Содержание к диссертации
Введение
1. Разнообразие и биологическая активность микроорганизмов в криогенных почвах и подпочвенных мерзлых отложениях 9
1.1. Микроорганизмы в криогенных почвах 10
1.2. Микроорганизмы в вечномерзлых подпочвенных отложениях 19
2. Влияние процессов замораживания-оттаивания на жизнеспособность бактерий 32
2.1. Проблемы «физиологической сухости» и осмотического стресса у бактерий при замораживании 32
2.2. Факторы, влияющие на устойчивость клеток к замораживанию-оттаиванию 38
2.3. Устойчивость бактерий вечномерзлых осадочных пород к процессам замораживания-оттаивания 41
3. Дифференциация клеток при адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды 44
Объекты и методы 55
Результаты и обсуждение
1. Влияние длительного воздействия отрицательных температур на сохранение жизнеспособности и устойчивости бактерий, выделенных из мерзлых подпочвенных пород 66
1.1. Динамика восстановления активности бактерий в процессе таяния образцов 67
1.2. Влияние процессов замораживания и оттаивания на клеточную структуру, жизнеспособность и устойчивость бактерий к NaCl 81
2. Образование покоящихся форм неспорообразующими бактериями рода arthrobacter 92
2.1. Выделение и изучение динамики образования аутоиндукторов анабиоза штаммами A. globiformis 93
2.2. Образование покоящихся форм в циклах развития A. globiformis в условиях дисбаланса по источникам питания и/или энергии 100
2.3. Образование покоящихся форм A. globiformis в автолизирующихся суспензиях 107
2.4. Тонкое строение клеток покоящихся форм A. globiformis 115
Выводы 123
Список литературы 105
- Микроорганизмы в вечномерзлых подпочвенных отложениях
- Факторы, влияющие на устойчивость клеток к замораживанию-оттаиванию
- Влияние длительного воздействия отрицательных температур на сохранение жизнеспособности и устойчивости бактерий, выделенных из мерзлых подпочвенных пород
- Образование покоящихся форм в циклах развития A. globiformis в условиях дисбаланса по источникам питания и/или энергии
Введение к работе
Актуальность работы. Высокая степень сохранения жизнеспособности микробных сообществ в вечномерзлых осадках Арктики и Антарктиды позволяет рассматривать мерзлые толщи как естественную среду, где микроорганизмы, прежде всего бактерии, доминирующие в количественном отношении, реализуют потенциальные возможности устойчивости к продолжительному воздействию холода (Zvyagintsev, 1985). В мерзлых осадках химические и физические свойства органоминеральных комплексов существенно зависят от образования льда, который составляет 92-97% от общего объема водной фазы и обеспечивает условия системы, исключающей фильтрацию воды, а также создает стабильные условия низкотемпературного воздействия на микроорганизмы в естественной среде обитания (Vorobyova et al., 1997; Gilichinsky, 2001).
Проведенные исследования арктических и антарктических мерзлых осадков показали, что среди сохранивших жизнеспособность бактерий преобладают неспорообразующие психротрофные формы (Soina, Vorobyova, 1994; Vorobyova et al., 1996, 1997; Demkina, 1997; Gilichinsky, 2001), менее чувствительные к повышению температуры, чем строгие психрофилы, что коррелирует со сравнительно быстрым восстановлением их активности после оттаивания мерзлых пород. Большой интерес вызывает механизм переживания бактерий в условиях стабильных отрицательных температур. Образование специализированных покоящихся клеток - спор или цист - в естественном цикле развития культур известно для ограниченного числа родов бактерий. Это согласуется с наблюдениями бактерий в мерзлых осадках in situ в просвечивающем электронном микроскопе, где редко выявлялись типичные споры или цисты, но были широко представлены коринеформные бактерии, что подтверждается результатами высевов на твердые питательные среды (Soina et al., 1995). Вместе с тем, наблюдаемые in situ клетки бактерий в просвечивающем электронном микроскопе (Soina et al., 1995; Soina et al., 1998) по своему строению - утолщенным клеточным стенкам, внешним капсулярным слоям, неоднородной плотности цитоплазмы - могли быть отнесены к покоящимся формам, отличным от вегетативных клеток и похожих на пистоподобные рефрактерные клетки (ЦРК) (Дуда и др., 1982). Такие клетки были получены в лабораторных условиях при модификации условий культивирования и обладали всеми признаками покоящихся форм, но отличались по устойчивости к внешним факторам от типичных эндоспор бактерий (Эль-Регистан и др., 1979; Мулюкин и др., 1996, 1997; Демкина и др., 2000). Ранее проведенные исследования показали, что переход клеток в покоящееся состояние зависит от активности внеклеточного ауторегуляторного фактора dj с функцией индуктора анабиоза (Эль-Регистан и др., 1983; Осипов, Эль-Регистан и др., 1985; Батраков, Эль-Регистан и др., 1993). Выявление ЦРК не только у неспорообразующих, но и спорообразующих бактерий (Дорошенко и др., 2001) может свидетельствовать о биоразнообразии покоящихся клеток у микроорганизмов и различиях в их способности и формах торможения
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ | БИБЛИОТЕКА і
«5"*3?Е»Л
метаболической активности в неблагоприятных для роста условиях. В связи с изложенным, актуальным является, с одной стороны, оценка влияния длительного низкотемпературного воздействия в мерзлых осадках на сохранение жизнеспособности бактерий, о чем можно судить по восстановлению пролиферативной активности при оттаивании; с другой, -изучение закономерностей образования и характеристик покоящихся форм у неспорообразующих бактерий, выделенных из мерзлых грунтов. Эта исследования способствуют накоплению методологического опыта в изучении физиологического состояния бактерий в условиях вечной мерзлоты.
Цель работы заключалась в установлении особенностей реактивации жизнеспособности бактерий из многолетнемерзлых осадков и возможности образования покоящихся форм у неспорообразующих бактерий как одного из способов их выживания в вечной мерзлоте.
Задачи исследования:
1. Изучение влияния длительности воздействия отрицательных температур
на динамику восстановления активности бактерий при таянии мерзлых осадков
разного возраста.
2. Оценка воздействия процессов замораживания и оттаивания на
жизнеспособность и ультраструктуру клеток бактерий из мерзлых осадков.
3. Изучение образования и специфических особенностей
ауторегуляторного фактора dj - аутоиндуктора анабиоза - у коллекционных и
мерзлотных штаммов Arthrobacter globiformis.
-
Изучение условий образования покоящихся форм штаммами Arthrobacter globiformis в естественном цикле развития культур и в автолизирующихся клеточных суспензиях.
-
Изучение ультраструктуры клеток покоящихся форм штаммов Arthrobacter globiformis и выявление общих ультраструктурньгх особенностей с клетками, наблюдаемыми от situ.
Научная новизна. Показано, что длительное воздействие постоянных отрицательных температур не только не препятствует, но и способствует сохранению субклеточных систем, а также способности бактерий к активному прорастанию при оттаивании мерзлых отложений. Это обеспечивает восстановление жизнеспособности у значительного числа бактерий, большинство из которых представлено неспорообразующими формами. Выявлены галотолерантные свойства бактериальных сообществ из мерзлых осадков, которые сохраняются у клеток после многократных циклов замораживания-оттаивания нативных образцов. Это является дополнительным доказательством адаптации бактерий к условиям повышенного содержания солей, возникающего в процессе образования мерзлых отложений.
Впервые обнаружено, что неспорообразующие бактерии Arthrobacter globiformis продуцируют внеклеточные факторы d\, обуславливающие переход клеток в анабиотическое состояние. Показана видонеспецифичность действия таких соединений, что подтверждает универсальность ауторегуляции этого типа
на уровне межклеточных взаимодействий в микробных сообществах. Впервые установлено, что в естественном цикле развития погруженных культур в средах с дисбалансом источников питания и/или энергии, а также в условиях спонтанного автолиза плотных клеточных популяций, штаммы Arthrobacter globiformis образуют клетки, которые обладают всеми свойствами покоящихся форм микроорганизмов: сохранением жизнеспособности в течение длительного времени, термоустойчивостью, отсутствием эндогенного дыхания, характерными особенностями ультраструктурной организации. Показано, что продуктивность внеклеточных факторов d\ и терморезистентность покоящихся форм выше у штаммов Arthrobacter globiformis, выделенных из мерзлых осадков, по сравнению с коллекционным штаммом, что может рассматриваться как адаптивное преимущество бактерий в подобных биотопах, обеспечивающее повышение их устойчивости к стрессам. Выявлены ультраструктурные особенности клеток, которые могут рассматриваться как «портретные» характеристики бактерий, пребывающих в анабиотическом состоянии в природных субстратах, в том числе и в мерзлых осадках.
Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для развития методов обнаружения микроорганизмов в экстремальных земных местообитаниях, в астробиологии для выявления возможных латентных форм жизни на других планетах, в биотехнологии при разработке способов хранения неспорообразующих бактерий.
Апробация работы: Основные положения диссертации доложены на Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-96, 97», Москва, 1996, 1997; 2-ой международной конференции «Криопедология-91», Сыктывкар, 1997; конференции «Консервация генетических ресурсов», Пушино, 1998; 1-й Международной конференции стран СНГ «Молодые ученые - науке, технологиям и профессиональному образованию для устойчивого развития», Москва, 1999; конференции «Консервация и трансформация веществ и энергии в криосфере Земли», Пушино, 2001.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 18 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики объектов и методов исследований, экспериментальной части, включающей две главы с шестью разделами, выводов и списка литературы va2/Z- публикаций отечественных и зарубежных авторов. Текстовая часть работы занимает 73& страниц, иллюстрирована ҐҐ таблицами, ?Р рисунками, Ф фотографиями.
Микроорганизмы в вечномерзлых подпочвенных отложениях
Почвы арктической и субарктической зон и подпочвенные слои зоны "вечной мерзлоты" являются уникальными биотопами для оценки жизнеспособности микробных клеток и выявления механизмов адаптации микроорганизмов к низким температурам (Звягинцев и др., 1985; Паринкина, 1989; Vishniac, 1993, Vorobyova et al., 1997, 2001; Gilichinsky, 2001, 2002). Большое внимание исследователей к криогенным почвам в последнее время связано также с тем, что биохимические процессы в них играют важную роль в поддержании газового баланса атмосферы, что актуально в свете возможных глобальных изменений климата. Почвы северных широт играют существенную роль в эмиссии СОг, метана, этилена и других биогенных газов (Глотов, 1989, 1992; Паников, Зеленое, 1992).
Работы последних лет указывают на значительное содержание и разнообразие микробов в подпочвенных слоях, подверженных длительному воздействию отрицательных температур, причем клетки способны быстро восстанавливать свою активность после оттаивания (Soina et al., 1995, Vorobyova et al., 1997, 2001; Vishnivetskaya et al., 2000, Gilichinsky, 2001, 2002). Сопоставление микробных сообществ этих биотопов с микробными сообществами современных криогенных почв, сравнительные исследования свойств микроорганизмов перспективны для оценки выживания микробных клеток в криогенных условиях. 1.1. Микроорганизмы в криогенных почвах
Численность и разнообразие микроорганизмов в криогенных почвах. Исследования микроорганизмов арктических и субарктических почв выявили локализацию основной массы жизнеспособных микроорганизмов в верхних почвенных горизонтах и резкое падение их численности с глубиной. Комплекс микроорганизмов, обитающих в арктических тундровых почвах, имеет целый ряд особенностей, обусловленных низкими температурами активной части почвенного профиля на протяжении большей части года, высокой влажностью и недостаточной аэрацией почв, бедностью их доступными элементами минерального питания и азота. (Сушкина, 1982, Паринкина, 1984; Добровольская, Лысак, 1981; Holding, 1981). По данным Паринкиной О.М. (1989) в большинстве арктических почв бактерии составляли от 80 до 90% от общего количества микроорганизмов, определяемых на питательных средах, при этом в наиболее суровых условиях полярных пустынь количество бактерий в почвах значительно снижалось по сравнению с показателями как тундровых почв, так и почв умеренных широт, что подтверждалось и данными прямого счета.
Благодаря низкой интенсивности химического выветривания, низкой зольности опада и медленному освобождению элементов питания в подобных биотопах было отмечено преимущественно развитие олиготрофных, в частности олигонитрофильных микроорганизмов (Паринкина, 1989). В почвах арктической тундры численность бактерий, определяемая чашечным методом, колебалась от 103до107КОЕ/г почвы, а методом прямого счета достигала 109кл/г (Паринкина, 1989).
При исследовании почв арктической тундры было показано, что на динимику численности микроорганизмов оказывает влияние не только сезонные колебания температуры, но и характер растительного покрова, уровень влажности и аэрации почв, а также глубина оттаивания мерзлоты (Паринкина, 1984, 1989). Наряду с тенденцией к снижению количества жизнеспособных микроорганизмов вниз по профилю тундровых почв, рядом авторов было отмечено увеличение численности микроорганизмов на границе промерзания, разделяющей оттаивающий слой почвы от вечной мерзлоты. Обычно это объясняется существованием сезонных нисходящих токов почвенного раствора при оттаивании почв. По данным Д.А.Гиличинского и др. (1991) для формирования пиков численности клеток более существенное значение имеют процессы промерзания почв и возникновение градиента температур, способствующего миграции влаги и концентрации клеток в области минимальных температур. Результаты позволили сделать вывод о миграции микроорганизмов вместе с жидкой фазой воды при наличии температурного градиента в промерзающих почвах. Именно в средней иссушенной части почвенных профилей тундры обнаруживаются "стерильные" зоны. Определенное значение в распределении бактерий вниз по почвенному профилю видимо имеет размер клеток- имеется сообщение о том, что более активно переносятся бактерии длиной менее 1 мкм (Gannon et al., 1991).
Бактерии в изученных арктических тундровых почвах были представлены видами родов Arthobacter, Brevibactertum, Caulobacter, Chromobacterium, Corynebacterium, Pseudomonas, Cytophaga, Enterobacter, Erwinia, Fiavobacterium, Nocardia. На примере арктических почв п-ва Таймыр было показано, что большинство бактериальных изолятов представляли неспороносные бактерии с грамположительным и грамотрнцательным типами клеточной стенки, а спорообразующие бактерии выделялись в незначительном количестве (Паринкина, 1989). Ранее Н.Н.Сушкина (1960) предположила, что спорообразование бактерий в условиях низких температур видимо подавляется, т.к. бациллы чувствительны к дефициту элементов питания, низким температурам и процессам замерзания-оттаивания; в связи с чем эта группа бактерий присутствует в тундровой почве в форме вегетативных клеток. Так, спорообразующие бактерии как основные группы были обнаружены в тундровых почвах района Диксона (Добровольская, Лысак, 1981) и других почвах тундры (Мишустин, 1984, Паринкина, 1989). Там, где не было растений, преобладали коринеподобные бактерии. Отмечено, что среди психотрофных коринеподобных бактерий в тундровых почвах доминировали представители рода Arthobacter (Ensign, 1970, Лысак и др., 1975, 1977), которые по мнению авторов способны выдерживать длительное голодание in situ в условиях неустойчивых низких температур.
Факторы, влияющие на устойчивость клеток к замораживанию-оттаиванию
Примерами клеток с эндогенным покоем являются специализированные формы микроорганизмов, такие как споры и цисты. Специализированные покоящиеся клетки микроорганизмов можно расположить в ряд: эндоспоры бактерий -мемноспоры грибов - ксеноспоры грибов — экзоспоры и цисты бактерий. В этом ряду постепенному упрощению структурной и биохимической организации обычно соответствует и постепенное падение сроков сохранения жизнеспособности в физиологических условиях (Калакуцкий, 1987).
Экзогенный покой появляется вследствие обезвоживания клеток при действии внешних физических или химических факторов, лиофилизации, высушивания, замораживания, при консервировании в концентрированных растворах сахарозы и солей (Беккер и др., 1981).
Покоящиеся формы микроорганизмов, как правило, морфологически отличны от вегетативных клеток и характеризуются следующими особенностями: внешними покровами, которые дополнительно изолируют протопласт от внешней среды; утолщением или уплотнением клеточной стенки; изменением ультраструктурной организации споропласта. Процессы формирования покоящихся форм, помимо модификации клеточных структур, всегда сопровождаются приобретением клетками свойств повышенной устойчивости к введшим факторам, что необходимо для переживания неблагоприятных условий.
Общим свойством для различных типов покоящихся форм микроорганизмов является их резко сниженная метаболическая активность или полное ее отсутствие (Sussman, Halvorson, 1966). Другим свойством, отличающим покоящиеся формы от вегетативных клеток, является устойчивость к действию неблагоприятных факторов окружающей среды: высокая температура, высокая или низкая концентрация ионов водорода, действие литических ферментов, спиртов, ксенобиотиков и токсикантов, ионизирующей радиации. Степень устойчивости к воздействию повреждающих факторов у покоящихся форм микроорганизмов значительно варьирует в зависимости от вида организма и способа цитодифференцировки (Калакуцкий, Агре, 1977).
К основным и наиболее изученным типам покоящихся форм прокариот с различной морфологией относятся: 1) эндоспоры бактерий родов Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Sporosarcina, (Hanson, 1979, Tipper, Ganthier, 1972) и термофильных стрептомицетов Thermoactinomyces и Actinibifida (Калакуцкий, Агре, 1977); 2) микроспоры (микроцисты) миксобактерий родов Sporocytophaga и Myxococcus (White, 1975); 3) цисты азотобактера (Reusch, Sadof 1983); 4) акинеты цианобактерий (Nichols, Carr, 1978); 5) конидии стрептомицетов (Калакуцкий, Агре, 1977); 6) экзоспоры некоторых метилотрофных бактерий (Whittenbury et al., 1970) и Rhodomicrobium (Горленко и др., 1977). Споры, имеющие все признаки бактериальных эндоспор (типичное тонкое строение, термоустойчивостъ и присутствие дипиколиновой кислоты) были обнаружены также у актиномицета Streptomyces globisporus в условиях несбалансированного питания (Stastna et al., 1992) и Serratia marcescens subsp. sakuesis subspnov. (Ajithkumar et al., 2003) - бактерии, у которой ранее не были описаны покоящиеся формы.
Таким образом, если сравнительно недавно понятие покой ассоциировалось прежде всего со специализированными покоящимися формами, то в последнее время бурно дискутируется вопрос о способах переживания неспорообразующих бактерий, для которых покоящиеся формы неизвестны, за счет приобретения ими состояния покоя, известного в зарубежной литературе как dormant state (этот термин имеет значение «покоящийся», «дремлющий», а также «потенциальный»).
Последние исследования, посвященные изучению различных форм покоя у микроорганизмов, показали, что многие, в том числе и неспорообразуюшие, виды бактерий и дрожжей формируют цистоподобные рефрактерные клетки (ЦРК), описанные как новые формы покоя (Дуда и др., 1982, Мулюкин и др., 1996, 1997). ЦРК характеризовались отсутствием метаболической активности: в них были подавлены энергодающие процессы, ингибирован синтез белка, ДНК, РНК, фосфолипидов. Устойчивость рефракторных форм к действию высоких температур, ультрафиолетовому облучению, литическим ферментам и некоторым спиртам была значительно выше по сравнению с вегетативными клетками. Наконец, зги клетки сохраняли свою жизнеспособность в течение длительного периода времени (более 6 месяцев). Образование ЦРК контролируется уровнем концентрации и активности внеклеточного аутоиндуктора анабиоза, так называемого фактора dj (Эль-Регистан и др., 1983, Мулюкин и др., 1996, Беспалов и др., 2000). По своей химической природе — это алкилоксибензольное соединение (АОБ) (Осипов и др., 1985, Батраков и др., 1993).
Механизм действия АОБ основан на слабых физико-химических взаимодействиях этих соединений с мембранными липидами и макромолекулами (межмолекулярные водородные связи, гидрофобные и ионные взаимодействия), следствием чего является поликристаллизация липидов клеточных мембран, изменение их функциональной активности; дегидратации клеточного протопласта; модификация и стабилизация молекулярной структуры ферментов, приводящая к изменению их каталитической функции и повышению устойчивости (Беспалов и др., 2000, Капрельянц и др., 1987, Колпаков и др., 2000). Образование покоящихся форм под воздействием ауторегуляторного фактора di было показано для микроорганизмов различных таксономических групп: Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas carboxydoflava, Methylococcus capsulatus, Micrococcus luteus, Arthrobacter globiformis и др. (Эль-Регистан и др., 1979, 1983, Бабусенко, 1992, Мулюкин и др., 19966, Демкина, Соина, Эль-Регистан, Звягинцев, 2000, Демкина, Соина, Эль-Регистан, 2000, McDougald et aL, 1998, Bakken, Olsen, 1987
Были получены интересные данные о роли бактериальных ауторегуляторов роста на стрессовые воздействия (Ильинская и др., 2002). На примере стафилококков было показано, что добавление АОБ в среду культивирования способствует резкому увеличению фенотипической диссоциации культур, а также повышает защитную функцию клеток при их экспонировании к повышенным температурам. Имеются данные также по изучению диссоциантов Bacillus cereus (Дорошенко и др., 2001). Было показано, что степень диссоциации различна не только в популяции вегетативных или покоящихся клеток, но также зависит от того, в виде покоящихся форм какого типа переживает культура. Полученные диссоцианты отличались разными морфологическими, ростовыми и биохимическими признаками, а также обладали различной продуктивностью факторов dL
Сравнительное изучение элементного состава вегетативных и покоящихся клеток микроорганизмов методом рентгеновского микроанализа выявило различия в содержании S, Р, Са и К, а также в соотношении этих элементов в клетках бактерий Bacillus cereus и Micrococcus luteus (Мулюкин и др., 2002), что позволило авторам предложить использовать рассматриваемые показатели для разработки критериев диагностики физиологического состояния микроорганизмов в природных образцах (без культивации).
Влияние длительного воздействия отрицательных температур на сохранение жизнеспособности и устойчивости бактерий, выделенных из мерзлых подпочвенных пород
Проведенные ранее исследования по таксономическому составу бактерий, выделенных из образцов мерзлых пород разного возраста и генезиса выявили, что преобладающая часть неспорообразующих бактерий, быстро восстанавливающих свою активность после оттаивания образцов, относится в коринеформным бактериям и среди них к роду Arthrobacter (Soina,. Vorobyova, 1996, Vorobyova et aL, 1997).
Известно, что представители рода Arthrobacter при высеве, на общепринятые среды могут составлять преобладающую часть от общего числа бактерий, выделяемых из разных природных субстратов и прежде всего почв (Квасников, Писарчук, 1980, Сассіагі, ІлррІ, 1986). Им свойственны низкие скорости роста, аккумуляция резервных веществ, быстрое снижение эндогенного метаболизма при наступлении неблагоприятных для роста условий, а также высокая устойчивость к голоданию, высушиванию и продолжительному воздействию отрицательных температур в мерзлых осадочных породах (Soina et al., 1996).
Сохранение жизнеспособности представителей рода Arthrobacter в таких природных условиях как длительно-мерзлые осадки представляет особый интерес, так как в цикле развития представителей данного рода до сих пор не были обнаружены специализированные покоящиеся формы. Вместе с тем, в настоящее время ориентировочную длительность сохранения жизнеспособности микроорганизмов связывают с глубиной снижения метаболической активности и условиями, не способствующими активному обмену (Бекер, 1987) Один из известных механизмов переживания, хорошо известный для специализированных покоящихся форм (спор, конидий, цист), состоит в переходе клеток в анабиотическое состояние, в котором они длительно сохраняют жизнеспособность. Находясь в анабиозе, клетки обладают экспериментально не выявляемым уровнем метаболической активности и повышенной устойчивостью к экстремальным внешним воздествиям. Мы полагаем, что длительное сохранение неспорообразующих бактерий рода Arthrobacter в мерзлоте обеспечивается также за счет образования ими анабиотических покоящихся форм,
Имеются данные об образовании крупных сферических или лимоноподобных клеток — циститов, которые разными авторами рассматриваются либо как инволюционные формы, возникающие под влиянием неблагоприятных условий роста (Sundman, 1958), либо как покоящиеся формы (Stevenson, 1963). Однако в последнем случае никаких доказательств наличия признаков покоя у данных форм получено не было.
Ранее было показано, что ряд неспорообразующих бактерий {Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas carboxydoflava, Methylococcus capsulatus, Micrococcus luteus) образуют цистоподобные рефрактерные клетки (ЦРК), обладающие всеми характеристиками покоящихся форм (Эль-Регистан и др., 1979, 1983, Бабусенко, 1992, Мулюкин и др., 19966 McDougald et al., 1998, Bakken, Olsen, 1987), образование которых зависит от концентрационного уровня и активности внеклеточных метаболитов с функциями аутоиндукторов анабиоза, названных факторами d\ (дифференцировки клеток) и относящихся у некоторых микроорганизмов к алкилоксибензолам (АОБ) (Осипов идр., 1985, Батраков и др., 1993, Мулюкин и др., 1996а). Предполагалось, что переживание неспорообразующих бактерий рода Arthrobacter в почве и мерзлых осадках обусловлено аналогичным механизмом перехода вегетативных клеток в покоящееся состояние под влиянием синтезируемых ими аутоиндукторов анабиоза.
В связи с изложенным были поставлены эксперименты по выделению ауторегуляторов роста у 2-х штаммов Arthrobacter globiformis у коллекционного (ВКМ) штамма Arthrobacter globiformis В-1112, выделенного из почвы, и Arthrobacter globiformis 245, выделенного из мерзлого отложения возрастом 2 млн. лет
При сравнительном исследовании динамики роста коллекционного штамма A. globiformis В-1112 и A. globiformis 245, изолированного из мерзлой породы на синтетической питательной среде явных отличий между ними выявлено не было.; максимальная удельная скорость роста //щах составила соответственно 0,25 и 0,27 ч \ а выход биомассы - 1,2 и 1,4 г/л (Мулюкин и др., 2002).
Препараты внеклеточных факторов d/ (аутоиндукторов анабиоза) выделяли из одинаковых объемов (5 л) культуральной жидкости бактерий А. globiformis 245 (изолята из мерзлой породы) и A.gtobiformis В-1112 (коллекционного штамма) стационарной фазы роста, как описано выше, и перерастворяли в 1 мл этанола. Биологическая активность сырцов фактора di, оцениваемая по влиянию на дыхательную активность продуцента и выраженная в условных единицах на 1 л культуральной жидкости и 1 г сухих клеток, оказалась на порядок выше у изолята A. globiformis из мерзлотной породы по сравнению с коллекционным штаммом A. globiformis (табл.1).
Образование покоящихся форм в циклах развития A. globiformis в условиях дисбаланса по источникам питания и/или энергии
В контрольной среде этот показатель даже несколько выше и достигает 0.3% от максимального числа жизнеспособных клеток в фазе максимального накопления биомассы. При микроскопировании в фазово- контрастном микроскопе большинство клеток при хранении в лимитированных по источнику С и N средах имеют вид "чехлов", что коррелирует с низкими показателями жизнеспособности в данных условиях.
Наиболее высокий процент жизнеспособных клеток был обнаружен при выращивании и последующем хранении культуры в модифицированной среде 1 с увеличенным в 5 раз содержанием источника С и уменьшенным в 2 раза содержанием источника N по сравнению с контролем. Число жизнеспособных клеток в данном варианте к 4-му месяцу хранения было высоким и составило 46% от первоначального показателя (табл.5).
Во всех случаях восстановление жизнеспособности при переносе клеток на свежую агаризованную среду (МПА) не требовало каких-либо специальных условий и колонии обнаруживались на 3 сутки инкубации в стандартных условиях.
Таким образом, дисбаланс источников питания, когда С N, не всегда благоприятен для образования покоящихся форм у артробактера. Вместе с тем, полученные результаты явно указывают на то, что в условиях лимита источника энергии, т.е. снижения содержания С в среде, способность образования специфических форм переживания у Arthrobacter ghbiformis значительно возрастает, при этом восстановление жизнеспособности происходит без применения специальных приемов реанимации.
Отметим, что в экспериментах по восстановлению жизнеспособности специфических переживающих клеток штаммов Arthrobacter ghbiformis, полученных в результате хранения 5 месяцев в модифицированной среде 1, вариант 3, было обнаружено появление разных по размеру, но идентичных по другим культуральным признакам колоний, которые выявлялись в разные сроки инкубации на плотной среде. Так, первые колонии диаметром до 0.4 см визуализировались на 3 - и сутки инкубации, а через неделю обнаруживались мелкие колонии диаметром до 0.1 см, размер которых не увеличивался при дальнейшей инкубации. Микроскопические исследования в фазово-контрастном микроскопе выявили полную идентичность клеток по морфологии. Полученные результаты свидетельствуют о гетерогенности клеток в хранящихся суспензиях, возможно по глубине покоя и способности реверсии в вегетативные формы. Эти данные представляют большой интерес для выявления механизмов регуляции активности микроорганизмов в почве и предполагают расширение исследований в данном направлении.
Помимо признака длительного сохранения жизнеспособности ЦРК изученных штаммов Arthrobacter globiformis в течение 4-6 месяцев в провокационных условиях — средах, не предназначенных для хранения (0.2% глюкозы и 0.05 г/л источника N), полученная популяция ЦРК обладала и другими признаками покоящихся форм: отсутствием эндогенного дыхания и повышенной терморезистентностью.
Периодически (каждые 20 дней) проверяемый полярографически уровень эндогенного дыхания давал отрицательные результаты. Дыхательная активность восстанавливалась лишь в прорастающих суспензиях ЦРК (3 часа инкубации в свежей питательной среде).
При изучении степени устойчивости ЦРК к экстремальным внешним воздействиям, что является еще одним признаком покоящихся форм, суспензию клеток, сохранивших свою жизнеспособность в течение 4-х месяцев на уровне 46%, прогревали в течение 10 мин при 80С. Клетки обнаружили высокую терморезистентность, сохранив жизнеспособность после прогревания на уровне до 70% от первоначальной (табл.6).
Полученные результаты представляют особый интерес, так как известно, что клетки артробактерий (как палочковидные, так и кокковидные) выдерживают прогревание только до 55С (Квасников, Писарчук, 1980). Кроме того, по уровню терморезистентности покоящиеся формы изученных артробактерий превышают уровень терморезистентности покоящихся форм другой почвенной неспорообразующей бактерии - Micrococcus luteus и даже цистоподобных рефрактерных клеток Bacillus cereus, которые сохраняли жизнеспособность после такого же прогревания на уровне 33% (табл.6).
В экспериментах, когда для получения ЦРК и последующего их хранения использовали среду 2 с высоким содержанием источника С и Р, но недостатком N, через 2 месяца хранения была получена популяция клеток, которая при рассеве аликвот на плотную среду МПА в стандартных условиях сохраняла число жизнеспособных клеток на уровне 0.46% (вариант 1) и 0.97% (вариант 2).
В отличие от ЦРК, полученных на модифицированной среде 1, ЦРК, образовавшиеся в среде 2, требовали особых условий реанимации, когда количество выявляемых по числу КОЕ жизнеспособных клеток увеличивалось на порядок (табл.7). Для реанимации использовали жидкую среду следующего состава: 0.1 М К2НР04 , 0.1% дрожжевой автолизат, рН 8.0. В качестве инокулята использовали клеточные суспензии, полученные и хранившиеся в течение 2-х месяцев в среде 2 (варианты 1 и 2), т.е. в условиях избытка СиР, но недостатка N. Реанимацию ЦРК проводили в течение 40 минут, после чего суспензии высевали на стандартную плотную среду МПА для учета КОЕ.
После применения процедуры реанимации число жизнеспособных ЦРК возросло в 15 раз, в то время как число КОЕ, полученное в контроле при росте в среде без дисбаланса источников питания, после проведенной процедуры не увеличивалось (табл.7).
Высокий уровень сохранения жизнеспособности в последнем варианте позволяет предположить, что полученная популяция клеток представлена покоящимися формами- Наблюдения в фазово-контрастном микроскопе показали, что более 70% клеток в препаратах остаются интактными, не обнаруживают признаков автолиза и могут быть отнесены к ЦРК, т.е покоящимся формам. Клетки имеют округлую форму и диаметр от 0.3 до 0.4 мкм. Однако явных признаков рефрактерности удавалось выявить не у всех клеток, возможно вследствие невыраженности этого признака у небольших по размеру клеток.
Сходные результаты были получены нами в экспериментах со штаммами Arthrobacter globiformis 235-2 и 348-10, выделенными из вечномерзлых осадков. Через месяц хранения в варианте 3 среды 1 число жизнеспособных клеток в суспензиях снизилось также как и у коллекционного штамма В-112 на 40-50% и оставалось на том же уровне через 2-3 месяца хранения.
Проведенные исследования показали, что штаммы Arthrobacter globiformis в определенных условиях роста - при дисбалансе по источникам питания, завершают цикл их естественного развития образованием клеток, которые по длительности сохранения жизнеспособности (до 4-х месяцев), отсутствию экспериментально выявляемого метаболизма ( о чем судили по отсутствию эндогенного дыхания), и повышенной устойчивости к экстремальным факторам (терморезистентности), могут быть отнесены к покоящимся формам. В отличие от подобных форм других почвенных грамположительных бактерий - неспорообразующей Micrococcus luteus и спорообразующей -Bacillus subtilis при репрессии спорообразования (Мулюкин, 1998), для: образования покоящихся клеток артробактериям требуется более длительный срок - до 1 месяца, что, по-видимому, объясняется стратегией роста в природных условиях.
