Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Этиологическое значение и биологические свойства стафилококка и синегнойной палочки
1.1. Этиологическая роль стафилококка и сине -гнойной палочки в инфекционной патологии человека 9
1.2. Морфологические, культуральные и биохимические свойства стафилококка и синегной ной палочки 16
Глава 2 . Лечебное действие антибиотиков. Чувствительность штаммов стафилококка и синегнойной палочки к антибиотикам .... 24
Глава 3 . Действие антибиотиков на иммунологическую реактивность организма 34
Глава 4. Материалы и методы исследований 50
Глава 5 . Морфологические, культуральные, биохимические свойства и вирулентность штаммов ста филококка и синегнойной палочки 63
Глава 6 . Чувствительность in vitro выделенных штаммов стафилококка и синегнойной палочки к це порину, рифампицину и гентамицину 80
Глава 7. Комбинированное действие антибиотиков на стафилококк и палочку синезеленого гноя в опытах
Глава 8 . Лечебное действие рифампицина и гентамицина при экспериментальной ассоциированной стафило-синегнойной инфекции 92
Глава 9. Состояние иммунологической реактивности организма белых мышей при лечении рифампивдном и гентамицином стафило-синегнойной инфекции 101
9.1. Влияние рифампицина и гентамицина на фагоцитоз 102
9.2. Влияние рифампицина и гентамицина на содержание лизоцима в сыворотке крови экспериментальных животных 105
9.3. Плазмоцитарная реакция в лимфоидных ор -ганах белых мышей при стафило-синегной -ной инфекции, леченных рифампицином и гентамицином 108
9.4. Действие рифампицина и гентамицина на антителообразующуго функцию лимфоидных органов ИЗ
9.5. Влияние антибиотиков на синтез антител 119
Глава 10. Обсуждение результатов исследований 124
Выводы 138
Указатель литературы 140
Приложение 167
- Этиологическая роль стафилококка и сине -гнойной палочки в инфекционной патологии человека
- . Действие антибиотиков на иммунологическую реактивность организма
- . Морфологические, культуральные, биохимические свойства и вирулентность штаммов ста филококка и синегнойной палочки
- Состояние иммунологической реактивности организма белых мышей при лечении рифампивдном и гентамицином стафило-синегнойной инфекции
Введение к работе
В свете решений ХХУІ съезда Коммунистической партии Советского Союза и Советского правительства наиболее важным научным направлением на XI пятилетку является совершенствование методов профи -лактики, диагностики и лечения наиболее распространенных заболе -ваний.
Актуальной задачей современной медицинской науки является борьба с гнойными заболеваниями в хирургической, акушерской и педиатрической практике (С.Г.Бойков, 1982; М.И.Орзуев, ЛЛЬГуто-рова, Л.ПЛершина и др., 1982; Н.И.Вальвачев, А. 0.Жиже ль, А. А .Ку-кулянский и др., 1983). Несмотря на широкое применение антибио -тических препаратов, эта проблема еще не решена. В настоящее время среди возбудителей хирургических инфекций ведущими являются стафилококки и различные грамотрицательные палочки, особенно рода Pseudomonas (С.В.Рачинский, Л.К.Катосова, Г.Н.Саттаров и др., 1984). Эти тяжелые нагноения, трудно поддающиеся лечению,нередко приобретают септический характер и дают большое количество летальных исходов. Особое место занимают стафилококки и синегной-ная палочка в возникновении гнойных внутрибольничных инфекций (М.А.Ашрапова, М.Р.Ашурова, А.А.Ильхамов, 1981; Л.А.Анисимова, С.Захариева, А.М.Воронин, 1982).
В последние годы произошли выраженные сдвиги в этиологиче -ской структуре гнойных заболеваний, связанные с ростом инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, в частности, синегной-ной палочкой. Нередко синегнойная палочка является возбудителем вторичной инфекции при длительно незаживающих ранах, ожогах, а также может вызывать самостоятельно такие заболевания, как сепсис, гнойный плеврит, эндокардит, менингит, остеомиелит и др. (Б.М.Бекбергенов, А.Ф.Мороз, Э.А.Рудзит и др., 1979). Трудности
лечения синегнойной инфекции связаны с тем, что синегнойная палочка обладает сложной системой ферментов и высоко устойчива к большинству применяемых антибиотиков (Ю.В.Вертиев, Н.С.Бродинова, А.Ф.Мороз, 1981).
При раневой инфекции чаще всего приходится сталкиваться со смешанной микрофлорой ОЛІ.Шеина, А.А.Арутчева, 1983; Л.А.Гама -лея, А.М.Хохлов, Ю.В.Стручков и др., 1983). Сложности в лечении гнойных инфекций возникают в том случае, если инфекции обусловлены сочетанием стафилококка и синегнойной палочки (И.И.Колкер, Е.С.Станиславский, 1979; Л.Ф.Богданова, В.Р.Соболев, В.М.Земсков, 1980). Смешанные инфекции характеризуются тяжестью процесса дли -тельно незаживающих ран, плохо поддающихся лечению. Особая тяжесть возникает при генерализованной инфекции, которая нередко заканчивается летальным исходом. В связи с этим представляется очевидным появление стафилопротейно-псевдомонас вакцины, которая обладает не только протективным, а даже лечебным действием (Л.С.Крейнин, Н.Б.Егорова, Е.С.Станиславский и др., 1983).
Лечение гнойных инфекций в настоящее время является чрезвычайно сложной и многогранной проблемой, где основой терапии яв -ляется комплексный подход к ее разрешению, кардинальными вопро -сами которого являются антибактериальная терапия и повышение иммунобиологической реактивности организма. Если до недавнего времени под рациональной химиотерапией было принято подразумевать использование одного из антибиотиков, специфически действующего на конкретный вид возбудителя, то в последние годы часто складывается ситуация, требующая применения при одновременном использовании не одного, а нескольких препаратов. Комбинированная анти -бактериальная терапия нашла широкое применение при лечении гнойных осложнений, особенно при заболеваниях, вызванных микробной ассоциацией, при устойчивости возбудителей к широко применяемым
препаратам, очень тяжелом течении воспалительного процесса.
Из данных отечественной и зарубежной литературы известно,что антибиотики, обладая в организме антибактериальным действием,оказывают влияние на неспецифические факторы защиты и иммунологиче -скую реактивность организма, действуют на гуморальный и клеточный иммунитет, играющий важную роль при защите макроорганизма от ин -фекции. Именно выяснение механизмов действия антибиотиков на способность организма формировать иммунитет в процессе развития ин -фекционных заболеваний,позволило подойти к созданию наиболее ра -циональных методов химиотерапии.
Попытки повысить показатели иммунологической реактивности организма и привели многих исследователей к применению комбинаций антибиотиков.
В связи с этим нам представлялось обоснованным изучить возможность применения сочетания рифампицина и гентамицина для ле -чения экспериментальной стафило-синегнойной инфекции, поскольку эти препараты обладают широким спектром противомикробной актив -ности и механизм их действия на микробную клетку принципиально различен.
Целью настоящей работы явилось экспериментальное обоснова -ние комбинированного лечения рифампицином и гентамицином ассоциированной стафило-синегнойной инфекции путем комплексного изуче -ния терапевтической эффективности сочетания этих антибиотиков, а также изучения динамики изменения показателей клеточного и гуморального иммунитета у экспериментальных животных.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи;
I) изучить основные биологические свойства и чувствитель -
НОСТЬ К антибиотикам ШТаММОВ Staphylococcus И Pseudomomas »
выделенных нами из патологического материала больных хирургической клиники г.Харькова;
2) разработать модель экспериментальной инфекции, вызванной
выделенными штаммами стафилококка, Pseudomonas aeruginosa
и ассоциацией этих возбудителей;
установить терапевтическую эффективность рифампицина, ген-тамицина и их сочетания на моделях экспериментальной инфек -ции;
провести сравнительную оценку уровня и динамики фагопи -тоза и лизоцима сыворотки крови, плазмоцнтарной реакции и анти -телообразующей функции лимфоидных органов, содержания антител у экспериментальных животных со стафило-синегнойной инфекцией, ле -ченных рифампицином и гентамицином, применяемыми раздельно и в сочетании;
обосновать значимость и возможность применения сочетания рифампицина и гентамицина для лечения стафило-синегнойной инфек -ции.
Научная новизна: на основании комплекса микробиологических
и иммунологических исследований дана характеристика основных био
логических свойств и чувствительности к антибиотикам госпитальных
штаммов стафилококка и Ps. aeruginosa , выделяемых в
настоящее время в хирургических отделениях г.Харькова.
Впервые изучена сравнительная терапевтическая эффективность применения рифампицина,гентамицина и их комбинации при экспериментальной стафило-синегнойной инфекции. Показаны преимущества комбинированного лечения, обеспечивающего как наибольшую выживаемость экспериментальных животных, так и наиболее быстрое восстановление нарушенных иммунологических процессов.
Практическая ценность работы. Результаты проведенных нами экспериментальных исследований показали эффективность сочетанно-
іго применения рифампицина и гентамицина.
Перспективность использования данной комбинации подтвердилась при лечении хирургических больных с гнойными процессами ста-фило-синегнойной этиологии по предложенной нами методике в обла -стной больнице № I (руковод.- к.м.н.К.Ф.ЇЇодгулько), областной клинической больнице (руковод.- к.м.н. А.Я.Малоштан), 4-й больнице скорой помощи им.проф.Мещанинова (руковод.- к.м.н.Д.Д.Полоз).
Было отмечено, что из 30 больных у 26 человек сочетание данных антибиотиков обеспечивало быстрое клиническое и бактериологическое выздоровление по сравнению с больными, леченными то -лысо карбенишшшном, гентамицином и местно- борной кислотой. Это обстоятельство свидетельствует о принципиальной возможности и перспективности лечения указанной патологии комбинацией рифампицина и гентамицина. Результаты исследований внедрены в практическую работу второго хирургического отделения дорожной клинической больницы г.Харькова, а также используются в лекциях - для студентов Харьковского и Одесского медицинских институтов по специальностям; микробиология и общая хирургия.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на конференции молодых ученых Харьковского медицинского института (1978 г.); заседании Харьковского научно-медицинского общества микробиологов (1978 г.); научной сессии Харьковского медицинского и фармацевтического институтов (1979 г.); юбилейной конференции - 175 лет ХМИ (1980 г.); совместном заседании кафедр микробиологии и общей хирургии ХМИ и кафедры микробиологии института усовершенствования врачей г.Харькова (1981г., 1983 г.).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста, включает 24 таблицы, состоит из введения, 3 глав обзора литературы, главы "Материалы и методы",
5 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и приложения. Библиографический указатель включает 258 источников (179 отечественных и 79 зарубежных).
На обсуждение выносятся следующие основные положения диссертации:
биологические свойства выделенных штаммов стафилококка и синегнойной палочки;
терапевтическая эффективность рифампицина, гентамицина и их комбинации;
состояние иммунологической реактивности организма бе -лых мышей, при стафило-синегнойной инфекции.
Этиологическая роль стафилококка и сине -гнойной палочки в инфекционной патологии человека
Острая гнойная инфекция - одна из актуальных и сложных проблем современной медицины. Несмотря на применение целого ком -плекса профилактических мероприятий, большого арсенала современ -ных лекарственных препаратов для лечения воспалительных заболеваний, число гнойных инфекций и осложнений во всем мире в последние годы не только не уменьшается, а даже увеличивается.
Развитие гнойно-воспалительного процесса зависит от многих обстоятельств. Имеет значение состояние больного, предшествующие заболевания, угнетение защитных сил организма, зависящее от многих факторов внешней и внутренней среды (А.И.Борис,1980).
Анализ бактериологических исследований показывает, что возбудителями гнойной хирургической инфекции являются стрептококки, пневмококки, протей, синегнойная палочка, кишечная палочка. Ос -новное же этиологическое значение в раневой инфекции принадлежит стафилококку (ЭЛ.Шеина, А .А .Арутчева, 1982). Значительно возросла роль стафилококка при таких заболеваниях, как конъюктивиты, ангины, гаймориты, маститы, эндокардиты, стоматиты и другие (Ю.В.Дяченко, 1977; Р.А.Трунилина, 1979).
Особую опасность представляют стафилококковые инфекции в хирургических стационарах, где циркулируют высокорезистентные к антибиотикам штаммы патогенного стафилококка. Рост стафилококковых инфекций можно объяснить широкой распространенностью и быстрой приспособляемостью патогенного стафилококка к применяемым лекарственным препаратам, особенно к антибиотикам. Кроме того,при -чиной возрастания внутрибольничных инфекций является нерациональ II нов применение антибиотиков, что приводит к появлению антибиоти-корезистентных штаммов микроорганизмов, развитию суперинфекций и нарушению ряда систем макроорганизрла (Б.М.Бекбергенов, Н.Г.Анциферова, А.Ф. Мороз и др., 1976).
Было отмечено, что источником внутригоспитальной инфекции являются носители патогенного стафилококка из числа лиц медицинского персонала или больных. При проверке на носительетво стафи -лококка положительные результаты выявлены у 57 процентов медицинского персонала и у 46,5 процента больных, причем в 80 процентах случаев выделенные штаммы были резистентны ко многим антибиоти -кам (Г.Н.Захарова, И.В.Горфинкель, 1979). Патогенные стафилококки высевались из воздуха палат, перевязочных, операционных, что указывает на высокую обсемененность стафилококком среды, окружающей больного. 0 высоком уровне носительства патогенных стафилококков среди обслуживающего персонала в хирургической клинике указывают В.Й.Стручков, А.В.Григорян, В.К.Гостищев (1975)Д.Н.Си-даренко, Ю.А.Когосов, А.Ю.Спасокукоцкий (1977), которые изучали обсемененность патогенными стафилококками воздуха хирургических отделений, слизистоых оболочек носа обслуживающего персонала и больных при поступлении. Изучение свойств выделенных штаммов стафилококка позволило авторам установить факт инфицирования послеоперационных ран в основном за счет внутрибольничных штаммов,источником которых следует считать носителей среди обслуживающего персонала (Л.Н.Сидаренко, А.Ю.Спасокукоцкий, 1975). Высокая заболеваемость стафилококковой инфекцией сочетается с высокой летальностью, которая колеблется от 10 до 80 процентов. Смертность превышает таковую от многих "классических" острозаразных болезней, вместе взятых (Э.М.Гамидов, И.Р.Насиров, 1978).
Особенно большую угрозу представляют стафилококки в родовспомогательных учреждениях. Если до 40-х годов заболевания, вызванные стафилококком в акушерской и гинекологической практике, встречались сравнительно редко, то в последующие годы они заняли одно из первых мест (С.Д.Воропаева, 1974). Стафилококковая инфекция среди новорожденных и матерей является серьезным осложнением и нередко носит характер эиидемических вспышек с тяжелым течением. Стафилококки являются одной из причин высокой заболеваемости и летальности недоношенных детей. Сепсис у недоношенных, вызванный стафилококками, чаще протекал в форме септикопиемии. О развитии стафилококкового сепсиса среди новорожденных на фоне предшествующей асфиксии, родовой травмы, заболевания матерей указывает Н.Н.Прутовых (1981). С целью определения эпидемических особенностей стафилококков проводилось обследование персонала, новорожденных, матерей и внешней среды родильного стационара. В результате пребывания в стационаре наблюдалось увеличение обсемененности стафилококком новорожденных в 7 раз, матерей - в 2 раза (Б.Л.Гур-товой, 1980), Заметное увеличение носительства отмечалось уже через 10 дней пребывания в стационаре больных хирургических отделений ( E.S.Holzman , A.L.Tlorman , M.Lyman , 1980). При проверке обсемененности новорожденных патогенными стафилококками было выявлено следующее; в первые минуты после рождения новорожденные стерильны, к концу третьих суток стафилококк высевали у 14%, на четвертые - пятые сутки - у 91$, а к моменту выписки одновре -менно из зева, носа, кожи, кала стафилококки были высеяны у 99 t процентов детей, в большинстве случаев в чистом виде. Особенно \ опасным источником внутрибольничных инфекций в родильных домах являются здоровые носители патогенных стафилококков среди меди -цинского персонала, где инфицирование новорожденных осуществляется прежде всего капельным путём. Возросло количество маститов и других родовых инфекций. По. данным В.С.Бородянского (1977), ста ІЗ
филококк является возбудителем мастита в 63 случаев, часто осложняющихся гангреной молочной железы (Е.Н.Карасев, 1980). По данным литературы видно, что резистентные стафилококки можно выделить у людей, которых не лечили антибиотиками, и, наоборот, можно не обнаружить резистентных штаммов стафилококка у людей, которых лечили антибиотиками (В.С.Зуева, И.А.Щагинян, С.Г.Масленников и др., 1975). Таким образом, в естественных условиях, по всей вероятности, действуют неизученные факторы, которые могут влиять на интенсивность распространения устойчивых микроорганизмов. Все эти данные свидетельствуют о возможности проблемы внушрибольничной инфекции, вызванной патогенным стафилококком (А.К.Акатов, 1977).
Отмечая важную роль стафилококка как одного из основных возбудителей внутригоспитальной инфекции, необходимо, однако,подчеркнуть, что отмеченное некоторое снижение высеваемости стафи -лококка объясняется увеличением в последние годы инфекций, выз -ванных различными грамотрицателышми бактериями, особенно Ps. aeruginosa (В.Р.Соболев, И.В.Власова, В.Е.Соловьева и др., 1975; А.Я.Веселов, С.А.Паевский, Р.Я.Галанова, 1978; J.M.Lynch. , G.R.Hodges , G.M.Clark et al. , 1981; Х.И.Исхакова,В.В.Вло-давец, 1982).
. Действие антибиотиков на иммунологическую реактивность организма
Оценка состояния реактивности организма относится к числу важных клинических характеристик при инфекционных процессах. А знание фазовых изменений в состоянии сопротивляемости организма больного на различных этапах гнойного процесса создает оптимальные условия для правильного патогенетического лечения (Л.Н.Сидаренко,Ю.А.Кого-сов, А.Ю.Спасокукоцкий, 1977).
В основе развития инфекционного процесса лежат определенные иммунологические реакции, комплекс которых направлен на предупреждение проникновения в организм генетически чужеродных агентов. В развитии иммунного ответа на внедрившийся антиген участвует три типа клеток: Т- В - лимфоциты и макрофаги. Первыми из этих клеток вступают в контакт с антигеном макрофаги. Часть захваченного макрофагами антигена гидролизуется, а часть соединяется с РНК и выходит на клеточную поверхность. Макрофаги, захватившие и перерабо -тавшие антиген, обеспечивают кооперацию Т- и В-лимфоцитов, неся им информацию, необходимую для иммуногенеза. Кроме того, макрофаги способны осуществлять одну из мощных защитных реакций организма -фагоцитоз.
Наряду с прямой защитной функцией (захват и переваривание чужеродного агента), макрофаги занимают особое положение в системе иммунитета тем, что, несмотря на неспецифичность самого фагоцитарного процесса, они принимают участие в подготовке антигенов и переработке их в иммуногенную форму (Р.В.Петров, 1982).
Суждение об активности макрофагов практически возможно лишь в эксперименте на животных, у которых легко можно получить макрофаги из эксудата брюшной полости. В организме человека суждение об уровне фагоцитоза возможно на основании данных о фагоцитарной активности лейкоцитов-крови. С помощью фагоцитоза организм освобождается от возбудителей инфекции, захватываемых и частично уничтожаемых фагоцитами, а также от многих токсических веществ, от продуктов некротического распада тканей (І.А.Тараненко, Г.Е.Вайс-берг, 1978).
Фагоциты оказались клетками, способными защищать организм от патогенных микробов в форме прямого поглощения, разрушения и переваривания. Однако имеются данные о слабом развитии защитной реакции организма при гнойных инфекциях. Процесс фагоцитоза как один из показателей неспецифических факторов защиты организма изучали многие авторы (0. Castro , V.T.Andriole , S.C.Finsch , 1972; J.Bialas J. ,E.Sitarska , 1975; F.Namavar , J.de Graaff, D.M.MacLarsn , 1979).
Работы последнего времени показали, что высокая чувствительность указанной реакции на различные воздействия внешней среды, значение макрофагов в поддержании гомеостаза, а также обеспече -нии естественной резистентности к инфекции и роли макрофагов в специфическом иммунитете дают возможность трактовать полученные фагоцитарные результаты не только с точки зрения нарушения иммунитета, но и как изменения общей реактивности организма(И.Я .Учитель, 1978). В очаге воспаления вслед за мобилизацией естественных (неспецифических) факторов резистентности начинается разви -тие иммунологической реакции, специфически направленной на инактивацию и выведение (отторжение) данного антигена.
Иммунный ответ осуществляется лимфоидной системой. Клетки, ответственные за иммунные реакции, называются иммунокомпетентны-ми и находятся в центральных (тимус, костный мозг, сумка Фабщ -циуса и др.) и периферических (селезенка, лимфатические узлы) органах иммунитета.
В настоящее время не вызывает сомнения существование трех типов иммунокомпетентных клеток: Т- (тимусзависимые), В- (бурса зависимые) и вспомогательные А клетки-макрофаги (Р.В.Петров, 1976; І.Н.Фонталин, І.А.ЇЇевницкий, 1978).
Нарушение любой фазы иммунного ответа способно привести к дефициту иммунитета. Различают недостаточность В-системы иммунитета, Т-системы, комбинированные формы, состояния, связанные с дефектами фагоцитоза. Основным признаком этих заболеваний являются рецидивирующие инфекции, в том числе и вызванные возбудителями хирургической инфекции, со склонностью к генерализации (М.И.Кузин, С.М.Белоцкий, В.А.Карлов, 1981).
Иммунокомпетентные клетки способны осуществлять как гуморальный, так и клеточный иммунитет. Среди этих клеток имеются комми -тированные, т.е. способные отвечать только на определенный анти -ген, и некоммитированные, которые могут отвечать на любой антиген (А.Б.Вершигора, 1980).
Центральную роль в иммунном ответе играет тимус. Он регули -рует деятельность иммунокомпетентных клеток, по всей вероятности, следующим образом: во-первых, "обучает" стволовые клетки; во-вторых, выделяет гормоны, которые подобное "обучение" проводят в периферических лимфатических органах. Кроме того, гормоны тимуса способствуют созреванию Т-клеток. Система Т-лимфоцитов осуществляет контроль клеточного иммунитета при большинстве вирусных инфекций, туберкулезе, бруцеллезе, противоопухолевый иммунитет и др. Система В-лимфоцитов обеспечивает гуморальный юлмунитет против большинства бактериальных инфекций, антитоксический иммунитет и др. (Р.В.Петров, 1982).
В современной иммунологии связь процесса образования иммунных антител, т.е. факторов гуморального иммунитета, с функцией лимфоидной ткани является очевидной. Имеются вполне достоверные данные и о категории клеток, с которыми связано образование антител в лимфоидных органах, это клетки плазмоцитарного ряда. Характер антигена влияет на течение плазмоцитарной реакции. В литературе имеются данные, свидетельствующие о соотношении между продук - нией антител под влиянием антигенной стимуляции и плазмоцитарной реакции со стороны лимфоидных органов (Л.Н.Фонталин, 1967).
Степень участия различных лимфоидных органов, образующих систему, объединенную единством строения функции и особыми межорганными гормональными и клеточными взаимосвязями (Э.В.Лукач, 1974), в иммунном процессе неодинакова. Такие органы, как лимфатический узел, селезенка, непосредственно участвуют в иммунологической реакции (П.Ф.Зцродовский, Г.А.Гурвич, 1972).
По данным Р.С.Незлина (1966), только часть плазматических клеток продуцирует антитела против введенного антигена. Течение плазмоцитарной реакции зависит от вводимого антигена. Растворимые антигены оказывают непосредственное влияние на лимфоидную ткань и вызывают более интенсивное накопление плазматических клеток,чем корпускулярные антигены. Но не только характер антигена играет роль, а и место введения определяет, какие группы лимфоидных органов включаются в процесс антителообразования. Кроме того, при одной и той же инфекции препараты, применяемые различными мето -дами, могут вызвать неодинаковые изменения иммуногенеза.
. Морфологические, культуральные, биохимические свойства и вирулентность штаммов ста филококка и синегнойной палочки
Принцип этого метода основан на том, что диальдегид и глютаральдегид связывают белки с ферментом посредством свободных аминогрупп. Конъюгаты, полученные этим методом, имеют вы сокий молекулярный вес и являются гетерогенными. Существенным недостатком данного метода является значительное самосвязывание молекул иммуноглобулина и снижение иммунологической активности антител. При одноступенчатом связывании обычно наблюдается низкая степень связывания фермента с белком. Например, показано, что только Ъ% от общего количества пероксидазы хрена, взятой в реакцию, соединялось с антителами ( wisdom, 1976) Двуступенчатый метод приготовления конъюгатов с помощью глютаральдегида
Показано, что молекула пероксидазы хрена вступает в реакцию только с одной альдегидной группой молекулы глютарового альдегида, вторая альдегидная группа перекрестносвязывающего вещества не способна реагировать с той же самой молекулой или с другими молекулами пероксидазы. Это свойство пероксидазы и положено в основу двуступенчатого связывания глютаральдегидом. После обработки пероксидазы глютаральдегидом и удаления последнего, пероксидаза вступает в реакцию со свободной аминогруппой антигена или антитела. Двуступенчатый метод приготовления конъюгатов обеспечивает получение более активных и специфичных конъюгатов. Так, например, удельная активность перок-сидазных конъюгатов, приготовленных двуступенчатым методом, была в три-четыре раза выше активности конъюгатов, полученных одноступенчатым методом (С.С.Маренникова с соавтор., 1982). Кроме того, активность и специфичность пероксидазных конъюгатов можно значительно повысить, если готовить конъюгаты не на основе иммуноглобулинов класса G , а на основе Fab - фрагментов и чистых антител.
Согласно данным Boorsma et al. (1976), Molin et al. (1978), активность пероксидазных конъюгатов, получаемых по оригинальной методике двуступенчатого связывания глютаровым альдегидом, составляла 40-50$ от первоначальной активности перо-ксидазы. Увеличение исходного молярного соотношения IgG : пероксидаза до 1:20 при получении конъюгатов приводило к уменьшению само связывания молекул IgG ( Nygren et al., 1979). В результате активность пероксидазного конъюгата снижалась только до 70$ от первоначальной активности фермента. Получение пероксидазных конъюгатов путем окисления сахаридных групп и образования оснований Шиффа
Пероксидаза хрена имеет восемь сахаридных групп, не входящих в активный центр фермента. Окисленные олигосахаридные группы могут вступать в реакцию с аминогруппами второго белка. На этом основан метод связывания пероксидазы хрена с белками, разработанный Uakane, Kawaoi (1974). В этом случае пероксидазу хрена предварительно обрабатывают 2,4-фтор-динитробензолом для блокирования ее свободных аминогрупп и предотвращения самосвязывания. Олигосахариды окисляют перио-датом натрия до альдегидных групп, после чего пероксидаза вступает в реакцию со свободными аминогруппами второго белка, а образуемые при этом основания Шиффа восстанавливаются боргидридом натрия, в результате чего возникают стабильные связи. По данным упомянутых выше авторов с помощью этого способа связывания достигается включение в конъюгаты около 75-80$ от общего количества пероксидазы и до 99$ ig& . Однако активность фермента, включенного в конъюгат, снижается до от первоначальной ( Boorsma, Steefkerk , 1976). Путем тщательного подбора мольных соотношений белковых компонентов и концентраций периодата натрия удалось получить иммуноперокси-дазные комплексы с сохранением 100$ иммунологической и 70$ ферментативной активностей (Е.М.Гаврилова с соавтор., 1979).
Сравнение различных серологических методов определения антигенов и антител показало, что иммуноферментные методы обладают высокой чувствительностью, уступая, однако, радиоиммунологическому методу. Так, например, по сообщению Bemston et al. (1978) при определении антител к пневмококковому полисахариду иммуноферментный метод оказался чувствительнее РНГА в 500 раз, а при определении дифтерийного токсина метод иммуноферментно-го анализа был чувствительнее реакции пассивной кожной анафилаксии в 10 000 раз ( Svenson, barsen , 1977). При выявлении антител против трипанозом методами иммуноферментного анализа и иммунофлуоресценции оба эти метода характеризовались одинаковой чувствительностью; но, с другой стороны, метод иммуноферментного анализа оказался более чувствительным, чем метод иммунофлуоресценции при обнаружении антител к Trichinella spiralis ( Ruitenberg et al. , 1975). Было показано, что радиоиммунологический и иммуноферментный методы при обна ружении антигена гепатита В обладают сходной чувствительностью, а при определении иммуноглобулинов класса G чувствитель ность иммуноферментного метода была даже выше чувствительнос ти радиоиммунологргаеского ( Waart, Sclmurs ,1977). Как следует из приведённых данных литературы, разработка надежного специфического теста серодиагностики синегнойной инфекции прежде всего связана с изучением серологических свойств антигена, а также с выбором самого метода тестирования. Высокая чувствительность и точность иммуноферментного метода, а также возможность его автоматизации делают данный метод наиболее перспективным для использования в практике лабораторных исследований. В связи с этим на первый план выдвигается задача получения препаратов антигенов, обладающих специфичностью для вида синегнойной палочки
Состояние иммунологической реактивности организма белых мышей при лечении рифампивдном и гентамицином стафило-синегнойной инфекции
Для выделения частично очищенных антигенов слизи бактериальные клетки синегноинои палочки выращивали в течение 18-24 часов на чашках Петри с плотной питательной средой, на поверхность которой помещали целлофановые диски. Питательная среда имела следующий состав: 20$ гидролизата бычьего сердца, 3% гли -48 церина, 1$ дрожжевого экстракта, 0,5$ хлористого натрия, 1,5$ агар-агара СА.Д.Александров с соавтор., 1981). Культивирование проводили при температуре +37С.
Для выделения и частичной очистки препаратов слизи был использован метод Alms, Bass (1967а) с некоторыми нашими модификациями. Выросшую на целлофановых дисках бактериальную массу смывали физиологическим раствором. Полученную суспензию перемешивали на мешалке в течение 2-3 минут со скоростью вращения ротора 2-3 тыс. об/мин. и центрифугировали при 6000g I час при +4С. Супернатант отделяли от осадка (бактериальные клетки) центрифугированием, который повторно суспензировали в стерильном физиологическом растворе и подвергали центрифугированию. Затем осадок отбрасывали, супернатанты объединяли, фильтровали через фильтр Miliipore (с диаметром пор 0,45 мкм) и подвергали ультрацентрифугированию при 105 000 & в течение 2 часов при +4С. Дальнейшие операции проводили на холоду. К полученному раствору слизи синегнойной палочки добавляли уксусной кислоты и уксусно-кислого натрия до конечной концентрации I и 10$ соответственно и по каплям при перемешивании приливали три объема охлажденного 96$ этанола. Образовавшийся осадок через 18-24 часа отделяли центрифугированием в течение 30 минут при 6 000g и растворяли в минимальном объеме дистиллированной воды с последующим диализом его в течение 2-3 суток против дистиллированной воды. После диализа препарат слизи лиофильно высушивали и хранили в герметично закрытой посуде при комнатной температуре.Выделение очищенных антигенных компонентов слизи
Для получения высокоочищенных компонентов слизи использовали метод ионообменной хроматографии на колонках с ДЭАЭ целлюлозой. Лиофильно высушенный частично очищенный препарат слизи растворяли в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,2 в течение 18-24 часов. Затем раствор центрифугировали при 4-5 тыс.об/мин 30 минут и прозрачную надосадочную жидкость наносили на колонку с ДЭАЭ-52 целлюлозой (фирма "Whatman") , уравновешенной в том же буфере со скоростью 40 мл/час. На колонку размером 2,2 х 22,7 см наносили 50 мг частично очищенного препарата слизи. Колонку промывали 0,05 М фосфатным буфером рН 7,2, после чего наносили 600 мл градиента концентрации Пасі (0-2,0 М) в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,2. Поглошение фракций измеряли с помощью спектрофотометра СФ-26 при длинах волн 206, 260 и 280 нм. Фракции собирали по 5 мл, объединяли соответственно пикам элюции, измеренным при 206 нм, диализовали в течение 2-3 суток против дистиллированной воды и лиофильно высушивали. Серологическую активность каждого из пиков изучали в реакции преципитации в агаровом геле с кроличьими сыворотками, полученными к препаратам слизи синегнойной палочки. 4.8. Получение иммунных кроличьих сывороток к частично очищенным препаратам слизи синегнойной палочки " Иммунные кроличьи сыворотки к частично очищенным препара луРабота проведена совместно с сотрудником лаборатории ожоговых инфекций А.Д .Александровым.-ботам слизи из штаммов синегнойной палочки BI 82, 85, 87, 93, 700 PA-ЮЗ и 16 получали по схеме, предложенной Pier et al, (1978). Для иммунизации использовали кроликов породы "Шиншилла" весом 2,5-3 кг. Цикл иммунизации животных состоял из одной внутримышечной и трех внутривенных инъекций с интервалами в 5-6 дней. На внутримышечную инъекцию использовали 5 мг антигена, растворенного в 0,5 мл физиологического раствора и 0,5 мл полного адыованта Фрейнда. На внутривенную инъекцию использовали 5 мг антигена, растворенного в 0,5 мл физиологического раство-ра. Через неделю после последней иммунизации из сердца животного брали кровь. Антисыворотки в реакции преципитации против препаратов слизи в концентрации 10 мг/мл имели титры 1:8 -1:64.
