Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ. Актуальность проблемы 7
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Липазы. Классификация, распространение липаз в природе 17
Механизм действия, субстратная специфичность и некоторые физико-химические свойства липаз микроорганизмов 20
Методические подходы изучения липазной активности микроорганизмов 24
1.4. Гемолитическая и липазная активность холерных вибрионов 26
СОБСТЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Микроорганизмы, используемые в работе 37
Коммерческие препараты, химические реактивы 43
Питательные среды 43
Сыворотки 44
Методы
2.5.1. Бактериологические методы 44
Метод определения гемолитической активности 45
Метод выявления триациглицероллипазнои и гидролазнои активностей 46
2.5.2. Серологические методы
Реакция агглютинации 46
Реакция агломерации объёмная (РАО) 47
2.6. Получение иммунных сывороток к липазе Pseuclomonas spp.,
их характеристика 48
Количественное определение белка в сыворотках и иммуноглобулинах 50,
Диффузная иммуно-преципитация по Оухтерлони 50
Метод постановки иммуноблотинга ....і". 50
Метод выделения иммуноглобулинов из сывороток 51
Конструирование иммуноглобулиновых диагностических
антилипазных препаратов 51
2.7. Статистическая обработка результатов 52
ГЛАВА 3 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИММУННЫХ СЫВОРОТОК К ЛИПАЗЕ Pseudomonas spp., ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНОГО АНТИЛИПАЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА
ПРИ ИЗУЧЕНИИ ПРОДУКЦИИ ЛИПАЗЫ
У ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ В РАО 53
Получение иммунных сывороток к липазе Pseudomonas spp., схемы иммунизации животных 53
Характеристика сывороток по белку 54
Изучение специфичности сывороток в реакции преципитации 56
Изучение чувствительности сывороток в иммуноблотинге 58
3.5. Изучение чувствительности диагностических препаратов,
сконструированных на основе иммуноглобулинов
к липазе Pseudomonas spp 60
3.6. Лиофилизация диагностических препаратов 62
ГЛАВА 4 ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБНОСТИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ
РАЗНЫХ БИОВАРОВ И СЕРОГРУПП ПРОДУЦИРОВАТЬ ЛИПАЗУ,
ВЫЯВЛЯЕМУЮ В РЕАКЦИИ АГЛОМЕРАЦИИ (РАО) 64
4.1. Выявление продукции липазы у штаммов холерных вибрионов
01 серогруппы биовара эльтор 65
Изучение способности к продукции липазы у штаммов холерных вибрионов классического биовара 76
Выявление продукции липазы у штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы различного происхождения 81
4.4. Выявление липазы у штаммов холерных вибрионов не ОІ/не 0139
серогрупп с различными генетическими характеристиками 84
ГЛАВА 5 ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА
РАО С АНТИЛИПАЗНЫМ ДИАГНОСТИКУМОМ НА ЭТАПЕ ВЫДЕ
ЛЕНИЯ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ 97
Зависимость продукции липазы холерными вибрионами от условий культивирования штаммов 98
Определение специфичности метода РАО с использованием имму-ноглобулинового антилипазного диагностикума 107
5.2.1 Выявление липазы, гомологичной липазе Pseudomonas spp. и холер
ных вибрионов эльтор, у представителей рода Vibrio 107
5.2.2. Выявление липазы, гомологичной липазе Pseudomonas spp. и хо
лерных вибрионов эльтор, у представителей семейства
Enterobacteriaceae 112
5.3. Изучение возможности применения метода РАО с полимерным им-
муноглобулиновым антилипазным диагностикумом в схеме иден
тификации холерных вибрионов 117
ГЛАВА 6 ВЫЯВЛЕНИЕ ЛИПАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ХОЛЕРНЫХ
ВИБРИОНОВ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ НА ПИТА
ТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ С ДОБАВЛЕНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ
ЖИРОВ И ГЛИЦЕНРИНА 124
Изучение липазной активности холерных вибрионов Ol серогруппы биовара эльтор бактериологическим методом 126
Изучение липазной активности холерных вибрионов Ol серогруппы классического биовара на питательных средах 131
6.3. Изучение липазной активности холерных вибрионов 0139 серогруп
пы, выделенных из различных источников,
бактериологическим методом 134
Изучение гидролазной активности холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп по отношению к глицерину 139
Изучение липазной активности холерных вибрионов не ОІ/не 0139
серогрупп с различными генетическими характеристиками бактериоло
гическим методом 144
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 151
ВЫВОДЫ 162
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 164
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ ГКПБ«М» - Государственная коллекция патогенных бактерий Российского
научно-исследовательского противочумного института «Микроб», г. Саратов
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
ЛПС - липополисахарид
м.к. — микробная клетка
ПЦР — полимеразная цепная реакция
асе - ген, кодирующий accessory cholera enterotoxin.
ctx — ген холерного токсина
СТ - холерный экзотоксин
tcp - ген токсинкоррегулируемых пилей
ctxAB, tcpA, toxR - гены кассеты вирулентности
ЫуА — ген гемолизина
МуВ — ген метилакцептирующего фактора
lee - ген лецитиназы
МуС (ИрА) - ген триацилглицеролипазы холерных вибрионов
LipA — липаза холерных вибрионов
РАО — реакция агломерации объёмная
НКС - нормальная кроличья сыворотка
ООС - объекты окружающей среды
Введение к работе
Актуальность проблемы
В соответствии с основными критериями, определяющими вероятность использования микроорганизмов в качестве биологического оружия, возбудитель холеры отнесен к категории В - высокоприоритетных патогенов (Онищенко Г.Г., 2000; Кутырев В.В., 2007; Ломов Ю.М., 2007, 2008). В этой связи продолжает оставаться актуальным вопрос о факторах, определяющих патогенность и эпидзначимость холерных вибрионов, методах их выявления, разработка которых требует углублённого и всестороннего изучения биологии возбудителя холеры. Попадая в макроорганизм, патоген сталкивается с защитными структурами мембран клеток в виде белков, углеводов и липи-дов. И в то время как хорошо изучены белковый и углеводный обмены возбудителя холеры, механизмы преодоления липидных барьеров продолжают оставаться неизученными. В настоящее время способность продуцировать липазы установлена и изучена у целого ряда патогенных и непатогенных микроорганизмов. Однако существующие данные по изучению микробных липаз часто являются отрывочными и несопоставимыми, т.к. получены на различных субстратах, отличающихся разной степенью дисперсности (Бро-керхофф X. с соавт., 1978). В нашей работе мы обратились к вопросу изучения липазной активности холерных вибрионов, учитывая то обстоятельство, что присутствующие в клетках возбудителя холеры ферменты с липолитиче-ской активностью рассматриваются в качестве возможных факторов пато-генности (Fiore Е., 1997; Ogierman М.А., 1997). Установлено, что ген, ответственный за продукцию липазы, характерен для всех микроорганизмов, относящихся к Vibrio cholerae (Fiore Е., 1997; Harris J.R., 2002). Также была установлена (Casanova Т.В., 1995) высокая степень гомологии липазы Pseudomo-nas spp. с геном липазы холерных вибрионов, обозначенным (ЫуС или НрА), на основании чего сотрудниками РостНИПЧИ (Телесманич Ы.Р.с соавт, 2006) были разработаны методы её выявления у холерных вибрионов: серологиче-
екая детекция липазы с помощью антилипазного полимерного диагностику-ма, сконструированного на основе иммуноглобулинов к липазе Pseudomonas spp. фирмы «Sigma», и бактериологическое выявление липазной активности с применением жиров в питательной среде. Были определены корреляционные связи липазной и гемолитической активностей холерных вибрионов эльтор, выделенных из объектов окружающей среды, предложена возможность дифференциации токсигенных и атоксигенных вариантов. Однако результатов проведённых исследований недостаточно для общего понимания закономерностей проявления липазной активности, так как объектами в экспериментах служили холерные вибрионы только биоварианта эльтор и штаммы, выделенные исключительно из объектов окружающей среды. При этом липазная активность вибрионов классического биовара, 0139 серогруппы, а также холерных вибрионов не ОІ/не 0139 серогрупп с различными генетическими характеристиками формулы эпидзначимости, выделенных из различных источников, остаётся не изученной, в то время как разнообразие генотипиче-ских форм, свойственное возбудителю холеры, может определять неодинаковое фенотипическое проявление липазной активности у разных вариантов холерных вибрионов, что обусловливает актуальность нашего исследования.
Цель работы
Изучение закономерностей проявления триацилглицероллипазной активности холерных вибрионов 01 серогруппы биоваров эльтор и классического, вибрионов 0139 и не 01/не 0139 серогрупп.
Задачи исследования
1. Приготовление новых серий антилипазного диагностикума на основе иммунных сывороток, полученных в результате применения различных схем иммунизации животных, позволяющих повысить чувствительность диагностического препарата.
Изучение способности холерных вибрионов 01 серогруппы классического биовара и эльтор, вибрионов 0139 и не 01/не 0139 серологических групп продуцировать липазу, гомологичную липазе Pseudomonas spp., выявляемую с помощью антилипазного диагностикума в РАО.
Выявление липазной активности холерных вибрионов различных био-варов и серологических групп на питательных средах с добавлением различных жиров.
Изучение закономерностей проявления гидролазной активности холерных вибрионов различных серологических групп по отношению к глицерину, как составляющей триацилглицероллипазной активности.
Конструирование питательной среды с использованием в качестве стандартного субстрата глицерина для гидролазной активности, как составляющей глицероллипазной активности холерных вибрионов.
Изучение возможности стандартизации бактериологического метода дифференциации токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов на основе гидролазной активности по отношению к глицерину.
Новизна исследований
Впервые с помощью бактериологического метода выявлена липазная активность вибрионов 0139 серогруппы, в то время как в серологическом методе РАО с помощью антилипазного диагностикума показано, что продуцируемая этим вариантом возбудителя холеры липаза серологически не гомологична липазе Pseudomonas spp. и вибрионов эльтор. Впервые показано, что способность к продукции липазы холерных вибрионов эльтор (токсигенных и атоксигенных) через 24 часа является дифференциальным признаком между вибрионами Ol классического и эльтор биоваров.
Впервые выявлена зависимость проявления липазной активности от состава питательных сред, содержащих определённые добавки. Показано, что добавление глицерина 3% в бульон Мартена способствует увеличению про-
дукции липазы холерными вибрионами, что позволяет достичь наиболее точных результатов в изучении способности холерных вибрионов к продукции липазы, выявляемой серологическим методом РАО. Впервые определено, что продукция липазы гемолитическими вибрионами эльтор более активно проявляется при выращивании штаммов в триптоновой среде без ионов железа или с минимальной концентрацией FeCb, что подтверждает корреляционные связи липазной и гемолитической активностей холерных вибрионов эльтор. Впервые для идентификации холерных вибрионов эльтор предложен полимерный диагностический препарат, позволяющий выявлять гемолитические атоксигенные штаммы вибрионов эльтор на этапе скрининга подозрительных колоний.
Впервые липазная активность холерных вибрионов разных биоваров и серогрупп была изучена на питательных средах, содержащих широкий спектр жиров различного происхождения. Показано разнообразие проявления ацилгидролазной активности у различных групп холерных вибрионов различной эпидемической значимости в ответ на находящийся в питательной среде субстрат. Впервые изучена гидролазная активность холерных вибрионов по отношению к глицерину. Показана возможность дифференциации гемолитических и негемолитических штаммов холерных вибрионов эльтор и 0139 серогруппы на основе проявления ими гидролазной активности. Впервые предложен стандартный субстрат - глицерин - для конструирования дифференциальной среды, предназначенной для выявления гемолитических вариантов холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп на основе проявления ими гидролазной активности. Впервые при помощи бактериологического и серологического методов показана корреляционная связь триацилглицерол-липазной, гидролазной (в отношении глицерина) и гемолитической активностей холерных вибрионов эльтор, 0139 серогруппы и вибрионов различных не ОІ/не 0139 серогрупп.
Теоретическая и практическая значимость
Изучение триацилглицероллипазной активности расширило наши познания в сфере липидного обмена и биологии возбудителя холеры. Были выявлены отличия по липолитической активности между различными вариантами холерных вибрионов, выделенными из различных источников, на основании которых возможно дифференцировать атоксигенные гемолитические варианты вибрионов от токсигенных негемолитических.
Установлено, что липазы вибрионов эльтор, классического биовара и 0139 серогруппы являются серологически различными. С помощью антили-пазного полимерного иммуноглобулинового диагностикума, сконструированного с применением биотехнологических подходов на основе чужеродного, но высокогомологичного антигена липазы Pseudomonas spp. (степень гомологии 93,7%), показано, что последний не образует в РАО иммунобиологического комплекса антиген-антитело с липазой вибрионов классического биовара и 0139 серогруппы, что свидетельствует о возможной различной их аминокислотной последовательности. При этом липазная активность холерных вибрионов классического биовара и 0139 серогруппы проявляется при культивировании на средах с добавлением жировых субстратов и глицерина.
Установлено, что гемолитичные (атоксигенные) холерные вибрионы эльтор, выделенные от человека, продуцируют липазу через 4 часа культивирования в мясопептонном бульоне, в то время как негемолитичные не проявляют липазной активности через данный промежуток времени, что даёт возможность дифференцировать штаммы эльтор по продукции липазы в РАО на гемолитичные и негемолитичные, независимо от источника выделения (человек или ООС). Показано, что гемолитичные (атоксигенные) и негемолитичные (токсигенные) штаммы холерных вибрионов эльтор, независимо от источника выделения, способны продуцировать липазу через 24 часа культивирования в мясопептонном бульоне, выявляемую в РАО с применением ан-тилипазного Pseudomonas spp. диагностикума. Определены добавки - глице-
рин и гидролизат казеина - в жидкие питательные среды для культивирования холерных вибрионов с целью выявления липазы в РАО с помощью анти-липазного иммуноглобулинового Pseudomonas spp. диагностикума, которые позволяют повысить чувствительность серологического метода при выявлении гемолитических штаммов вибрионов эльтор. Выявлены корреляционные изменения гемолитической активности и продукции липазы холерных вибрионов при культивировании их в средах с различным содержанием ионов железа. Показана возможность использования метода РАО с применением антилипазного диагностикума в схеме идентификации холерных вибрионов на этапе скрининга подозрительных на холеру колоний под контролем агглютинации с 01-холерной сывороткой.
Показана возможность выявления гидролазной активности у гемолитических штаммов холерных вибрионов при культивировании на плотной питательной среде с добавлением глицерина в качестве субстрата. Показана возможность дифференциальных свойств гидролазной активности холерных вибрионов, проявляющейся на среде с добавлением глицерина. Предложено стандартизировать бактериологический метод дифференциации токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп на основе различной способности гемолитических и негемолитических штаммов к гидролизу глицерина, являющегося стандартным субстратом в сравнении с жирами.
Установлено, что экспрессия липолитических свойств атоксигенных гемолитических холерных вибрионов эльтор более выражена и обнаруживается в более короткие сроки культивирования в жидких и на плотных питательных средах, чем у токсигенных негемолитических вариантов, что имеет важное диагностическое и дифференциальное значение.
Усовершенствована схема получения антилипазной сыворотки к липазе Pseudomonas spp. с целью дальнейшего конструирования полимерного диагностического иммуноглобулинового препарата для выявления гемолитических штаммов холерных вибрионов в РАО. Разработан режим лиофилизации
антилипазного диагностикума, обеспечивающий стабильность препарата при хранении без снижения его активности в течение двух лет.
Показаны корреляционные связи ацилглгидролазной и гемолитической активностей холерных вибрионов, выявленные с помощью комплексного методического подхода, включающего серологический и бактериологический методы, которые открывают перспективы дальнейшего совершенствования дифференциальной диагностики. Данные методы, предназначенные для обнаружения и изучения триацилглицероллипазной активности холерных вибрионов, можно применять в лабораторной практике при проведении исследований с различными вариантами возбудителя холеры, с целью более глубокого изучения биохимических особенностей вибрионов, а также в системе эпи-днадзора за холерой.
Метод РАО с применением антилипазного диагностикума включён в методический документ «Серологические методы в диагностике холеры» (дополнение к МУ 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры»), утвержденные в 2008г. Главным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко. Получен патент на изобретение «Способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов» (№2261444, от 27 сентября 2005г.). Оформлена и утверждена директором института «Инструкция по изготовлению и контролю диагностикума антилипазного иммуноглобулинового полимерного сухого для выявления в РАО гемолитичных штаммов холерных вибрионов» (протокол №1 от 13.01.05). Депонирован в ГКПВ «Микроб» штамм холерных вибрионов 01 V. cholerae КМ 254 в качестве тест-штамма, который предложено использовать как положительный контроль в реакции агломерации объёмной. Получена справка № 2008117194 о приоритете в оформление патента «Способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов от токсигенных на основе гидролазной активности».
Основные положения, выносимые на защиту:
Липаза холерных вибрионов биовара эльтор, выявляемая в реакции агломерации с помощью антилипазного диагностикума, серологически отличается от липазы вибрионов 0139 серогруппы. Отсутствие у классических вибрионов продукции липазы, гомологичной липазе Psendomonas spp. и вибрионов эльтор, определяет возможность дифференциации биоваров.
Холерные вибрионы способны проявлять липазную активность по отношению к широкому спектру жиров различного происхождения на питательных средах. Однако проявления триацилгидролазной активности у холерных вибрионов разных биоваров, серологических групп и токсигенности различаются, что обусловливает разные критерии её оценки у разных групп холерных вибрионов.
Гемолитические холерные вибрионы способны проявлять гидролазную активность на питательной среде с добавлением глицерина, что обусловливает его использование в качестве стандартного субстрата для дифференциации токсигенных и атоксигенных штаммов холерных вибрионов бактериологическим методом.
Гемолитические холерные вибрионы не ОІ/не 0139 различных серог-рупп способны продуцировать липазу, гомологичную липазе Pseudomonas spp. и вибрионов эльтор, выявляемую серологическим методом РАО, а также проявлять триацилгидролазную активность при культивировании штаммов на питательной среде с жирами и глицерином.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 13 научных конференциях: Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы», (Ростов-на-Дону, 2004-2008гг.); Всероссийская научно-практическая конференция «Медицинская микробиология - XXI век», (Сара-, тов, 2004г.); IV Межвузовская международная конференция «Обмен веществ при адаптации и повреждении», (Ростов-на-Дону, 2005г.); VII Межгосудар-
ственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников СНГ», (Оболенск, 2006г.); Научно-практическая конференция «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России», (Ставрополь, 2007г.); IX съезд Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов н паразитологов, (Москва, 2007г.); Международная конференция «Vibrio 2007», (Париж, 2007); VII Межвузовская международная конференция с международ, участ. «Обмен веществ при адаптации и повреждении», (Ростов-на-Дону, 2008г.); IX Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ», (Волгоград, 2008г.). Получены акты внедрения в лабораторную практику разработанного антилипазного диагностического препарата от ФГУЗ «ЦГиЭ» Свердловской обл.; ФГУЗ Иркутский ПЧИ Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора; ФГУЗ ПЧЦ Роспотребнадзора.План диссертационной работы одобрен Ученым советом Ростовского НИПЧИ и утвержден директором института 27.06.07 (протокол №3). Исследования выполнены в рамках плановых научных тем: № 0120.0 507857 «Триацилглицероллипазная активность холерных вибрионов 01»; № 01. 2. 007 07281 «Липазная и адгезивная активности холерных вибрионов не 01 серогруппы»
Публикации результатов исследований. По теме диссертационного исследования опубликована 21 работа, в том числе две из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на со-
искание искомой ученой степени, получен один патент на изобретение и «Инструкция по изготовлению и контролю».
План диссертационной работы утверждён на заседании Ученого совета ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора 27.06.07 (протокол №3). Исследования выполнены в рамках плановых научных тем: № 0120.0 507857 «Триа-цилглицероллипазная активность холерных вибрионов Ol»; № 01. 2. 007 07281 «Липазная и адгезивная активности холерных вибрионов не 01 серо-группы»
Структура работы. Диссертация изложена на 197 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4-х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 156 работ отечественных и 144 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 21 рисунком.
Похожие диссертации на Закономерности проявления триацилглицероллипазной активности у холерных вибрионов
