Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Гемолизины бактерий 13
1.2. Роль ионов железа в продукции гемолизинов 15
1.3. Гемолитическая активность холерных вибрионов 23
1.4. Влияние условий культивирования на продукцию гемолизина холерных вибрионов 26
1.5. Генетическое детерминирование синтеза гемолизина 27
1.6. Гемолизин холерных вибрионов. Получение и свойства 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы 35
2.1. Бактериальные штаммы 35
2.2. Питательные среды 43
2.3. Методы изучения гемолитической активности 44
2.4. Оценка биологической активности супернатантов холерных вибрионов 46
2.4.1. Использование монослойных перевиваемых клеточных культур 46
2.4.2. Использование модели кроликов-сосунков 47
2.4.3. Использование кожной пробы Крейга 48
2.5 Получение и характеристика гемолизина холерных вибрионов 48
2.5.1. Получение гемолизина холерных вибрионов 48
2.5.2. Электрофорез в полиакриламидном геле 49
2.5.3 Количественное определение белка 49
2.6. Получение иммунных сывороток к препаратам гемолизина холерных вибрионов 50
2.7. Изучение препаратов гемолизина в иммуноблотинге 50
2.8. Диффузная иммунно-преципитация по Ouchterlony 51
2.9. Статистическая обработка 51
Собственные исследования.
ГЛАВА 3. Характеристика гемолитической активности холерных вибрионов различных серогрупп и токсигенности 52
3.1. Изучение гемолитической активности токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы 55
3.2. Изучение влияния условий культивирования на интенсивность гемолитической активности токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы 64
ГЛАВА 4. Характеристика биологической активности тосигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов, культивируемых на различных питательных средах 76
4.1. Тестирование супернатантов токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов, культивируемых на различных питательных средах, на модели перевиваемых клеточных культур 76
4.2. Влияние среды культивирования на экспрессию биологически активных факторов холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы на модели кишечника кроликов-сосунков 80
ГЛАВА 5. Получение и сравнительная характеристика гемолизина токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов различных серогрупп 86
5.1. Получение и характеристика препаратов гемолизина холерных вибрионов эльтор и 0139 серогруппы, выращенных в условиях дефицита железа 86
5.2. Изучение спектра гемолитической активности препаратов гемолизина токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов различных серогрупп 97
5.3. Получение сывороток и изучение серологической специфичности препаратов гемолизина токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов 99
Заключение 105
Выводы 111
Литература 113
- Роль ионов железа в продукции гемолизинов
- Оценка биологической активности супернатантов холерных вибрионов
- Изучение гемолитической активности токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы
- Тестирование супернатантов токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов, культивируемых на различных питательных средах, на модели перевиваемых клеточных культур
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Выделенные впервые от человека в 1905 году вибрионы eltor отличались от возбудителя классической холеры способностью лизировать эритроциты различных видов животных и были отнесены к непатогенным. Разработанный в 1914 Greig метод обнаружения лизиса холерными вибрионами эритроцитов барана в питательном бульоне стал основным тестом дифференциации классических холерных вибрионов от вибрионов eltor, не имеющих эпидемического распространения и вызывающих в Юго-восточной Азии заболевания, отнесенные по мнению Генеральной Ассамблеей ВОЗ 1958 года к «нехолерным» (Коробкова Е.И., 1959).
В 1962 году был описан негемолитичный вариант вибрионов eltor (Vibrio eltor var. Anliaemolyticus) как возбудитель холеры в Ириане на западе Новой Гвинеи (De Moor, 1963, Gallut, 1974).. Именно он получил впоследствии пандемическое распространение и был признан новым возбудителем эпидемической холеры. С появлением негемолитичного варианта вибрионов eltor тест гемолитической активности утратил свое значение в дифференциации холерных вибрионов, двух биоваров. Однако, сведения о широком распространении гемолитичных вибрионов eltor в водоемах благополучных по холере территорий обострили обсуждавшийся ранее (Бичуль К.Г., Либинзон А.Е., Сомова А.Г. и др., 1968) вопрос о существовании патогенных и непатогенных вибрионов eltor, и в 1971 году Адамов А.К. и Быстрый И.Ф. предложили тест гемолитической активности в сочетании с отношением вибрионов к холерным диагностическим фагам для оценки вирулентности вибрионов eltor.
Рядом авторов (Мишанькин Б.Н. с соавт.; 1982; Семиотрочев В.Л., 1990г.) было высказано мнение о взаимодействии гемолизина и холерного токсина на уровне их экспрессии. Позднее была предложена формула эпидемического варианта холерных вибрионов - ctx+Hly" (Подосинникова
7 Л.С, 1993г. и др.). В связи с этим определение гемолитической активности в настоящее время используется в качестве ориентировочного теста для оценки эпидемической значимости холерных вибрионов.
Однако, среди нетоксигенных холерных вибрионов, выделямых из водоемов России, нередко (в 3-10%) обнаруживают штаммы, негемолитичные по фенотипу (Кюрегян А.А., Иванова СМ., Мазрухо Б.Л. и др., 2002). В то же время на эндемичной по холере территории Мексиканского залива (США) из клинического материала и водоема выделен гемолитичный токсигенный вариант вибриона эльтор (Barret Т.J., Blake P.А., 1984).
Изучение препаратов гемолизина выделенных из разных штаммов холерных вибрионов (J.A.Watanabe, W.F.Verwey 1966), Honda Т., Finkelstein R.,1979; Романова Л.В., Родионова А.В.,1983; Yamomoto К. et al. (1986) показало, что авторы единодушны лишь в том, что полученные ими гемолизины термолабильны и лизируют эритроциты различных видов животных, а молекулярная масса колеблется от 20 до 80 кДа (Телесманич Н.Р.,1996).
Есть мнение (В.Л. Семиотрочев с соавт., 1988 и др.) о выработке холерными вибрионами гемолизинов двух типов (I и II), различающихся по спектру литической активности эритроцитов разных видов животных, и двух подтипов (а и (З) с различной скоростью синтеза (2 - 24 часа). По данным Осауленко О.В. (1984), токсигенные штаммы способны синтезировать гемолизин II типа, нетоксигенные - гемолизин I типа подтипа р. В.Л. Семиотрочев (1990) предложил рассматривать гемолизин I типа подтипа Р, холерных вибрионов нетоксигенных штаммов, как альтернативный холерогену токсин, обусловливающий энтеропатогенное действие. Однако известно, что далеко не все гемолитичные нетоксигенные штаммы холерных вибрионов, которые, по мнению приведённых выше авторов, должны, как нетоксигенные холерные вибрионы, продуцировать гемолизин I р, обладают энтеропатогенной активностью.
Известно, что холерные вибрионы, независимо от их серогруппы, биовара и токсигенности, имеют в своем геноме локус, гены которого кодируют синтез гемолизина (Manning Р.А. et al., 1984; Goldberg S.L., 1985; Власов В.П. с соавт., 1992 и др.). Обнаружен он и у нового варианта возбудителя холеры - холерных вибрионов 0139 серогруппы (А.В. Осин с соавт., 2000г.). Клонирование этого участка хромосомы выявило в составе локуса наличие структурного и регуляторного генов.
Рядом авторов описана зависимость экспрессии гемолитической активности от условий культивирования, температуры и состава питательных сред, (Honda Т et al., 1979; Тафельштейн Э.Е., Блинова Л.С, 1979). Stoebner J.B. et al. (1986) обнаружил, что синтез гемолизина холерными вибрионами стимулирует отсутствие ионов железа в среде культивирования. Однако, проблема различий в экспрессии гемолитической активности холерными вибрионами токсигенных и нетоксигенных штаммов остается невыясненной. Актуальность ее очевидна в связи с использованием теста на обнаружение гемолитической активности при эпидемиологическом надзоре за холерой в качестве наиболее простого и доступного способа ориентировочной оценки эпидемической значимости штаммов.
Цель работы
Сравнительная характеристика гемолитической активности ctx+ и ctx" штаммов холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы в различных условиях культивирования и выявление особенностей ее экспрессии.
9 Основные задачи исследования:
Изучение литической активности супернатантов бульонных культур токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы по отношению к эритроцитам различных видов животных.
Изучение проявления гемолитических свойств холерных вибрионов в различных условиях культивирования, в том числе в условиях дефицита железа.
Тестирование супернатантов токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов, полученных в различных условиях культивирования, на модели перевиваемых клеточных культур.
Получение и сравнительная характеристика гемолизина токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов, выращенных в условиях дефицита железа.
Научная новизна и теоретическая значимость.
Показано, что экспрессия гемолитических свойств ctx" штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы менее выражена и реже выявляется, чем у аналогичных штаммов вибрионов эльтор. Обнаружены сезонные колебания в проявлении гемолитической активности этих штаммов и более выраженное проявление ее в весенний и осенний периоды года.
Установлено, что ctx+ штаммы холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы в триптоновой питательной среде без FeCb продуцируют гемолизин, обладающий одинаковым спектром литической активности по отношению к эритроцитам различных видов животных, биологическим и серологическим сходством с гемолизином ctx" штаммов.
Выявлена зависимость синтеза гемолизина ctx+ штаммами холерных вибрионов от концентрации FeCb в среде культивирования, что свидетельствует о индуцибельности экспрессии гемолитической активности
10 у токсигенных штаммов и коррелирует с представлениями об индуцибельности клеточных систем поглощения железа.
В супернатантах ctx штаммов холерных вибрионов, выращенных в триптоновой питательной среде без FeCb, способствующей активной продукции ими гемолизина, наряду с последним, обнаружено присутствие в незначительном количестве холерного токсина. Показано, что культивирование ctx штаммов холерных вибрионов в условиях, альтернативных для оптимальной продукции холерного токсина или гемолизина, определяет при заражении кроликов-сосунков характер патологического процесса, обеспечивая соответственно проявление холерогенного или энтеропатогенного синдромов.
Данные о повышении ctx штаммами холерных вибрионов синтеза гемолизина и понижении концентрации холерного токсина в условиях дефицита железа (FeCb) являются основанием для обсуждения механизма координированной регуляции синтеза токигенными штаммами холерогена и гемолизина в зависимости от условий среды обитания.
Научно-практическая ценность работы.
Впервые получены и охарактеризованы препараты гемолизинов, продуцируемых ctx+ штаммами холерных вибрионов eltor и 0139 t серогруппы. Показана идентичность серологических свойств и спектра литической активности гемолизинов ctx и ctx" штаммов холерных вибрионов, культивируемых в триптоновой питательной среде без FeCl3.
Выявлено ингибирующее действие FeCb на экспрессию, в отличие от ctx" штаммов, гемолитической активности ctx+ штаммов холерных вибрионов. Показано различие в концентрациях FeCb в питательной среде, ингибирующих экспрессию гемолитической активности токсигенных штаммов холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы.
Полученные результаты могут быть использованы в дальнейшем совершенствовании теста определения гемолитической активности для оценки эпидемической значимости штаммов с лимитированием питательной среды для пробы Грейга по содержанию FeCb, что будет способствовать ее стандартизации и повышению воспроизводимости результатов.
Утверждены Ученым Советом РПЧИ (протокол № 6 от 5 июня 2000г.) методические рекомендации, «Дифференциация токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы по чувствительности к нормальной человеческой сыворотке», где для оценки изменения состава популяции холерных вибрионов под влиянием нормальной человеческой сыворотки использовали определение гемолитической активности холерных вибрионов на плотных питательных средах. Результаты оценки спектра литической активности гемолизина холерных вибрионов отражены в методических рекомендациях «Paramecium caudatum - как модель in vitro для изучения биологической активности токсических веществ различной природы», утвержденных Ученым Советом РПЧИ (протокол № 9 от 18 октября 2001 г).
Материалы исследований доложены на институтских научных конференциях и конкурсе научных работ молодых ученых Ростовского-на-Дону государственного научно-исследовательского противочумного института в 1998, 2000, 2001, 2002 годах. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе и в центральной печати.
Положения, выносимые на защиту.
1. Способность холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы лизировать эритроциты барана и других видов животных обусловлена уровнем синтеза секретируемого в окружающую среду гемолизина, в связи с чем низкий уровень синтеза гемолизина холерными вибрионами стх штаммов, в отличие от ctx", в общепринятых условиях культивирования
12 обеспечивают лизис только эритроцитов морской свинки, чувствительных к малым количествам гемолизина.
Экспрессия гемолитической активности токсигенными штаммами холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы зависит от условий их культивирования. Дефицит FeCb в питательной среде индуцирует продукцию ctx холерными вибрионами eltor и 0139 серогруппы гемолизина, лизирующего эритроциты барана, как и гемолизин ctx" штаммов обеих серогрупп.
Препараты гемолизина ctx и ctx" штаммов холерных вибрионов эльтор и вибрионов 0139 серогруппы, полученные в условиях культивирования в питательной среде без FeCb, обладают биологическим и серологическим сходством и одинаковым спектром литической активности по отношению к эритроцитам различных видов животных.
При культивировании в условиях дефицита FeCb в супернатантах ctx штаммов холерных вибрионов эльтор и 0139 серогруппы одновременно с гемолизином обнаружено присутствие холерного токсина в незначительном количестве.
Публикации: по теме диссертации опубликовано \5 научных работ.
Структура работы: диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающих 185 цитируемых работ, в том числе 112 - зарубежных. Общий объем диссертации составляет 133 страницы. Текст иллюстрирован 20 таблицами и 8 рисунками.
Роль ионов железа в продукции гемолизинов
Способность к образованию гемолизина широко распространена среди микроорганизмов, для части из которых он является основным токсическим фактором, как, например, для патогенной кишечной палочки, вызывающей диарею у детей (Далин М.В., Фиш Н.Г., 1980; Muller D., Hughes С, Goebel W., 1983).
Одни микроорганизмы активно секретируют гемолизин в среду культивирования, в то время как у других он накапливается в виде связанного с клеткой предшественника, а в жидкую фазу попадает лишь после аутолиза клетки (Coffey J.A., Harris R.L., Rutlend MX. et al, 1986).
Гемолизины большинства микроорганизмов, таких как Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrofila, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherihia coli, представляют собой термолабильные белки, способные лизировать эритроциты человека, кролика, барана, морской свинки, козы и других видов животных. При парентеральном введении лабораторным животным они вызывают развитие некроза и отека на месте инъекции (Macrina F.L., 1985), при внутривенном введении оказывают летальное действие на подопытных животных (Spreng S., Dietrich G., Goebel W., Genschev I., 1999), на культурах перевиваемых клеток - выраженное цитотоксическое действие (Cavaleri S.J.,Snidr I.S., 1982).
Corynebacterium diphtheria, Clostridium perfringens продуцируют термостабильные гемолизины (Далин М.В., Фиш Н.Г., 1980).
Известны микроорганизмы, продуцирующие несколько гемолизинов. К их числу относится патогенная кишечная палочка, у которой описано более пяти гемолизинов из них подробно изучены два: а и (3: а - гемолизин непрочно связан с микробной клеткой и выделяется в культуральную жидкость в период логарифмической фазы роста кишечной палочки на жидких питательных средах. Он термолабилен и после 10-15 минутного воздействия 56 С или пяти минутного - 60С утрачивает литическую активность. Этот гемолизин активен в отношении эритроцитов человека, лошади, быка, барана, свиньи и цыпленка.
Р - гемолизин кишечной палочки связан со стромой микробной клетки и в культуральном фильтрате проявляется только в результате аутолиза биомассы.
По субстратной специфичности р - гемолизин не отличается от а -гемолизина, но серологически ему не идентичен (Далин М.В., Фиш Н.Г., 1980, Cavallieri S.J., Snider I.S., 1982; Spreng S., Dietrich G., Goebel W., 1999).
Показана плазмидная природа Ыу-гена E.coli, кодирующего синтез термолабильного гемолизина, и возможность его межвидовой передачи (Власов В.П., Михась Н.К., Монахова Е.В. и др., 1991).
Гемолитической активностью обладают многие представители рода Vibrio, которые лизируют эритроциты различных видов животных: кролика, цыпленка, морской свинки, овцы и лошади (Guhathakurta В., 1999; Majtan V. et al., 1984; Оо R.N. et al., 1993; Воронежская Л.Г., 1994).
Известна продукция высокоактивного гемолизина представителями вида V.mimicus (Miyake М., Honda Т., Miwatani, 1987; Nishibuchi М., Khaeomanel-iam V., Honda T. Et al., 1990), V.metschnikovii (Miyake M. et al., 1988, 1989), V.damsella, V.fluvialis (Wall V.W., Kreger A.S., Richardson S., 1984; Rahim Z., Aziz K.M., 1996) и V.vulnificus (Kreger A.S., Lockwod R., 1981; Massad D., Simpson L.M., Oliver J.D., 1988)
Большое количество работ посвящено исследованию гемолизина V.parahaemolyticus и его детерминирующих генов (Honda Т., Nishibuchi М., Miwatani Т.,1986, Honda Т., Taga S., Takeda, 1976, Nischibuchi М., Honda Т., Miwatani T.,et al.,1987, Takahasi A.,Sato Y. et al., 2000).
Свежевыделенные культуры V.parahaemolyticus лизируют эритроциты барана на агаре с кровью. Некоторые из них сохраняют эту способность и при пересеве на кровяной агар с эритроцитами человека. Установлено, что эти микроорганизмы продуцируют термостабильные и термолабильные гемолизины, кодируемые различными генами (Teniguchi Н., Ohta Н., Ogana М., 1985, Honda Т., Finkelshtein R.A., 1979, Honda Т., Su S.C., Lee C.Y.,1997).
Известна способность галофильных вибрионов V.hollisae продуцировать термолабильный гемолизин, сходный по биологическим и иммунологическим свойствам с термостабильным гемолизином V.parahaemoliticus, но отличающийся по чувствительности к температуре (Nishibuchi М., Doke S., Toisumi S.,et al., 1988; Yoh M., Honda Т., Miwatani Т., 1988).
Сравнительный анализ генов гемолизинов V.inirnicus, V.hollisae, V.parahaemolyticus, V.cholerae non 01 выявил гомологию их нуклеотидных последовательностей. При этом было показано, что последовательности, фланкирующие эти гены, несходны (Nishibuchi М., Khaeomanel-iam Y., Honda Т. et al., 1990; Rahman M.M., Mioyshi S., Tomochika R., 1997; Nishibuchi M., Kaper J.B., 1995; Yoh M., Honda Т., Miwatani Т., 1986,West P.A.,1989).
Есть сведения о роли ионов железа в синтезе гемолизинов у отдельных бактерий: E.coli, Shigella dysentheriae, Serratia marcescens, Vibrio cholerae и других (Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И., 1997).
Оценка биологической активности супернатантов холерных вибрионов
Культуры холерных вибрионов выращивали в триптоновой среде без FeCb и среде AKI в стационарных условиях при 37 С в течение 22 - 24 часов. Бесклеточные культуральные жидкости (супернатанты) получали центрифугированием в течение 50 минут при 6 тыс. об/мин. с последующим обеззараживанием гентамицином в дозе 4 мкг/мл в течение 24 часов.
Супернатанты тестировали в перевиваемых культурах клеток: СНО-К1 (овальные клетки китайского хомячка), Vero (клетки почки зеленой мартышки) и Нер-2 (опухолевые клетки человека) с регистрацией цитотонического (удлинение клеток), цитотоксического (деструкция клеток) и протеолитического (округление клеток) действия (Сальникова О.И., 1994; Сальникова О.И., Лобанов В.В., Шиманюк Н.Я., 1991; Сальникова О.И., Подосинникова Л.С, Воронежская Л.Г. и др., 1993). Специфичность реакций подтверждали нейтрализацией активности супернатантов с помощью кроличьих иммунных сывороток, полученных к холерному токсину V.cholerae 01 и гемолизину V.cholerae поп 01 Р-11702. Нейтрализацию специфической активности проводили инкубированием супернатантов с изучаемой сывороткой в разведении 1:100 в течение 60 минут при 37 С. Учет результатов взаимодействия супернатантов с перевиваемыми клетками производили с помощью светового микроскопа, принимая за положительный изменение морфологии 50% клеточной популяции в опытных лунках.
Для определения патогенности холерных вибрионов использовали метод внутрикишечного заражения по Dutta N., Habbu М. (1955), согласно Методическим рекомендациям по определению вирулентности холерных вибрионов на модели кроликов-сосунков (1979). Изучаемые штаммы засевали в бульон Мартена (рН 7,6 - 7,8) и выращивали при 37 С в течение 4 часов, после чего делали высев на влажную пластинку агара Мартена (рН 7,6) в чашке Петри. Посевы выращивали при 20-22 С в течение 18 часов. Для заражения использовали взвесь холерных вибрионов в 0,85% растворе NaCl. В каждой серии опыта заражали не менее 2-х кроликов в возрасте 9-12 дней весом 120-160 г. (привязывали к станку для фиксации животных брюшком вверх, выстригали операционное поле, смазывали его раствором йода и давали наркоз (0,2 - 0,3 мл 1% тиопентала натрия внутримышечно). Животное накрывали стерильным полотенцем с разрезом по середине. Скальпелем делали разрез по средней линии живота длиной до 1 см, делали небольшой разрез брюшной стенки и извлекали петлю тонкого кишечника, которую фиксировали с помощью пинцетов. В просвет кишечника шприцем о вводили взвесь холерных вибрионов в дозе п 10 м.кл. в объеме 0,2 мл. Петлю погружали в брюшную полость. На брюшную стенку накладывали непрерывный шов из кетгута, кожу зашивали шелком. За оперированными животными наблюдали в течении 48 часов. Всех павших или забитых животных вскрывали и производили посев содержимого из органов на щелочной агар.
Пробу ставили в соответствии с методикой, модифицированной Помухиной О.И. (1989). Использовали взрослых серых кроликов со здоровой кожей. Накануне опыта кожу на спине и боках животных тщательно выбривали.
Исследуемый материал вводили внутрикожно по 0,1 мл . Для контроля использовали физиологический раствор. Результаты учитывали через 3 часа и 24 часа после введения материала.
После этого кроликам внутривенно вводили 2% раствор синьки Эванса из расчета 1 мл на 1 кг веса животного и через 3 часа учитывали результаты.
Дермонекротическую активность определяли по наличию зоны некроза. Опыт повторяли не менее 2-3 раз.
Изучение гемолитической активности токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов eltor и 0139 серогруппы
Известно, что гемолитическую активность холерных вибрионов оценивают по способности суточной бульонной культуры вибрионов лизировать эритроциты барана через 2 и 24 часа. В то же время многочисленные наблюдения свидетельствуют о том, что «негемолитичные» по отношению к эритроцитам барана в данной пробе холерные вибрионы лизируют в тех же условиях эритроциты других видов животных. Семиотрочев В.Л. с соавт. (1988) высказали мнение о продукции холерными вибрионами гемолизинов двух типов (I и II), различающихся по спектру литической активности эритроцитов, и двух их подтипов (а и Р) с различной скоростью синтеза и, следовательно, сроков обнаружения (2 и 24 часа). По мнению Осауленко О.В. с соавт. (1984), токсигенные штаммы способны синтезировать гемолизины II типа, не лизирующие эритроциты барана, нетоксигенные - гемолизины I типа, лизирующие их.
Однако, описаны факты приобретения токсигенными штаммами холерных вибрионов способности лизировать эритроциты барана в результате хранения на питательных средах (De Moor, 1949, 1963). Общеизвестно также, что часть популяции токсигенных штаммов холерных вибрионов лизирует эритроциты барана при выращивании на агаре с 1-2% этих эритроцитов (Gal-lut J., 1974; Hood M.A., 1983 и др.).
В то же время есть сведения о том, что суточные бульонные культуры отдельных нетоксигенных штаммов холерных вибрионов не лизируют эритроциты барана. В связи с этим была предпринята попытка одновременного сравнительного изучения способности токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов лизировать через 2 и 24 часа эритроциты различных видов животных.
В работе использовано 20 ctx" и 16 ctx штаммов V.eltor и 20 ctx" и 22 ctx штамма V.cholerae 0139 серогруппы, выделенных от больных холерой и из воды поверхностных водоемов на благополучных по холере территориях. При изучении способности суточных бульонных культур лизировать эритроциты барана, морской свинки и кролика выявлено, что 13 из 20 ctx" штаммов холерных вибрионов eltor лизировали эритроциты барана через 2 часа и еще 4 штамма через 24 часа (табл. 4). Эти же штаммы ctx" холерных вибрионов лизировали эритроциты морской свинки с той же скоростью: 13 из 20 - через 2 часа и 4 - через 24 часа. Эритроциты кролика эти же 17 штаммов лизировали в течении двух часов.
Бульонные культуры трех ctx" штаммов V.eltor (17479, 17480 и 2399) не лизировали эритроциты ни барана, ни морской свинки, ни кролика (табл. 4, 5).
Суточные бульонные культуры ctx штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы не вызывали лизиса эритроцитов барана, но четыре штамма через 2 часа лизировали эритроциты морской свинки и кролика, а 7 - через 24 часа эритроциты морской свинки и 5 - кролика.
В отличии от холерных вибрионов eltor гемолитическая активность ctx" штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы была менее выраженной. Вибрионы только одного из 20 ctx" штаммов лизировали эритроциты барана через 24 часа (табл. 4), но 4 штамма лизировали эритроциты морской свинки и кролика через 2 часа и еще четыре - через 24 часа.
Бульонные культуры холерных вибрионов ctx+ штаммов 0139 серогруппы, так же как ctx+ штаммы вибрионов eltor не лизировали эритроциты барана, но вызывали лизис эритроцитов морской свинки (7 из 22 через 2 часа и 11 - через 24 часа) и кролика (5 из 22 через 2 часа и 9 - через 24 часа) (табл. 4).
При исследовании гемолитической активности токсигенных и нетокси-генных штаммов 01 и 0139 серогруппы на агаровых пластинках, содержащих 0.5; 1.0 и 2.0% эритроцитов барана, было установлено, что взятые для исследования отдельные ctx штаммы V.eltor диссоциировали на вторые сутки на Ну и Hly" варианты по отношению к этим эритроцитам, независимо от концентрации последних.
Процент гемолитичных клонов в популяции 4 из 10 ctx штаммов V.eltor колебался от 13 до 31%. Ширина зоны лизиса вокруг колоний на агаре с 2 % эритроцитов барана составила от 1 до 3 мм. У 6 ctx+ штаммов V.eltor (5879, 3119, 17472, 14307, 17549 и 2636) гемолитичных клонов на уровне 300 клеток не обнаружили (табл. 6).
Тестирование супернатантов токсигенных и нетоксигенных штаммов холерных вибрионов, культивируемых на различных питательных средах, на модели перевиваемых клеточных культур
Ранее было показано, что дефицит железа в среде культивирования не только усиливал гемолитическую активность по отношению к эритроцитам барана у ctx" штаммов, независимо от их серогруппы, но и способствовал проявлению гемолитичных свойств ctx+ холерными вибрионами 01 и 0139 серог-рупп, гемолизнегативными в пробе Грейга на общепринятых питательных средах. При инкубации в триптоновой среде без FeCl3 они лизировали эритроциты барана, так же как и ctx" штаммы.
С целью изучения и сравнительной характеристики гемолизина из супер-натантов ctx и ctx" штаммов Ol (eltor) и 0139 серогрупп холерных вибрионов, выращенных в триптоновой среде, были получены и частично очищены препараты с литической активностью по отношению к эритроцитам барана.
Впервые гемолизин в очищенном виде был выделен в 1966 году J.A.Watanabe и W.F.Verwey. Он представлял собой термолабильной биополимер, 5% белка, содержащий 95% липидов и следы углеводов. Молекулярная масса полученных впоследствии различными исследователями гемолизинов из гемолитичных штаммов холерных вибрионов колебалась от 20 до 80 кДа. Было показано, что гемолизины холерных вибрионов эльтор и не 01, биологически и иммунологически неразличимы (Yamamoto К., Takeda J. et al, 1983; Yamamoto К., Ichinose X. et al., 1986 и др.). Однако о продукции гемолизинов ctx+ штаммами холерных вибрионов и их характеристике в литературе сведений нет.
Stoebner J.A. и Payne S.M., в 1986 году обнаружившие влияние недостаточного содержания железа в культуральной жидкости на усиление синтеза гемолизина холерными вибрионами, также изучали в разной степени гемолитичные штаммы и не указали их токсигенных свойств.
Известно, что необходимость железа для клетки обусловлена его активным участием в реакциях переноса электронов. Оно входит в состав гемогрупп кислородсодержащих белков: гемоглобина и миоглобина - митохондриального белка цитохрома С (Мецлер Д, 1980; Neiland J.B., 1981).
Stoebner J.A. и Payne S.M. (1988) высказали мнение, что в условиях недостаточного содержания железа в организме хозяина гемолизин холерных вибрионов оказывает цитотоксическое действие на клетки кишечного эпителия, освобождая внутрикишечное железо, которое захватывается вибриобактином и переносится в клетки холерных вибрионов.
В связи с выявлением в наших исследованиях способности супернатантов ctx штаммов холерных вибрионов лизировать, как и ctx" холерные вибрионы, эритроциты барана для дальнейшего изучения гемолитической активности токсигенных и нетоксигенных холерных вибрионов из супернатантов ctx и ctx" штаммов холерных вибрионов, выращенных в среде без FeCb нами были получены и частично очищены препараты с литической активностью к эритроцитам барана.
Для получения препаратов были использованы 2 ctx и 2 ctx" штамма V.eltor и V.cholerae 0139 серогруппы. Результаты оценки их гемолитической активности в пробе Грейга с эритроцитами барана в бульоне Мартена (рН 7,6), триптоновой среде без FeCb (рН 8,5) и среде AKI (рН 7,4), усиливающей синтез холерного токсина, приведены в таблице 18.
Гемолитическая активность ctx" штаммов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп выявилась во всех трех использованных питательных средах, однако при культивировании в среде AKI была менее выраженной.
Штаммы ctx+ холерных вибрионов обеих серогрупп не лизировали эритроциты барана при культивировании в бульоне Мартена и среде AKI, но были гемолитичны при выращивании в триптоновой среде.
С целью получения гемолизина отобранные штаммы культивировали в триптоновой среде с пониженным содержанием железа в течении 48 часов при температуре 37С в стационарных условиях. Супернатанты штаммов освобождали от клеток центрифугированием при 6 тыс. об./мин. в течении 50 минут.
Бесклеточные супернатанты насыщали до 50% сульфатом аммония, выдерживали при 4С в течении 24 часов и центрифугировали при 6 тыс. об./мин. в течении 50 минут. Полученный осадок ресуспензировали в Tris-буфере (рН 7,5) и диализовали против этого же буфера при 4С до полного удаления сульфата аммония.
Методом Lowry (1951) в препаратах обнаружен белок, содержание которого колебалось у ctx+ штаммов от 0,68 до 3,7 мг/мл, у ctx" штаммов находилось в пределах 7,5 - 8 мг/мл. Для серологической идентификации белка в полученных препаратах, предположительно обладающего гемолитической активностью была использована полученная нами ранее антигемолитическая сыворотка к гемолизину V.cholerae поп 01 Р-11702, любезно предоставленного нам профессором Б.Н. Мишанькиным. Указанная сыворотка нейтрализовала гемолитическую активность гомологичного штамма V. cholerae поп 01 Р-11702. В нативном состоянии она образовывала с ним и препаратом гемолизина, полученного из этого штамма, четкую линию преципитации (рис.1). После адсорбции убитой бактериальной массой указанного штамма, сыворотка образовывала линию преципитации только с препаратом гемолизина (рис. 2). В электрофорезе во всех препаратах выявлен белок с Мм 63-65 к Да (рис.3).
