Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Сальмонеллез плотоядных и его профилактика 9
1.2. Аденовирусная инфекция плотоядных и ее профилактика 18
1.3. Иммунопрофилактики ассоциированными вакцинами 26
2. Собственные исследования 40
2.1. Материалы и методы 40
2.2. Результаты собственных исследований 52
2.2.1. Изучение биологических свойств производственных штаммов сальмонелл и аденовируса 52
2.2.2. Компонентный состав и основные принципы получения ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и аденовирусной инфекции 59
2.2.3. Изучение безвредности и специфической активности на лабораторных моделях 62
2.2.4. Сравнительная оценка иммуногенных свойств моно- и ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и аденовирусной инфекции плотоядных67
2.2.5. Изучение антигенной активности экспериментальной ассоциированной вакцины на морских свинках 71
2.2.6. Изучение иммунобиологической активности ассоциированной вакцины на песцах
3. Обсуждения результатов собственных исследований
4. Выводы 87
5. Сведения о практическом использовании научных 88 результатов
6. Рекомендации по использованию научных выводов 89
7. Рекомендации в производстве 90
8. Список литературы 91
9. Приложение 106
- Сальмонеллез плотоядных и его профилактика
- Аденовирусная инфекция плотоядных и ее профилактика
- Материалы и методы
Введение к работе
Актуальность темы. Продукция звероводческих хозяйств занимает видное место в международной торговле России, которая является одним из мировых лидеров. Однако в последние годы повысился уровень заболеваемости пушных зверей и 60-90% всех зарегистрированных болезней имеют алиментарно-инфекционное происхождение (35). Основными причинами являются отсутствие необходимой сортировки поступающих кормов, несоблюдение ветеринарно-санитарных правил, норм кормления и др. Одним из наиболее серьезных заболеваний, возникающих при этом, является сальмонеллез (паратиф), который в связи с его распространением среди сельскохозяйственных животных (124,133,144) становится особенно актуальной проблемой.
Широкое использование антибиотиков в последние 40 лет привело к появлению большого числа устойчивых к ним бактериальных штаммов (23). А использование антимикробных препаратов в недостаточно высокой дозе или раннее прекращение их применения приводит к переходу инфекции в хроническую форму или персистенции.
В звероводстве наряду с сальмонеллезом, возбудитель которого достаточно часто встречается в кормах животного происхождения, также широкое распространение имеет аденовирусная инфекция, которая также представляют серьезную опасность для плотоядных (82,129). Случаи этого заболевания животных в последнее время регистрируются во всем мире (116,146). Часто при вирусном гепатите пушных зверей выделяют возбудитель сальмонеллеза (56).
Поэтому вопросы разработки новых и совершенствования имеющихся средств специфической профилактики сальмонеллеза и аденовирусных инфекций плотоядных являются актуальными и имеют важное значение в обеспечении эпизоотического благополучия, сохранности поголовья зверей и повышения качества продукции.
Для профилактики вышеуказанных болезней используются моно- и ассоциированные вакцинные препараты. Применение моновакцин в пушном звероводстве повышает материальные и трудовые затраты на обработку животных, увеличивает количество стрессовых воздействий, создает значительные трудности в соблюдении графика своевременной вакцинации поголовья. Имеющиеся ассоциированные вакцины преимущественно содержат вирусные антигены, а бактериальные и вирусно-бактериальные не обеспечивают достаточной профилактической эффективности, из-за отсутствия наиболее эпизоотологически значимых антигенов.
Отмеченное позволяет сделать вывод о том, что вопрос создания ассоциированной вакцины против аденовирусной инфекции и сальмонеллеза плотоядных с высокой иммуногенной активностью является актуальной задачей, имеющей научное и большое практическое значение.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось проведение экспериментальных исследований по созданию ассоциированной вирусно-бактериальной вакцины против аденовирусной инфекции и сальмонеллеза плотоядных, с достаточной иммуногенностью, безвредностью для животных, стабильностью при хранении и технологичностью при производстве.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решать следующие задачи:
провести исследования по подбору штаммов для производства ассоциированной вакцины, изучить их биологические, антигенные и иммуногенные свойства.
- подобрать оптимальный состав штаммов и соотношения вакцинных антигенов. Изучить конкурентные свойства штаммов на питательных основах, составе вакцины и при введении их животным.
- разработать технологию производства ассоциированной адсорбированной на гидроокиси алюминии (ГОА) вакцины из живых и инактивированных вирусно-бактериальных антигенов в экспериментальных условиях
- изучить безвредность и иммуногенную активность ассоциированной вакцины на лабораторных моделях и восприимчивых животных.
- изучить иммунобиологические свойства и протективную активность экспериментальных серий ассоциированной вакцины на лабораторных моделях и пушных зверей.
Научная новизна работы заключается в том, что путем эпизоотологического анализа, подбора соответствующих штаммов, условий их культивирования, инактивации и адсорбции антигенов впервые разработана технология изготовления и применения ассоциированной вирусно- бактериальной вакцины против аденовирусной инфекции и сальмонеллеза у плотоядных животных, при иммунизации которой синтезируются комплекс вируснейтрализующих, антитоксических, антиадгизивных и
антигемолитических антител, позволяющие повысить эффективность противоэпизоотических мероприятий в пушном звероводстве.
Практическая значимость. Разработан проект нормативных документов, регламентирующих промышленное производство и применение (СТО, временное наставление по применению и регламент по производству).
Материалы работы включены в учебную программу по курсу «Иммунологии» и «Биотехнология» для студентов сельскохозяйственных вузов по специальности 310800.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на научных конференциях ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина.
Публикация. По теме диссертации опубликовано 3 научные работы.
Основные положения и результаты, выносимые на защиту: - результаты изучения биологических, антигенных и иммуногенных свойств штаммов аденовируса и сальмонелл для производства ассоциированной вакцины; оптимальный состав штаммов и соотношения вакцинных компонентов в ассоциированной вакцине; экспериментальные данные по разработке и испытанию ассоциированной вирусно-бактериальной вакцины на лабораторных моделях и песцах.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 107 страницах компьютерного текста в формате А4 и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы и практические предложения. Библиографический список включает 146 публикаций, из них 47 иностранных источников. Материалы иллюстрированы 16 таблицами, 4 фотографиями и 2 рисунками.
Сальмонеллез плотоядных и его профилактика
Сальмонеллёзы - группа инфекционных болезней преимущественно молодняка сельскохозяйственных и промысловых животных (телят, поросят, жеребят, ягнят, птиц, пушных зверей). Род Salmonella (паратифозные бактерии) в серологическом отношении родственны, патогенны для людей и животных или одновременно для тех и других. Данный род назван в честь американского исследователя Сальмона. Сальмонеллы могут вызывать первичные инфекции (сальмонеллёзы у молодняка, аборты у овец и кобыл, пуллороз птиц, брюшной тиф человека и др.), а также вторичные инфекции, осложняющие бактериальные и вирусные болезни. (99) У животных весьма распространены латентные инфекции - сальмонеллоносительство.(бО)
При употреблении инфицированных продуктов животного происхождения (мясо, молоко, яйца) сальмонеллы вызывают у людей токсикоинфекции. Животные являются основным резервуаром сальмонеллезои инфекции. Отмечается возрастающая роль сальмонелл как источников заболевания человека (136). В этой связи сальмонеллёзы представляют важную ветеринарную и медико-биологическую проблем.
. Патогенные серотипы сальмонелл для плотоядных
В настоящее время род Salmonella включает около 2500 сероваров, разделенных на 6 подвидов: choleraesuis, salamae, arizonae, diarizonea, houtenae и indica (121). Серовары отличаются друг от друга по соматическим и жгутиковым антигенам, различия их генома составляют 3,8-4,6%, а аминокислотного состава экспрессирумых полипептидов - 0,7-1,3%(143).
Поэтому серовары Salmonella следует рассматривать, как клоны, которые начали дивергировать от общего предшественника.
Сальмонеллеза плотоядных в качестве самостоятельной болезни впервые описали Р. Грин (1925), А. П. Любимова(1930), А. Д. Буров(1933), С. Я. Любашенко (1933-1935), С. А. Вербовский (1936). О возможности заражения сальмонеллезом человека от больных собак имеется сообщение Д. К. Заболотного (1927) (57).
От собак выделено 30 сероваров Salmonella. Возбудителями болезни у пушных зверей чаще всего являются: S. typhimurium, S. enteritidis, S. cholerae suis и значительно реже другие виды: S. schotmulleri, S. senftenberg, S. livingsone, S. infantis, S. newport, S. ventom и др. Специалисты ВНИИОЗ при бактериологическом исследовании патматериала от больных зверей чаще всего выделяли: S. enteritidis—60%, S. typhimurium и S. cholerae suis - 25...30% (35). Специалистами АЗВИ в звероводческих хозяйствах установлено, что в возникновении болезни ведущая роль принадлежит трем сероварианта сальмонелл: S. dublin —54%, S. cholerae suis — 34%, и S. typhimurium—11%. На долю других серовариантов приходится 1% (22).
Видовой состав сальмонелл, выделяемых у пушных зверей, меняется в зависимости от бактериальной обсемененности используемых в звероводстве кормов (11). Так, мясные субпродукты и другие ингредиенты рациона, скармливаемые зверям в сыром виде, часть могут являться причиной их заболевания и в определенной мере отражают эпизоотическую ситуацию в регионе среди других видов животных.
Общеизвестно, что для возбудителей обсуждаемого заболевания характерна высокая степень изменчивости патогенных, морфологических, культуральных и антигенных свойств. Поэтому в настоящее время распространению инфекции способствуют возрастание субклинических и латентных форм заболевания, повышенная инфицированность кормов, воды, окружающей среды, разные пути внедрения в организм, селекция и широкая циркуляция штаммов, несущих R-факторы, формирующиеся под влиянием антибиотиков и химиопрепаратов. Также установлено, что сальмонеллы являются межклеточными и факультативно внутриклеточными паразитами. Их высокая агрессивность и способность к длительному персистированию является следствием полидетерминантности факторов вирулентности, обусловленных плазмидными и хромосомными генами (99).
Штаммы сальмонелл, выделенные от различных пушных зверей, по своим культурально - морфологическим свойствам не отличаются от сероваров, выявляющихся у других животных. Источником возбудителя являются больные и переболевшие животные сальмонеллоносители, включая грызунов и диких птиц. Фактором передачи возбудителя инфекции являются инфицированные корма, вода, подстилка, предметы ухода за животными, оборудование, одежда и обувь работников. Природный резервуар S. typhimurium образуют птицы, мыши, морские свинки, овцы, коровы и свиньи (144). S. enteritidis широко распространена среди грызунов, а также птиц (124). Основу резервуара S. choleraesuis составляют свиньи, одновременно он распространен среди других видов животных. А для S dublin - КРС. Мухам отводится роль резервуара и вектора инфекции сальмонелл (133).
Аденовирусная инфекция плотоядных и ее профилактика
В ответ на антигенное раздражение в организме животных образуются агглютинины, преципитины, комплементсвязывающие антитела и антитоксины. Нарастание антител достигает максимума в первые 2—3 недели-болезни с постепенным снижением в течение 1—2 мес. Несмотря на это, иммунитет сохраняется, что свидетельствует о существенной перестройке клеточной реактивности.(113)
При сальмонеллезах ярко выражены клеточные реакции: резкая активизация фагоцитоза, образование гранул в паренхиматозных органах, гиперплазия тимуснезависимых и тимусзависимых областей лимфатических узлов, селезенки, лимфатических образований кишечника.
Антитела принимают участие в антимикробной защите и детоксикации, однако уровень антител не отражает в полной1 мере устойчивость организма, что объясняется значительной ролью фагоцитоза, в локализации и обезвреживании возбудителя и участии Т-клеток.
Макрофаги и лейкоциты оказывают влияние на течение и исход сальмонеллезов, причем активность макрофагов значительно выше, если клетки получены от иммунизированных животных.
В то же время система Т-лимфоцитов и макрофагов не может функционировать изолированно от антител. Так, устойчивость мышей к S. typhimurium обеспечивается активностью В-лимфоцитов, а также IgG и IgM. Предполагается, что у носителей сальмонеллы персистируют в макрофагах, поскольку антитела относятся к классу IgG и фагоцитоза носит незавершенный характер. Основные причины незавершенности фагоцитоза -нарушение кооперации Т- и В-лимфоцитов и макрофагов.(60)
Имеются данные о высокой активности структурных элементов иммунной системы молочной железы коров. К ним относятся жизнеспособные Т- и В- лимфоциты и макрофаги, концентрация которых к пятому дню резко снижается (49). Сообщается также, что иммуногенные свойства данного комплекса реализуются в присутствии дополнительного фактора Sap, содержащегося в макрофагах печени, селезенки и перитонеальном экссудате.
Естественным исходом большинства инфекций является формирование организмом носительства, что обеспечивает длительную персистенцию возбудителя. Следовательно, созревание иммунной системы происходит под влиянием антигенного раздражения. Такой взгляд подтверждается гипоплазией вторичных иммунных органов у гнотобионтов, ответ на реакцию у которых может носить противоположный характер.
Ведущими антигенами в иммуногенезе сальмонеллезов являются О- и К-антигены. Н-антиген существенного значения в формировании невосприимчивости не имеет.
Иммунный ответ характеризуется образованием иммуноглобулинов классов М, G и А, а также сенсибилизированных Т-популяций. Имеются указания о высокой иммуногенной активности и поверхностных антигенов сальмонелл (L-антигены), являющихся фосфолипопротеидами. Считают также, что нетоксические белки сальмонелл являются носителями протективных свойств.
При хронической и латентной формах сальмонеллеза иммунологические реакции выражены в различной степени. Бактерионосительство формируется в иммунном организме и является выражением своеобразного сосуществования макро- и микроорганизма.
В этой связи большинство исследователей считают, что у носителей угнетены иммунологические функции и неспецифические факторы защиты (бактерицидность крови, фагоцитарная реакция). Вследствие недостаточной активности гуморальных и клеточных факторов защиты элиминация бактерий замедляется, что способствует длительному носительству.(бО)
По данным Л. К. Степановой (84,85), поверхностный К-антиген сальмонелл обладает иммунизирующими свойствами и для создания иммунитета высокого напряжения, на ряду со специфическим О-антнгеном, необходимо наличие К-антигена. Показано также, что в процессе формирования инфекционного и поствакцинального иммунитета К-антиген стимулирует развитие клеточного иммунитета, усиливая переваривающую способность макрофагов.
Отмечено, что очищенные препараты К-антигена некоторых сальмонелл оказались нетоксичными и в тоже время обладали выраженными антигенными свойствами, стимулируя синтез специфических К-антител в высоких титрах (1: 1280 и выше)(60).
Резистентность плотоядных к сальмонеллам зависит от неспецифических и специфических факторов. Высокая кислотность желудочного сока уничтожает большую часть сальмонелл, попавших в организм животного с кормом или водой. При нормальной перистальтике кишечника значительная часть бактерий проходит транзитом пищеварительный тракт, не успевая колонизировать его слизистую оболочку. Нормальная микрофлора защищает органы пищеварения, синтезируя токсичные для агента жирные короткоцепочечные кислоты и бактерициды. К числу неспецифических барьеров для сальмонеллезной инфекции относится также лактоферрин и лизоцим.
Важную роль в защите организма собак от сальмонелл играет местный и системный антительные ответы, направленный в основном на О- и пильные антигены возбудителя (133).
Касаясь истории создания противосальмонеллезных препаратов, к 60-70-м годам было предложено несколько вариантов инактивированных вакцин: спиртовая, формалиновая, формолтиомерсановая, сулемовая, а также «химическая» из полных сальмонеллезных компонентов. Технологические основы их изготовления с тех пор по настоящее время не пересматривались. При сравнительном изучении наиболее эффективной и жизненной в отношении практического применения оказалась поливалентная вакцина против сальмонеллеза и колибактериоза молодняка сельскохозяйственных животных и пушных зверей, предложенная С. Я. Любашенко с соавторами в 1964г., и вакцина ОКЗ, которая применяется на практике по настоящее время.
Материалы и методы
Экспериментальные исследования проведены в период с 2002г. по 2004г. в Научно-исследовательской лаборатории инфекционной патологии и биотехнологии ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина», в Научно-производственном объединении «Нарвак» и в зверосовхозе «Раисино» Московской области.
. Материалы и методы
Материалом исследования являлись штаммы микроорганизмов, биологический материал от песцов и лабораторных животных (белые мыши и морские свинки). Для оценки состояния животных использовали общие и специальные методы клинического контроля физиологических показателей. Исследование материала от животных проводили с применением современных вирусологических, бактериологических и иммунологических методов.
В работе были использованы 3 штамма сальмонелл (S. typhimurium № 14, S. dublin № 19, S. cholerae suis № 370), полученные в коллекции микроорганизмов НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, и штамм аденовируса собак типа 2 (CAV-2 № 46), полученный из коллекции вирусов НПО «Нарвак».
Культурально - морфологические, тинкториальные и биологические свойства сальмонелл изучали общепринятыми и модифицированными методами (3, 12, 13, 15, 17, 42, 54, 106).
При изучении факторов патогенности производственных штаммов сальмонелл изучали продукцию экзо- и энтеротоксинов (прогревание и биопробы) и наличие адгезивной активности (с антиадгезивными сыворотками в реакции Д-маннозорезистетности).
Для выращивания перевиваемой культуры клеток почки собак использовалась питательная среда ДМЕМ с добавлением 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и гентамицина в концентрации 10 мкг/смЗ, а также 0,25%-ный раствор трипсина, 0,02%-ный раствор версена.
Заражение культур клеток проводили на сформированный монослой, для чего из матрасов удаляли ростовую среду, культуру клеток отмывали от сыворотки раствором Хенкса и вносили вируссодержащий материал из расчета 0,21ТЦД5 О/клетку. Через один час в культуральные матрасы добавляли поддерживающую среду (бессывороточные среды ДМЕМ) и инкубировали при температуре 37С. На 3-4 сутки при появлении выраженного цитопатического действия с поражением 80-90% монослоя, культуру клеток с вирусом замораживали при температуре -20С.
Интенсивность размножения клеток, состояние монослоя и ЦПД контролировали визуально под малым увеличением микроскопа.
Вирулентные свойства (ЛД50) всех штаммов сальмонелл определяли путем внутрибрюшинного заражения белых мышей весом 15-18 г. для S. typhimurium № 14 и S. dublin № 19 кратными дозами 4, 2, 1, 0,5 млн. микробных клеток и для S. choleraesuis № 370 400, 200, 100, 50, 25 микробных клеток по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича, из расчета по 5 мышей на каждую дозу. Одновременно мы отсаживали 2 животных для контроля заражающих штаммов. Учет гибель животных фиксировали на 7-ой день после заражения.
Для расчета величины LD50 каждой культуры использовали метод Кербера в модификации И.П Ашмарминой:
где S - отношение каждой последующей дозы к предыдущей, т.е. логарифм кратности испытанных разведений;
Dn - максимальная из испытанных доз;
Li - отношение числа животных, погибших от введенной дозы, к общему числу животных, которым эта доза была введена;
Концентрацию бактериальных клеток определяли по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Истинную концентрацию микробных клеток определяли методом контрольного высева из разведений 10"G - 10"7 бактериальных взвесей в объеме 0,1 мл, по три чашки Петри на каждое разведение, с последующим подсчетом выросших колоний.
Инфекционную активность вируса устанавливали методом титрования в перевиваемой культуре клеток почки собак на 96-луночных планшетах для культур клеток фирмы "Costar". Для этого готовили десятикратные разведения вируса от 10 1 до 10"9 на поддерживающей среде. Каждым разведением заражали по 4 лунки с культурой клеток в объеме 0,2 мл, предварительно удалив ростовую среду. В качестве контроля использовали 4 лунки с поддерживающей средой. Планшеты помещали в СОг-инкубатор при температуре 37С с содержанием в атмосфере 5% СОг- Результаты учитывали
на 3-4 сутки. Инфекционную активность аденовируса CAV-2 оценивали при микрокопировании по ЦПД и по гемадсорбционной способности зараженных клеток.
Положительными считали лунки, в которых наблюдали четко выраженное ЦПД (округление клеток, образование синцитиев, отторжение клеток от стекла). При этом в контрольных лунках клеточный монослой был не изменен.
Наработку экспериментальных серий вакцины производили в биологических пробирках, матрасах и колбах на твердых и жидких питательных средах. Глубинное культивирование в жидкой питательной среде проводили на казеиновом бульоне (триптическом гидролизате казеина) и МПБ. Для инактивирования сальмонеллезных штаммов использовали 40% формалин, разведенный физиологическим раствором в соотношении 1:1, с расчетом его концентрации в инактивируемом объеме взвеси бактерий не более 0,4% с последующей нейтрализацией. Кинетику инактивации изучали в различные сроки после добавления инактиванта методом высева на питательные среды (МПА, МПБ, агар Эндо, тиоглеколевую среду), для инактивации остаточного формальдегида использовали 19% раствор метабисульфита калия до конечной концентрации 0,1% в препарате.
