Содержание к диссертации
Введение
1 .Обзор литературы 10-35
1.1. Общие сведения о пастереллезе птиц 10-11
1.2. Характеристика возбудителя и требования к штаммам, используемым в качестве производственных 11-15
1.3. Противопастереллезные вакцины 15-17
1.4. Общие принципы технологии изготовления инактивированных бактериальных вакцин 17-27
1.5.0ценка качества инактивированных бактериальных вакцин 27-35
1.5.1. Основные требования к качеству инактивированных вакцин .27-28
1.5.2. Оценка иммуногенных свойств инактивированных вакцин 28-30
1.5.3. Корреляция уровня специфических антител в сыворотках крови животных с защитой организма от инфекции 30-32
1.5.4. Современные методы выявления и определения уровня антител 33-35
2. Собственные исследования 36-83
2.1. Материалы и методы 36-45
2.1.1. Материалы 36-38
2.1.2. Методы 38-45
2.2. Результаты исследований 45-83
2.2.1. Получение биомассы пастерелл для изготовления вакцины 45-58
2.2.1.1 .Биологические свойства штаммов Pasteurella multocida 45-50
2.2.1.2.0сновные параметры культивирования пастерелл 50-51
2.2.1.3.Инактивация P.multocida аминоэтилэтиленимином 51-58
2.2.1.3.1. Изучение активности аминоэтилэтиленимина при инактивации пастерелл 51
2.2.1.3.2. Кинетические закономерности гибели пастерелл при инактивации аминоэтилэтиленимином 52-57
2.2.1.3.3. Влияние аминоэтилэтиленимина на морфологию бактерий 57-58
2.2.2. Подбор масляного адъюванта для изготовления вакцины против пастереллеза птиц инактивированной эмульсионной 58-61
2.2.3. Изготовление опытных образцов вакцины против пастереллеза птиц и
изучение их физических и ммунобиологических свойств 61 -73
2.2.3.1 .Физические свойства вакцины 62-63
2.2.3.2.Иммунобиологические свойства вакцины 63-73
2.2.3.2.1. Безвредность и реактогенность 63-64
2.2.3.2.2. Антигенные свойства вакцины 64-66
2.2.3.2.3. Иммуногенные свойства вакцины на белых мышах 66-68
2.2.3.2.4. Иммуногенные свойства вакцины на птице 68-73
2.2.4. Изготовление экспериментальных серий вакцины против пастереллеза птиц трехвалентной инактивированной эмульсионной 73
2.2.5. Контроль качества вакцины 73-81
2.2.5.1. Оценка физических свойств, безвредности и реактогенности экспериментальных серий вакцины на белых мышах и курах 74-75
2.2.5.2. Оценка иммуногенных свойств вакцины 75-81
2.2.6. Определение активности антигенов P.multocida в составе вакцины в процессее хранения 81-83
2.2.7. Производственные испытания вакцины 83
3. Обсуждение 84-94
4. Выводы 95
5. Практические предложения 96
6. Список использованных литературных источников 97-117
Приложения 118-121
Введение к работе
Актуальность темы. Пастереллез — одна из важнейших ветеринарных проблем, возбудителем которого является бактерия Pasteurella multocida. Заболевание у птиц вызывают различные сероварианты пастерелл серогруппы А по капсульному антигену. Значительный экономический ущерб, наносимый птицеводству этой инфекцией, складывается из высокого отхода поголовья, снижения привесов и затрат на проведение профилактических мероприятий (32;190;124;81).
Как показывает мировой опыт - вакцинация во многих случаях является одним из основных средств борьбы с инфекционными болезнями животных.
В настоящее время в арсенале иммунопрофилактики пастереллеза птиц имеется целый ряд вакцинных препаратов, различающихся по составу, технологии производства, по способу применения и эффективности. Большинство из них обладает несомненными достоинствами, но имеются и недостатки (194; 160;96).
Эффективность инактивированных вакцин зависит от количества и качества антигена, природы и свойств адъюванта, от технологии изготовления препарата и способа его применения.
Важным моментом в технологии изготовления вакцин из убитых возбудителей является инактивация микроорганизмов. Для этих целей чаще всего используют формалин. Однако установлено, что формалин не является идеальным инактивантом, так как он может снижать антигенную и иммуногенную активность бактериальных антигенов. Поэтому необходим поиск новых инактивантов, которые не оказывают влияния на протективные антигены.
Одним из возможных решений этого вопроса может быть использование азиридинов.
Большинство вакцин против пастереллеза птиц выпускают в виде инактивированных формалином сорбированных и эмульсионных препаратов. Основными недостатками сорбированных вакцин являются:
необходимость многократных инъекций препарата;
относительно большие дозы вакцин.
Применяемые в настоящее время эмульсионные вакцинные препараты превосходят по иммуногенности сорбированные, однако основным препятствием их широкого использования являются:
1)высокая вязкость, затрудняющая введение при массовой обработке птицы;
2)высокая реактогенность.
Поэтому проведение работ по усовершенствованию и созданию новых инактивированных вакцин против пастереллеза птиц является актуальной задачей, имеющей научное и практическое значение.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлась разработка трехвалентной инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза птиц.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
разработать режим инактивации пастерелл аминоэти лэти л енимином;
подобрать масляный адъювант и изготовить экспериментальные образцы вакцины против пастереллеза птиц;
разработать метод оценки иммуногенной активности противопастереллезной вакцины по индексу защиты (7V);
определить иммунизирующую дозу, напряженность и продолжительность иммунитета после применения вакцины на курах.
8 Научная новизна работы. Новизна исследований состоит в том, что в результате проведенных экспериментов:
разработан режим и определены оптимальные параметры инактивации пастерелл аминоэтилэтиленимином;
количественно охарактеризована зависимость кинетики инактивации пастерелл от концентрации инактиванта;
установлена высокая антигенная и иммуногенная активность пастерелл, инактивированных аминоэтилэтиленимином в составе вакцины;
разработан метод оценки иммуногенной активности противопастереллезной вакцины по индексу защиты (N).
Практическая значимость работы.
На основании полученных результатов разработана нормативно-техническая документация по изготовлению и контролю вакцины против пастереллеза птиц, трехвалентная инактивированная эмульсионная, утвержденная заместителем директора ФГУ ВНИИЗЖ по НИР 20.07.2005г.
Апробация работы. Основные материалы исследований по диссертационной работе доложены и обсуждены на:
Международной научно-практической конференции «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов», Покров, 24-26 сентября 2003 г.
Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных», Владимир, 24-26 марта 2004г.
Всероссийской научно-практической конференции «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы», Ульяновск, 26-28 апреля 2005 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.
9 Основные положения, выносимые на защиту:
Способ инактивации пастерелл АЭЭИ.
Масляный адъювант для изготовления вакцины.
Вакцина против пастереллеза птиц, трехвалентная инактивированная эмульсионная.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121
странице и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы,
результаты исследований, обсуждение, выводы, практические
предложения. Список использованных литературных источников включает
204 наименования, в том числе 107 работ зарубежных авторов. Работа
иллюстрирована 7 рисунками и 19 таблицами. В приложении
представлены копии титульных листов документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.
Автор благодарит сотрудников кафедры микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы пищевых продуктов Ульяновской ГСХА, лаборатории экологии ГНУ ВНИИВВиМ и лаборатории микробиологии ФГУ ВНИИЗЖ за помощь в выполнении данной работы.
Общие сведения о пастереллезе птиц
Пастереллез (холера) птиц - инфекционная болезнь, протекающая с признаками септицемии. Возбудитель холеры птиц впервые был выделен в чистой культуре великим французским микробиологом Луи Пастером, в честь которого семейство назвали Pasteurellaceae (18).
Основным источником возбудителя инфекции является больная и переболевшая птица, яйцо, тушки, трупы, пастереллоносители - грызуны (крысы и мыши), больные и переболевшие животные других видов (147). Многие авторы отмечают, что пастереллы являются обитателями респираторного тракта клинически здоровых животных (32,115,133,159,173,192).
Пастереллезом болеют куры (яйценоских и мясных пород), индейки, утки, гуси, цесарки, фазаны, перепелки, голуби, а также многие виды дикой птицы.
Наиболее восприимчив к заражению молодняк: цыплята-80-120, индюшата-70-120, утята-45-50 дневного возраста (152,153). Возможно заболевание птицы и в более раннем возрасте.
В хозяйстве пастереллез может возникнуть как экзогенная инфекция при заносе возбудителя извне и как эндогенная при наличии в хозяйстве пастереллоносителей, под воздействием предрасполагающих факторов.
Воротами инфекции при пастереллезе птиц служат дыхательные пути и пищеварительный тракт. Болезнь может протекать остро, подостро и хронически. Остро протекающий пастереллез вызывают высоковирулентные штаммы P. multocida, а подострые и хронические — пастереллы с ослабленной вирулентностью (13). При остром течении заболеваемость и смертность птиц в стаде ежедневно нарастает и к 5-7 дню эти показатели могут доходить до 90%.
Для специфической профилактики пастереллеза птиц используют живые и инактивированные вакцины, которые не всегда оказываются эффективными (145).
Недостаточная эффективность вакцинных препаратов обусловлена вероятнее всего несоответствием серовариантного состава пастерелл, включенных в состав вакцины, серологическим вариантом P.multocida циркулирующим на данной территории и вызывающим развитие инфекционного процесса у птицы (1,13,25,34,43,44,81,85,86).
Материалы и методы
В работе использовали штаммы Pasteurella multocida : №115 (серовар А:1), №1231 (серовар А:3), ВК-3(серовар А:4); полученные из музея бактериальных культур , ФГУ ВГНКИ (г. Москва ), а также штаммы P.multocida №11039 (серовар А:1) и №15742 (серовар А:3), полученные из американской коллекции типовых культур (АТСС).
Питательные среды. В качестве питательных сред служили:
- мясо-пептонный бульон (МПБ);
- мясо-пептонный агар (МПА);
- бульон на основе мясного перевара по Хоттингеру (с содержанием 250-300 мг% аминного азота);
- мясо-пептонный полужидкий агар (МППА), с содержанием 0,15-0,3% бактоагара фирмы "Difco", США;
- кровяной МПА, с содержанием 5% дефибринированной крови барана;
- мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) под вазелиновым маслом;
- агар и бульон Сабуро;
- среды Гисса.
Подопытные животные. При проведении исследований использовали следующих животных:
- мыши белые нелинейные массой 16-18г, для контроля токсичности инактивированной биомассы пастерелл, безвредности и реактогенности вакцины;
- мыши белые нелинейные массой 20-22 г, для определения вирулентности пастерелл и оценки антигенных и иммуногенных свойств вакцины;
-куры: породы белый леггорн в возрасте от 25 суток до 3 месячного возраста для определения вирулентности пастерелл и оценки иммунобиологических свойств вакцины;
Краски. При изучении морфологии пастерелл использовали следующие краски:
- азур-эозин для окраски по Романовскому-Гимза;
- набор для окраски по Граму;
- набор для окраски по Бурри-Гинсу.
Растворы и реактивы. При изготовлении растворов использовали: - реактивы квалификации "ч.д.а" или "х.ч" и бидистиллированную или деминерализованную воду;
- физиологический раствор NaCl 0,85-0,9%, рН 7,2-7,4, забуференный натрием фосфорнокислым двузамещённым (ГОСТ 4172-76) и калием фосфорнокислым однозамещённым (ГОСТ 4198-75), готовили по общепринятой технологии;
- аминоэтилэтиленимин производства НЛП Биохимресурс, г.Владимир с содержанием активного вещества не менее 15%, рН доводили до 7,4-7,8 5М раствором уксусной кислоты. Рабочий (5М) раствор уксусной кислоты готовили из ледяной уксусной кислоты ГОСТ 61-75 на стерильной деминерализованной воде;
- формалин технический с содержанием формальдегида не менее
36% ГОСТ 1625-89 ,рН доводили до 7,4-7,8 5М раствором аммиака ;
масляный адъювант Фрейнда (полный), производства фирмы «SIGMA», США;
масляный адъювант ВНИИЗЖ (на основе минерального масла Marcol-52 , фирмы «ESSO», США) с эмульгатором Е-139;
- масляный адъювант «Montanide ISA-70» фирмы "Seppic", Франция, (стандарт ИСО 9001);
- системы индикаторные бумажные (СИБ), для идентификации энтеробактерий, производства Нижегородского предприятия бактерийных препаратов, Россия.
Оборудование. В работе использовали следующее оборудование:
- рН-метр «рН-121»;
- холодильник бытовой "Бирюса";
- термостат лабораторный "МІМ";
- микроскоп световой МБИ-15 "Биолам";
- аппараты для культивирования микроорганизмов АК-210, с объёмом ферментеров 10 дм3;
- пипетки автоматические «Ерреп іогі»,»Ленпипет»;
- мешалку магнитную «ММ-5»;
- коллоидную мельницу DS-51Р44;
- центрифугу проточную ОТР-102К-01;
- центрифугу «Mistral»;
- микроразмельчитель тканей РТ-2;
- весы лабораторные OHAUS;
- весы технические Т-2;
- спектрофотометр КФК-3;
- вискозиметр капиллярный ВПЖ-2;
- оптический стандарт мутности на 5 и 10 единиц, производства ГИСК им. Л.А.Тарасевича;
- посуду лабораторную стеклянную (ГОСТ 25336-82Е);
- шприцы инъекционные многократного применения ТУ-64-1-3776-83.
Обсуждение
Создание эффективных противопастереллезных вакцин остаётся одной из важных проблем ветеринарии. Во многом это объясняется несовершенством существующих технологий изготовления вакцин (24, 34, 35,48,96,118).
Для борьбы с пастереллезами млекопитающих и птиц используют, как инактивированные, так и живые вакцинные препараты (24, 34, 48, 85, 96). Живые вакцины создают достаточно напряжённый иммунитет, однако, их применение в ряде случаев сопровождается возникновением поствакцинальных осложнений, связанных с остаточной вирулентностью производственных штаммов (96, 194).
Инактивированные вакцины являются более безопасными. Однако по иммуногенности они уступают живым вакцинам. Одной из причин этого может быть повреждение инактивирующими веществами структур бактериальных клеток обеспечивающих образование специфических антител.
Недостаточная эффективность вакцинных препаратов против пастереллёза, по мнению ряда авторов, обусловлена несоответствием серовариантного состава пастерелл, включённых в состав препарата, с серологическими вариантами, участвующими в развитии инфекционного процесса (1, 13, 24, 43, 44, 85, 86).
С учетом выше изложенного, было принято решение разработать технологию изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллёза птиц, которая включала бы антигены актуальные в конкретной эпизоотической обстановке, а вакцина имела бы рассчетную концентрацию специфического антигена.
Эффективность инактивированных вакцин зависит не только от количества бактериального антигена, но и метода инактивации бактерий, который определяет его качество, а также от адьюванта, обеспечивающего гарантированную активность вакцинного препарата (23, 35, 45, 170).
Получение бактериальной биомассы является первым и одним из основных этапов в технологии изготовления вакцины (11). С целью получения максимально возможного количества биомассы пастерелл нами были определены некоторые закономерности роста при глубинном периодическом культивировании в аппаратах АК-210, трех сероваров пастерелл. В процессе культивирования P. multocida штаммов №№115, 1231 и ВК-3. Удалось сократить срок их выращивания до 8 часов по сравнению с продолжительностью культивирования (12-18 часов) в ранее разработанных технологиях. Получаемая при этом биомасса пастерелл по биологическим свойствам была стандартной, что позволило использовать ее при изучении вопросов инактивации и изготовлении антигенов для вакцинных препаратов.
Все способы инактивации микрорганизмов основываются на принципе щадящего воздействия инактиванта на структуры ответственные за их иммуногенные свойства. Наиболее широко в производстве инактивированных вакцин применяют формалин, так как он не только инактивирует бактерии, но и их токсины. Инактивацию культур микроорганизмов осуществляют формалином при температуре 37±0.5С в течение 15 суток. При этом его концентрация в препарате не превышает 0.4-0,5%. Для инактивации пастерелл используют более низкую концентрацию инактиванта в пределах 0.1-0.3%. Инактивацию проводят при температуре 16-18С в течение 48 часов. Его действие смешанное, причем скорость реакции с аминокислотами и белками превышает таковую с азотистыми основаниями ДНК. То есть белковые компоненты реагируют с формалином первыми, но он обладает высокой активностью и в отношении аминокислот, нуклеотидов и нуклеиновых кислот (54). Поэтому повреждения, вызванные таким воздействием, ведут к задержке роста и деления микробов. Этим, вероятно, объяснялось отсутствие роста пастерелл при обработке низкими концентрациями формалина.
Основной целью подбора нового инактиванта был поиск вещества специфически инактивирующего только нуклеиновую кислоту и не оказывающего влияния на протективные антигены микробных клеток. Такими монофункциональными агентами алкилирования являются этиленимин и некоторые его производные, в том числе АЭЭИ, которые взаимодействуют с группами SH-белков, но не изменяют их структуру. Поэтому можно было предположить, что в ходе инактивации бактерий соединениями этой группы антигенная структура клеток будет лучше сохраняться. Кроме того, вещества этой группы обладают быстрым ингибирующим действием на нуклеиновые кислоты, что позволяет получать высокоиммуногенные бактериальные антигены.
В последние годы появились сообщения об использовании азиридинов в производстве инактивированных вирусных вакцин. Эта группа препаратов быстро инактивирует вирус, легко нейтрализуется тиосульфатом натрия и менее других инактивантов влияет на иммуногенные свойства микроорганизмов. Однако большинство веществ азиридинового ряда высоко токсичны для человека и животных. Но аминоэтилэтиленимин является малоопасным в обращении. Этим, во многом, и объясняется перспективность его использования при разработке технологий изготовления инактивированных вакцин.
![Разработка биотехнологии вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в производственной упаковке (ампуле) [Электронный ресурс]](/i/i/4612/199276.png "Разработка биотехнологии вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в производственной упаковке (ампуле) [Электронный ресурс] Ефременко Анна Александровна")