. Keller, М. Bessis, 1975). Рядом авторов установлено (W.S. Ramsey, 1972; Г.З. Мовет, 1975; К. Bendtsen, 1978; J. Fehr, С. Dahinden, 1978), что медиаторы иммунного ответа приводят к направленному движению полиморфоядерных лейкоцитов, что имеет наиболее важное значение в период их миграции. В частности, местному накоплению нейтрофилов и усилению воспалительной реакции способствует выделение простагландина (A.R. Rabson et al., 1978). Хе-мотоксический эффект вызывают многие бактерии (Я. Карр, 1978), однако некоторые микроорганизмы подавляют хематоксическую активность нейтрофилов, приобретая повышенную способность к преодолению защитных сил макроорганизма. Например, хемотаксис нейтрофилов менее выражен при инфицировании организма штаммом Streptococcus pyogenes, содержащего М-протеин, в сравнении с заражением штаммами не содержащими данный белок (S. Tylewska, М. W. Klosinska-Kita, 1978 На хемотоксическое поведение лейкоцитов влияют сывороточные компоненты. Некоторыми авторами (D.G. Jones et al., 1977; J.H. Galgiani et al., 1978) было установлено, что активность хемотаксического фактора прямо зависит от количества комплемента. Причем, свойством, вызывающим хемотаксис нейтрофильных лейкоцитов, обладает трёхмоле-кулярный комплекс комплемента С567 (П. Вард, 1975).
R. Sher et al. (1978) рассматривают в роли факторов сыворотки, определяющих хемотаксис и миграцию полиморфоядерных лейкоцитов, иммунные комплексы.
Учитывая непрерывность фагоцитарного процесса, аттракцию рассматривают как заключительный момент сближения фагоцита с объектом. По данным РХ. Moor et al. (1978) бактерии способны прикрепляться к выростам плазматической мембраны полиморфоядерных лейкоцитов. При этом большое значение имеют рецепторы для СЗЬ, С5а компонентов комплемента и Fs-фрагментов иммуноглобулинов (L.A. Boxer et al., 1978; D.E. Chenoweth, Т.Е. Hugli, 1978; P.M. Henson, 1977). В связи с этим некоторые авторы (Е.В. Чернохвостова, 1972; К.Е. Cristie et al., 1976), сообщают об участии антител в роли опсонинов антигенных частиц для облегчения переваривания фагоцитами.
Стадия аттракции фагоцитирующей клетки с объектом постепенно переходит в стадию поглощения. Поглощение небольших частиц чаще всего происходит путем погружения их в цитоплазму, а более крупных -захвата, "обтекания" их цитоплазматическими отростками - пседопо днями (W.P. Wergin, М. J. Рааре, 1977).
В случае взаимодействия нейтрофилов с иммунными комплексами, которые клетка не может захватить происходит процесс слияния цито-плазматических гранул с наружной клеточной мембраной в точке контакта с комплексом и с последующим высвобождением содержимого гранул в окружающую среду (К.П. Кашкин, З.О. Караев, 1984).
На стадии переваривания судьба захваченных микроорганизмов может быть различной. В случае успешного фагоцитоза наступает заключительная фаза и просходит дезинтеграция поглощенных микроорганизмов, под действием бактерицидных субстанций и гидролаз фагоцитов.
Рядом авторов (R. Lehrer et al., 1993; А.М. Бышевский, О.Н. Терсенов, 1994; С.А. Луговская, 1997) установлено, что захват инородных частиц сопровождается увеличением интенсивности потребления кислорода с последующим образованием перекиси водорода, способную проявлять бактерицидное действие в отношении поглощенного объекта фагоцитоза. При этом, как сообщают СИ. Рисованный, А.А. Славинский (2001), усиление метаболических процессов в нейтрофилах приводит к "взрыву" ки-слородзависимых ферментов и бактерицидному действию в отношении поглощенного объекта.
По мнению авторов (S. Slopek et al., 1960; Е.Т. Kabat, М. М. Mayer, 1961; D. Rowley, К. Turner, 1966; Д.У. Александер, Р.А. Гуд, 1974), интенсивность и завершенность фагоцитоза изменяется под влиянием сывороточных компонентов. Установлено, что комплемент, благодаря опсо-низирующим свойствам, не только облегчает поглощение фагоцитируемого объекта, но и способствует его перевариванию.
На интенсивность фагоцитарной реакции влияют некоторые биологические факторы. Рядом авторов экспериментально установлена зависимость интенсивности фагоцитарной реакции от обеспеченности организма витаминами (Е.И. Житова, К.И. Кудряшов, 1964; Т.Н. Хаустова, 1964; Н.Н. Абезгауз и др., 1965; В.Г. Фомина, 1973; Т.Г. Старкова и др., 1976; M.V. Dahl, 1978; R.V. Panganamala, D.G. Cornwell, 1984; К.Д. Плецитый и др., 1984), характера питания (P.G. Shilotri, 1976; О. Felsenfeld, К. Gur, 1977; J. Palmblad et al., 1977; ЯЗ. Лебенгарц, 1984), физической нагрузки (В.Г. Фомин, 1972; В.Н. Волков, 1973). Есть сведения о влиянии на фагоцитарую реакцию нервной (Н.В, Пучков, В.В. Щастый, 1955, 1963; И.В. Васильев, 1963; В.А. Шекоян, 1967; СВ. Магаева, 1973; Д.Ф. Плецитый, 1973; ЛГ. Струкова, 1973; Я.З. Лебенгарц, 1991; T.L. Roszman, W. Н. Brooks, 1985; D.G. Payan et al., 1986), гормональный систем (H.O. Besedovaky et al., 1985; W. Kiess, 1986).
Большинство методов, предложенных для изучения фагоцитарной активности лейкоцитов, основано на соединении крови животного с объектом фагоцитоза. В.А. Берестов, Л.Б. Узенбаева (1983) изучали фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови норок по методу В.М. Бермана (1958), с использованием в качестве объекта поглощения культуры микроорганизмов В. subtilis 83. Иммунологическое исследование показало, что у взрослых стандартных норок процент функционально активных нейтрофилов составил 43,88±2,04% у самок и 47,03±3,16% у самцов, нагруженность фагоцитов микроорганизмами (ФЧ) достигала 2,07±0,12% и 2,23±0,13%, соответственно. При изучении завершенности фагоцитоза, количественные показатели у самок регистрировались более высокие, чем у самцов-40,5 8±3,88% и 28,48±3,35% соответственно. Полученные данные свидетельствуют о различиях функциональной активности фагоцитов периферической крови норок в зависимости от половой принадлежности.
Технология приготовления эритроцитарных маркеров и определение продолжительности инкубации компонентов реакции для выявления розеткообразующих лимфоцитов периферической крови норок
Соотношение различных популяций розеткообразующих лимфоцитов, ответственных за реализацию клеточного и гуморального иммунитета, позволяет оценивать иммунную реактивность организма (Т. Tachibana, М. A. Ishtkawa, 1973; Г.А. Космиади, 1974). Постановка реакции розет-кообразования была адаптирована нами для определения соответствующих популяций лимфоцитов в периферической крови норок.
Эритроцитарные маркеры готовили на основе эритроцитов мелкого и крупного рогатого скота в соответствии с характерными отличиями рецепторного аппарата отдельных видов иммунокомпетентных клеток.
Поскольку Т-лимфоциты имеют на своей поверхности рецепторы для эритроцитов барана, представленные в виде С02-молекул, в качестве эритроцитарного маркера для определения данных клеток применяли свежеприготовленную взвесь эритроцитов барана (В.Н. Шабалин, Л.Д. Серова, 1988; М.А. Бажин и др., 1989; АН. Чередеев и др., 1999).
В отличие от Т-клеток, В-лимфоциты имеют на своей поверхности рецепторы для третьего компонента комплемента. Поэтому для определения этих клеток использовали эритроциты быка, сенсибилизированные гемолизином и комплементом (В.Н. Шабалин, Л.Д. Серова, 1988; М.А. Бажин и др., 1989; Н.А. Радчук и др., 1991; А.Н. Чередеев и др., 1999). Для этого предварительно получали гемолитическую сыворотку путем введения восьми внутривенных инъекций кролику 10%-ной суспензии свежих эритроцитов быка на физиологическом растворе. Полученную от кролика гемолитическую сыворотки прогревали при 56 С в течение 30 минут и определяли ее субагглютинирующий титр в реакции гемагглютинации (РГА). В качестве источника комплемента использовали сыворотку крови мыши, в разведении 1:10.
Для приготовления эритроцитарного маркера равные объемы эритроцитов быка и гемолитической сыворотки, взятой в субагглютинирующем титре, соединяли и инкубировали при 37С в течение 30 минут. Затем эритроциты трижды отмывали от несвязавшейся антисыворотки в избытке физиологического раствора центрифугированием при 1500 об/мин в течение пяти минут и ресуспензировали до исходного объема. Затем соединяли равные объемы сенсибилизированных эритроцитов и сыворотки мыши, взятой в разведении 1:10, и инкубировали при 37С в течение 30 минут. После этого эритроциты трижды отмывали в избытке физиологического раствора центрифугированием при 1500 об/мин в течение пяти минут и доводили концентрацию клеток до необходимой. В качестве индикаторной системы для определения лимфоцитов киллеров использовали комплекс эритроцитов быка и специфических ге терофильных антител к ним, содержащихся в гемолитической сыворотке. Для образования данного комплекса, равные объемы эритроцитов быка и гемолитической сыворотки, взятой в субагглютинирующем разведении, инкубировали при 37 С в течение 30 минут, затем трижды отмывали от непрореагировавших компонентов в избытке физиологиче ского раствора и доводили концентрацию эритроцитарного маркера до рабочей. При постановке реакции розеткообразования соединяли равные объемы выделенных лимфоцитов и соответствующих эритроцитарных маркеров с последующим центрифугированием и инкубированием проби рок. Затем компоненты реакции фиксировали глютаровым альдегидом. Учет результатов реакции розеткообразования проводили микроскопированием мазков, окрашенных по Романовскому-Гимза, и нативных препаратов в камере Горяева. При этом достоверной разницы количественных показателей, полученных двумя способами учета результатов, не обнаружили. В связи с чем рекомендуем подсчитывать относительное количество розеткообразующих лимфоцитов периферической крови норок в камере Горяева. При постановке реакции розеткообразования изучали зависимость выявляемого количества лимфоцитов от длительности инкубации компонентов реакции. Учет результатов проводили по истечение 10, 30, 60, 90 и 120 минут. В динамике исследования относительное количество розеткообразующих В-лимфоцитов и лимфоцитов-киллеров увеличивалось, достигая максимальных значений после инкубации компонентов реакции в течение 90 минут - 22,2±1,12% и 3ОД±1,05%, соответственно. Количественные показатели, полученные при инкубации по истечении 60 и 90 минут достоверно отличались от величин при 10 и 30 минут инкубации компонентов реакции (Р 0,05). Относительное количество В-лимфоцитов и лимфоцитов-киллеров при 10 минутах инкубации составило 16,0±1,23% и 23,2±1,52% соответственно, при 30 минутной - 18,3±1,15% и 26,7±0,89%, соответственно. После 120-минутной инкубации компонентов реакции отмечалась тенденция уменьшения количественных показателей иммуно-компетентных клеток - 21,1+0,90% и 27,2±0,91%, соответственно (рис. 2,3). Таким образом, рекомендуемая нами продолжительность инкубации компонентов реакции комплементарного и глобулинового розеткообразования лимфоцитов норок составляет 60 - 90 минут.
Определение гематологического статуса здоровых норок и спонтанно инфицированных вирусом алеутской болезни
По данным ряда авторов (Т. Tachibana, М. A. Ishikawa, 1973; X. Фримель, 1979) важную роль в реализации гуморального иммунитета выполняют В-лимфоциты. От их функциональной активности зависит адаптация организма к воздействию различных биологических агентов, способных вызывать нарушение иммунного гомеостаза. Поэтому количественная оценка В-лимфоцитов характеризует потенциальную способность естественной резистентности и иммунной реактивности у здоровых и больных животных. Количественный метод определения В-лимфоцитов с использованием реакции розеткообразования основан на выявлении у них поверхностного мембранного рецептора к третьему компоненту комплемента.
Иммунологическое исследование показало, что процент В-клеток от общего числа лимфоцитов периферической крови здоровых норок составил 24,1+0,27%, у инфицированных вирусом АБ достоверно больше 28,1±0,75% (рис. 18), (Р 0,001), что свидетельствует и стимуляции функциональной активности гуморальных факторов иммунитета при данной инфекции. Среднее значение абсолютного количества В-лимфоцитов за период исследования повторяло эту тенденцию и составляло у здоровых зверей 0,54+0,()2 тыс/мкл, у инфицированных - 1,40±0,02, соответственно - (Р 0,001). При этом наименьшие величины у здоровых регистрировались на 70 день исследования и составляли 0,44±0,11 тыс/мкл, у инфицированных вирусом АБ на 14 день - 1,28+0,11 тыс/мкл, соответственно. Наибольшие на седьмой день у здоровых - 0,64±0,12 тыс/мкл, и на 42 день у больных вирусным плазмоцитозом - 1,50±0,11 тыс/мкл (рис. 19).
Абсолютное количество В-лимфоцитов в периферической крови здоровых норок и спонтанно инфицированных вирусом АБ Важнейшим звеном в формировании иммунного ответа на внедрение возбудителя инфекции является резистентность организма, представленная естественными и приобретенными факторами защиты. Из приобретенных факторов иммунитета основным является антителообразование, осуществляемое В-лимфоцитами при совместном взаимодействии с макрофагами и Т-лимфоцитами хелперами. Нарушение регуляции антитело-образования, характеризующееся гипер- или гипогаммаглобулинемией, может приводить к развитию патологических процессов. Поэтому определение количества иммунных белков в сыворотке крови позволяет прогнозировать тяжесть течения и исход патологических состояний (И. Д. Столярова, 1999; Ю.М. Зарецкая, 2002).
Сопоставление результатов исследования сыворотки крови двух групп норок с использованием ЦСТ-теста показало, что на протяжении всего периода исследования количество иммунных белков у здоровых норок было не достоверно меньше, чем у зверей, инфицированных возбудителем АБ, и в среднем составляло 26,9+0,28 мг/мл и 27,4±0,24 мг/мл, соответственно (Р 0,05), (рис. 20), что указывает о тенденции развития ги-пергаммаглобулинемии при данной патологии. норок и спонтанно инфицированных вирусом алеутской болезни
По мнению ряда авторов (S. Slopek et al., 1960; Е.А, Kabat, М. М. Mayer, 1961; D. Rowey, К. Turner, 1966; Б.М. Ковалев и др., 1998; К.П. Кашкин, Л.Н. Дмитриева, 2000; Ю.Н. Федоров и др., 2000), в процессе адаптации организма животного к условиям окружающей среды и в защите от чужеродных агентов участвуют клеточные и гуморальные факторы естественной резистентности, среди которых важное место занимают белки системы комплемента. Активация белков системы комплемента по классическому и альтернативному пути опосредует ряд иммунных реакций: распознавание, лизис и элиминация генетически чужеродных агентов, в том числе вирусов, опсонизация антигенных частиц для облегчения фагоцитоза, хемотаксис лейкоцитов в очаг воспаления, дегрануля-ция тучных клеток. Поэтому определение комплементарной активности сыворотки крови позволяет оценить функциональную активность иммунной системы организма.
На рисунке 21 представлены результаты исследования комплементарной активности сыворотки крови двух групп норок. Наибольшая комплементарная активность сыворотки крови регистрировалась на седьмой день исследования и составляла у здоровых норок 18,6+0,73 гемолитических единиц (КГЕ5о), У больных зверей меньше - 15,4+0,64 КГЕ50 (Р 0,01). Далее уменьшение показателей, достигало минимального значения к 56 дню и составляло у здоровых 16,9±0,62 KTEstb У инфицированных 13,8+0,69 КГЕ50 (Р 0,01). За весь период исследования комплементарная активность сыворотки крови у здоровых норок составила в среднем 17,6±0,19 KTEso, У инфицированных вирусом АБ меньше - 14,4±0,17 КГЕи, (Р 0,001). Снижение количественных показателей гемолитических единиц у больных зверей, в сравнении со здоровыми, указывает об угнетении комплементарной активности сыворотки крови норок, инфицированных вирусом АБ.
Количество активных нейтрофилов периферической крови здоровых норок и спонтанно инфицированных вирусом алеутской болезни в реакции поглощения гранулоцитами частиц латекса
Данные литературы показывают, что иммунная система норок изучена недостаточно полно, поэтому исследования, посвященные изучению естественной резистентности и иммунной реактивности у зверей в норме и при патологических состояниях, имеют как теоретическое, так и практическое значение. Для количественной оценки иммунокомпетентных клеток и изучения функциональной активности различных звеньев иммунной системы норок необходимо выбрать комплекс воспроизводимых иммунологических методик.
Важным этапом при постановке большинства иммунологических методов исследования является выделение лимфоцитов из периферической крови при сохранении жизнеспособности клеток и минимальной концентрации в полученной суспензии форменных элементов крови (А.А. Aiuiti, 1975). При этом выход мононуклеаров должен быть не менее 70%, а жизнеспособность в суправитальной окраске трипановым синим не ниже 95%. Известные способы получения мононуклеаров с помощью лизиса клеток обладают существенными недостатками: гипер- и гипотонические растворы повреждают мембрану лимфоцитов, в полученной суспензии остается большое количество форменных элементов крови, не подвергнутых лизису.
По данным А. Воуига (1968), О. Babusicova et al. (1974), эффективным методом выделения лимфоцитов из периферической крови является центрифугирование форменных элементов в градиенте плотности рентгеноконтрастного вещества верографин. Проведенные нами исследования показали эффективность использования 17%-ного водного раствора верографина для выделения лимфоцитов из периферической крови норок, так как выход мононуклеаров составлял 75-77%, а жизнеспособность в суправитальной окраске трипановым синим 95-96%. Это позволило нам использовать данный способ выделения лимфоцитов из периферической крови норок для последующего определения количества различных популяций лимфоцитов в реакции розеткообразования.
Для определения В-лимфоцитов, Т- лимфоцитов, лимфоцитов-киллеров использовали реакцию розеткообразования. Данная реакция основана на взаимодействии поверхностных рецепторов лимфоцитов и эритроцитарных маркеров, Эритроцитарные маркеры готовили с использованием гемолитической сыворотки, полученной путем иммунизации кролика, и комплемента, в качестве которого применяли сыворотку крови мыши в разведении 1:10. Результаты исследования показали, что Т-лимфоциты норок способны образовывать розетки с эритроцитами барана, В-лимфоциты имеют на своей поверхности рецепторы к третьему компоненту комплемента, лимфоциты-киллеры - к иммуноглобулинам гетерофильной сыворотки.
Для изучения функциональной активности В-лимфоцитов определяли количество иммунных белков в сыворотке крови норок с помощью ЦСТ-теста по И.П. Кондрахину (1985). По методике известным способом экспозиция осаждения белков сыворотки крови крупного рогатого скота составлет 60 минут. При постановке ЦСТ-теста с сывороткой крови норок, максимальное количество иммунных белков выявляли при 50-минутной экспозиции компонентов реакции, что свидетельствует об ускорении течения реакции с сывороткой крови норок, в сравнении с длительностью течения реакции у крупного рогатого скота. Возможно, это связано с количественным содержанием иммунных белков в сыворотке крови у данных видов животных. По данным А.А. Кудрявцева и Л.А. Кудрявцевой (1974), количество иммунных белков гаммаглобулиновой фракции сыворотки крови норок меньше, чем в крови крупного рогатого скота, и составляет 20,5 % (18,9-21,1) и 30% (25,0-40,0), соответственно.
При оценке функциональной активности нейтрофилов в НСТ-тесте, доза реактива нитросинего тетразолия, предлагаемая Ч.Д. Асадовым (1990), не позволила выявить максимально возможное количество функционально активных нейтрофилов у норок, инфицированных вирусом АБ. Проведенные исследования показали, что увеличение концентрации нит-росинего тетразолия позволило выявить большее количество диформазан-положительных нейтрофилов у инфицированных норок в НСТ-тесте, в сравнении с использованием известной концентрации реактива. По нашему мнению это связано с тем, что у норок, инфицированных возбудителем АБ, отмечается угнетение цитохимической активности нейтрофилов, в сравнении со здоровыми животными.
Таким образом, отработанные режимы и параметры иммунологических методов исследования позволили повысить чувствительность методов оценки иммунного статуса норок. Комплекс иммунологических методов исследования позволяет оценивать физиологическое состояние и характер патологических изменений со стороны иммунной системы. Анализ критериев оценки иммунного статуса должен осуществляться одновременно с показателями гемограммы, так как расчет многих показателей проводится от общего числа клеток периферической крови. В.А. Берестов, А.А. Берестов (1971, 1978), Г.Г. Петрова (1971) изучали гематологический статус норок разводимых на европейской территории России. В доступной нам литературе мы не нашли сведений об изучении иммуно- и гемограммы у норок, выращиваемых в регионе Западной Сибири. Проведенные нами исследования показали, что для здоровых норок темно-коричневого окраса половозрелого возраста характерны следующие количественные показатели гематологического статуса: эритроциты - 9,1 ±0,10 млн/мкл, величина гематокрита равнялась - 60,1+0,20%, гемоглобина 173,4±2,33 г/л, СОЭ (по Панченкову) - 2,65±0,05 мм/час. По данным Берестова В.А. (1978), количество эритроцитов в периферической крови норок составляет 8,7 млн/мкл ((7=0,6), гемоглобина - 18,0 г% ((7=1,8), гемотокрита - 54% ((7=2,5), СОЭ (по Неводову) - 1,90 мм/час. Полученные нами показатели эритропоэза отличались от известных в литературе, и по-видимому отражают региональные особенности гематологического статуса у норок, разводимых на территории Западной Сибири.
