Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Гемолитическая активность холерных вибрионов. обзор литературы 16
1.1. Гемолитическая активность в эволюции возбудителя холеры 16
1.2. Проблемы очистки и характеристики препаратов гемолизинов 26
1.2.1. Методы очистки гемолизинов холерных вибрионов . 26
1.2.2. Механизм действия гемолизинов холерных вибрионов как токсинов каналоформеров 47
1.2.3. Организация и экспрессия генов, детерминирующих синтез гемолизина холерных вибрионов 54
Собственные исследования 63
ГЛАВА 2. Ферменты в гемолитической активности холерных вибрионов 63
2.1. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей структурных генов, составляющих hly область генома холерных вибрионов и их продуктов 63
2.1.1. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности олипептида, продукта гена ЫуА 64
2.1.2. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности полипептида, продукта гена 1ес 69
2.1.3. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности полипептида, продукта гена ЫуВ 71
2.1.4. Компьютерный анализ аминокислотной последовательности полипептида, продукта гена ЫуС '. 73
2.2. Детекция ферментативных активностей в препаратах гемолизинов, полученных с помощью многоэтапных схем очистки 78
2.3. Двухэтапная схема очистки гемолизина холерных вибрионов, детекция ферментативных активностей фракций препарата 90
ГЛАВА 3. Роль триацилглицероллипазы и лецитиназы в гемолитической активности холерных вибрионов 101
3.1. Разработка питательной среды для выявления триацилглицероллипазной активности холерных вибрионов 101
3.2. Конструирование антилипазного полимерного иммуноглобулинового диагностикума на основе коммерческого препарата липазы Pseudomonas sp. фирмы «Sigma» для изучения липазной активности холерных вибрионов... 110
3.3. Роль лецитиназы в гемолитической активности холерных вибрионов... 120
ГЛАВА 4. Биологическая функция гена hly а, детерминирующего продукцию лектина 124
4.1. Общие сведения о лектинах 124
4.2. Углеводная специфичность лектина (Н1у А), выявленная в реакции торможения гемолиза 131
4.3. Участие галактозоспецифичного лектина в агглютинации эритроцитов токсигенными и атоксигенными штаммами холерных вибрионов 140
4.4. Метод осмотической протекции в изучении механизма действия гемолизинов 145
4.5. Углеводная специфичность некоторых лектиновых рецепторов холерных
вибрионов в процессе адгезии (на модели эритроцитов) : 154
ГЛАВА 5. Действие гемолизина на клетки микроорганизмов 172
5.1. Изучение влияния препаратов гемолизина на рост клеток грам +, грам" бактерий 174
5.2. Ультраструктурные изменения холерных вибрионов при действии гемолизина из штамма V. cholerae не 01 Р 11702 187
ГЛАВА 6. Функциональная организация и механизмы гемолитической активности холерных вибрионов 197
6.1. Гемолитическая активность холерных вибрионов эльтор . 197
6.2. Гемолитическая активность классических холерных вибрионов 205
6.3. Гемолиз и биологические мембраны 207
Заключение 215
Выводы 225
Литература 227
- Гемолитическая активность в эволюции возбудителя холеры
- Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей структурных генов, составляющих hly область генома холерных вибрионов и их продуктов
- Разработка питательной среды для выявления триацилглицероллипазной активности холерных вибрионов
- Углеводная специфичность лектина (Н1у А), выявленная в реакции торможения гемолиза
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Данные многолетних наблюдений позволяют высказать предположение, что индикатором эволюционной смены возбудителя холеры и одним из критериев оценки появления вирулентных форм явилась гемолитическая активность холерных вибрионов. Гемолитическая активность вибрионов эльтор до возникновения 7-й пандемии отличала их от классических холерных вибрионов. Начало 7-й пандемии охарактеризовалось появлением фенотипически негемоли-тичного варианта этого биовара, и в результате гемолитическая активность как тест, дифференцирующий биовары, утратил своё значение (Gotshlich F., 1905, Kraus R., 1903, Doorenbos W., 1932, Roy C, 1962, Greig E., 1914, Вейде A.A., 1975; Святой В.И., 1978; Адамов A.K., 1979 и др.).
Существует два экологических варианта холерных вибрионов, которые различаются по способности лизировать эритроциты барана в пробе Грейга. Вариант, не разрушающий эритроциты барана, с учетом его других свойств, является эпидзначимым, продуцирующим холероген, и гемолитический вариант, который принято считать авирулентным или слабовирулентным. В настоящее, время описаны два типа гемолитической активности: I тип, лизирующий эритроциты барана и других видов животных в пробе Грейга, II тип, не лизирующий эритроциты барана, но активный по отношению к эритроцитам кролика, морской свинки и других видов животных (Семиотрочев В.Л., 1987). В свою очередь каждый из них подразделяют на два варианта: а (лизис через 24 часа) и Р (лизис через 2 часа) (Семиотрочев В.Л., 1990). Однако продолжает оставаться открытым вопрос: чем отличаются типы гемолитической активности холерных вибрионов - интенсивностью экспрессии гена Ыу (количественно) или разным механизмом действия?
Гемолитичность холерных вибрионов, обусловленную экспрессией комплекса Ыу генов (Fiore Е., 1997), расположенного на малой хромосоме, принято рассматривать как альтернативу холерогенности и, соответственно, эпидемиче- ской опасности. Все биовары холерных вибрионов, обладают консервативным лецитиназа - гемолизин - липазным (1ес - Ыу А - Ыу В - Ыу С) локусом (Fiore Е., 1997). Отдельные штаммы холерных вибрионов эльтор могут продуцировать гемолизин, лизирующей эритроциты барана, в отдельных случаях сочетая в себе свойства гемолитичности и холерогенности (Осауленко О.В., 1994), что может затруднять дифференциацию холерогенных штаммов от нехолерогенных по гемолитической активности в общепринятом тесте Грейга.
Сравнительно недавно был показан механизм действия гемолизина как порообразующего токсина (Цитцер А.О., 1992; 2001; Chattopadhyay К., 2003). В настоящее время интенсивно изучаются конформационные изменения молекулы HlyA при взаимодействии с эритроцитами кролика и липидными везикулами (SahaN., 1997; Harris J., 2002; Olson R., 2003; Chattopadhyay K., 2003). Однако в этих исследованиях отражена больше структурная сторона процесса, чем функциональная. При этом не раскрывается реализация гемолитической активности живыми клетками холерных вибрионов, а также различие механизмов лизиса эритроцитов кролика и эритроцитов барана. Проведено патоморфологи-ческое исследование тонкого кишечника мышей - сосунков при воздействии гемолизина (цитолизина) (McCardell., 1985;Ray А., 2003). Сделан вывод, что гемолитическая активность может служить причиной диареи.
Отечественными специалистами установлено, что в пределах биовара способность к гемолизу эритроцитов барана может быть использована как один из критериев дифференциации эпидемических штаммов от неэпидемических, наряду с определением гена холерного токсина в ПЦР и биологической моделью, определяющей холерогенность (Никишина ГЛ., 1974; Вейде А.А., 1979; Святой В.И., 1978; Кюрегян А.А., 1988; Уралева B.C., 1988; Подосинникова Л.С., 1989).
Зарубежные исследователи, уделяя много внимания изучению гемолизина холерных вибрионов, рассматривают его лишь как возможный фактор вирулентности, но не как фактор дифференциации эпидемически значимых штам- мов. Поэтому зарубежные методы нацелены, в основном, на определение токсина реакциями латексной агглютинации и Elisa, а тест лизиса эритроцитов барана за рубежом продолжает оставаться тестом, дифференцирующим классический биовар от биовара эльтор.
В системе эпиднадзора за холерой в России гемолитическая активность в пробе по Грейгу является дополнительным критерием оценки эпидемической значимости штаммов, обеспечивая большое подспорье практическим лабораториям, которым недоступны биологические in vivo и молекулярно-биологические методы. С другой стороны, ограниченность подхода к дифференциации токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов по гемолитической активности, который на протяжении 100 лет не претерпел существенных изменений, заставляет нас задуматься о том, что представляет собой гемолитическая активность холерных вибрионов и каким образом можно расширить спектр методических подходов, основанных на гемолитической активности.
Следует признать, что термин «гемолизин» (цитолизин, гемоцитолизин) (McCardell., 1985) отражает лишь результат воздействия биологически активного вещества на эритроциты и это условное название не говорит ни о его структуре и функциях, ни о конкретном механизме действия. Несмотря на то, что проблеме выделения и очистки гемолизина посвящено значительное количество зарубежных и отечественных работ, механизмы гемолитической активности холерных вибрионов и роль ферментов в реализации этого процесса живыми бактериальными клетками до настоящего времени оставались неизученными.
Цель и задачи исследования.
Целью работы явилось выяснение биологической характеристики, функциональной организации и механизмов гемолитической активности холерных вибрионов.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Провести анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей полипептидов, продуктов генов, составляющих Ыу область, с помощью методов компьютерной геномики, что необходимо для прогнозирования основных биологических характеристик гемолитической активности.
2. Выяснить биологическую функцию гена ЫуА, как гена, детерминирующего продукцию лектина, участвующего в гемолитической активности штаммов холерных вибрионов различных биоваров и серологических групп.
3.Изучить роль лектина в гемагглютинирующей и адгезивной активности холерных вибрионов in vitro на штаммах различных биоваров и серологических групп.
Осуществить детекцию ферментов в препаратах гемолизинов, выделенных из разных штаммов холерных вибрионов.
Разработать методы изучения липазной активности холерных вибрионов и апробировать их на большом количестве штаммов холерных вибрионов.
На штаммах холерных вибрионов установить взаимосвязь лецитиназной, липазной и гемолитической активности холерных вибрионов.
Изучить эффекты влияния гемолизинов холерных вибрионов на клетки прокариот.
Научная новизна.
Впервые лектиновая природа продукта гена ЫуА выявлена путем инги-бирования гемолиза эритроцитов барана галактозой у штаммов холерных вибрионов (приоритет № 2004121534). Впервые сформулирована концепция о гемолитической активности как сложном, полифункциональном процессе, включающем взаимодействие лектина с галактозой на поверхности мембран эритроцитов барана, участие нейраминидазы в десиализации мембран и ферментов, действующих на липиды и фосфолипиды.
Впервые выполнен компьютерный анализ нуклеотидных (НК) последовательностей генов Ыу области и соответствующих аминокислотных (АК) последовательностей холерных вибрионов, на основании, которого составлено представление о функциональной организации и возможных механизмах гемо- литической активности.
Впервые обнаружено и на штаммах холерных вибрионов различных биоваров и серологических групп показано фенотипическое проявление гена ЫуА, детерминирующего продукцию лектина, определена его углеводная специфичность к галактозе и установлена роль в гемолитической активности холерных вибрионов (приоритет № 2004121534). На наборе токсигенных и аток-сигенных штаммов установлено, что галактозоспецифичный рецептор не принимает участие в лизисе эритроцитов кролика.
Впервые на штаммах холерных вибрионов различных серологических групп и биоваров показано участие галактозоспецифического лектина в гемагг-лютинации и адгезии in vitro.
Впервые определены углеводные рецепторы на мембране эритроцитов барана и кролика, участвующие в гемолизе, гемагглютинации, адгезии холерных вибрионов. Предложена модельная система in vitro для изучения влияния углеводов на процесс адгезии (приоритет №2005109733/13).
Впервые описана триацилглицероллипазная активность холерных вибрионов; установлена взаимосвязь липазной и гемолитической активности холерных вибрионов.
Впервые предложены методы изучения липазной активности холерных вибрионов. Разработана питательная среда (№ приоритет 2003135696/13) и ди-агностикум антилипазный иммуноглобулиновый полимерный сухой для ее детекции (приоритет №2004108603/15).
Впервые для получения диагностикума, выявляющего липазу холерных вибрионов, предложено использовать иммуноглобулин к гомологичному по структуре, но чужеродному для холерного вибриона антигену коммерческой липазы Pseudomonas sp., что апробировано на большом количестве штаммов холерных вибрионов эльтор.
Впервые выявлен различный диапазон вибриоциногенной активности препаратов гемолизинов по отношению к индикаторным культурам.
Теоретическая значимость.
Данные, полученные с помощью методов компьютерной геномики, несут высокую степень информативности и перспективны для выяснения новых неизвестных свойств и функций гемолизина холерных вибрионов. Установлена лектиновая природа продукта гена ЫуА, которая объясняет способность последнего к комлексообразованию с различными гидролитическими ферментами. С помощью компьютерного анализа предсказаны продукты каждого из генов Ыу области и установлена степень гомологии с другими белками, что может быть использовано для дальнейших научных исследований, а в результате привести к совершенствованию подходов в дифференциальной диагностике холерных вибрионов.
Полученные сведения о лектине (Н1у А) могут быть использованы для дальнейшего углубленного изучения роли лектинов в патогенезе холеры и острых диарей. Лектиновые свойства препаратов гемолизина и их специфичность к галактозидам могут быть использованы в разработке новых методов биотехнологии.
Взаимодействие лектинов с мембранными рецепторами метаболически полноценных клеток эукариот и прокариот, последующая их реакция являются удобной моделью для исследования регуляторных механизмов и углеводных рецепторов клеточной мембраны. Знание углеводной специфичности лектина Н1у А позволяет применить его даже в виде «грубого» препарата, в качестве детектора определенных углеводных групп на поверхности цитомембран и выяснения участия последних в различных физиологических и патофизиологических процессах. Изучение ингибирующей способности Сахаров на адгезию холерных вибрионов in vitro дает возможность определить наличие или отсутствие углеводсвязывающих лектиновых рецепторов, участвующих в адгезии, что перспективно для изучения патогенеза холеры. Выявление у холерных вибрионов триацилглицероллипазной активности расширило наши представления о биологии возбудителя холеры. Полученная информация об использовании иммуноглобулинов к липазе Pseudomonas sp. (Sigma) для выявления липазы хо- лерных вибрионов перспективна в плане использования чужеродных, но гомологичных по структуре коммерческих антигенов, с целью конструирования препаратов для изучения фенотипа других микроорганизмов.
Практическая значимость.
Разработана питательная среда для выявления липазной активности холерных вибрионов. Данные по липазной активности холерных вибрионов позволили предложить новый способ дифференциации токсигенных (негемоли-тичных) от атоксигенных (гемолитичных) штаммов в дополнение к тесту Грей-га на основе определения триацилглицероллипазной активности. Принцип реакции (способность гемолитичных вибрионов к гидролизу жиров) может быть использован для разработки других методов биохимической идентификации и дифференциации V. cholerae. Сконструирован антилипазный полимерный им-муноглобулиновый диагностикум на основе липазы Pseudomonas sp. (Sigma), который в реакции объемной агломерации выявляет гемолитичные атоксиген-ные штаммы по продукции липазы. Препарат перспективен в плане изучения закономерностей проявления липазной активности у холерных вибрионов в РАО. Получены сведения о возможности использования чужеродных, но гомологичных антигенов для серологических реакций.
Получены положительные решения на выдачу патентов по заявкам: «Способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов» (№ 2004108603/15 (009067); «Способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов от токсигенных» (№ 2003135696/13 (038310); «Способ выявления лектиновых рецепторов микроорганизмов и их токсинов» (№ 2004121534/(023081); «Способ определения ингибирующей способности Сахаров на адгезию холерных вибрионов» (№ 2005109733/13).
Одобрены Ученым советом и утверждены директором РостНИПЧИ методические рекомендации «Новый дифференциальный тест для выявления гемолитичных холерных вибрионов» (протокол №3 от 23.05.02); «Инструкция по изготовлению и контролю антилипазного полимерного иммуноглобулинового диагностикума» (протокол №1 от 13.01.05). Положения, выносимые на защиту:
Гемолитическая активность холерных вибрионов является сложным полифункциональным процессом, включающим взаимодействие лектина с галактозой на поверхности мембран эритроцитов барана, участие нейраминидазы в десиализации мембран и ферментов, действующих на липиды и фосфолипиды.
Лектиновый рецептор, детерминируемый геном ЫуА, принимает участие в лизисе эритроцитов барана, но не кролика, взаимодействует с углеводами II группы - 3,4 - ОН транс Д форма (Д - галактоза), избирателен к аномерам р ф галактоза) (по классификации О. Мёкела).
Галактозоспецифичный лектиновый рецептор принимает участие в процессах взаимодействия токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов с клеточными мембранами: гемагглютинации эритроцитов кролика и барана, адгезии к эритроцитам барана и человека.
Холерные вибрионы эльтор обладают триацилглицероллипазной активностью, коррелирующей с гемолитической активностью этих микроорганизмов, что перспективно для разработки методов дифференциальной диагностики V. cholerae.
Иммуноглобулины к чужеродному, но гомологичному антигену липазы Pseudomonas sp., могут быть использованы для разработки методов выявления липазной активности холерных вибрионов.
Апробация работы.
Результаты исследований были представлены на научных конференциях: «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». Международная конференция, посвященная 75-летию института им. Пастера. С.-Петербург, 1998 г.
Юбилейная научная конференция, посвященная 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. Киров, 1998 г.
Российская научно-практическая конференция по проблеме «Холера». Ростов-на-Дону, 1995 г.
Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 1999 г.
Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2000 г.
Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2001 г.
Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2002 г. VIII съезд Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, 2002 г. VIII Российская научно-практическая конференция по проблеме "Холера». Ростов-на-Дону, 2003 г.
Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2004 г.
Всероссийская научно-практическая конференция «Медицинская микробиология - XXI век». Саратов, 2004 г.
Проблемная комиссия «Разработка и стандартизация медицинских иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики инфекционных болезней». Москва, 2004 г.
Проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2005 г.
Публикации результатов исследований.
По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, 9 - в центральной печати, из них четыре обзорных. Представлено пятнадцать докладов на конференциях и проблемных комиссиях. Получены положительные решения на выдачу патентов по заявкам: «Способ выявления атоксигенных гемолитичных штаммов холерных вибрионов» (№ 2004108603/15 (009067); «Способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов от токсигенных» (№ 2003135696/13 (038310); «Способ выявления лектиновых рецепторов микроорганизмов и их токсинов» (№ 2004121534/(023081); «Способ определения инги- бирующей способности Сахаров на адгезию холерных вибрионов» (№2005109733/13).
План диссертационной работы утвержден на заседании Ученого совета ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора (протокол № 3 от 14 мая 2003 г.)
Структура работы.
Диссертация написана в виде монографии, изложена на 256 страницах, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, каждая из которых включает описание материалов и методов, результаты собственных исследований, их обсуждение, за которым следуют заключение и выводы. Диссертация иллюстрирована 32 таблицами и 41 рисунком. Библиографический указатель содержит 291 информационный источник, в том числе 128 работ отечественных и 163 - зарубежных авторов.
Гемолитическая активность в эволюции возбудителя холеры
На мировой арене эпидемическая азиатская холера появилась в 1817 году. Выйдя за пределы своей родины - Индии, она с 1817 по 1925 годы вызвала шесть пандемий (табл. 1).
В период III пандемии в 1854 году F. Pacini открыл возбудителя холеры и только в начале V пандемии в 1883 году R. Koch выделил его в чистой культуре, о чем он в 1884 году сделал сообщение, а сам микроб был назван комма -бациллой, запятовидной бациллой или Vibrio cholerae (цит. по Недзевецкий Э.Ф.; 1872цит. по Politzer R., 1959; Bishagratna S.K., 1963; Mekalanos J.J. et al., 1997). Таблица 1. Пандемии холеры (Ломов Ю.М., 2003) Пандемии холеры I пандемия 1817-1823 гг. Сведения о возбудителе отсутствуют II пандемия 1826-1837 гг. Сведения о возбудителе отсутствуют III пандемия 1846-1862 гг. - В 1854 году Ф. Пачини открыл возбудителя холеры. - Характеристика возбудителя отсутствует. Продолжение таблицы 1. IV пандемия 1864-1875 гг. Характеристика возбудителя отсутствует V пандемия 1883-1896 гг. - В 1883 г. Р. Кох выделил возбудителя и дал первую характеристику его свойств. Сделано первое сообщение о гемолитической активности возбудителя. - Груббером и Дерхемом в 1896 г. введена в практику реакция агглютинации. - Появилась возможность идентификации возбудителя по О - антигену V. cho-lerae 01 - азиатской холеры. VI пандемия 1900-1925 гг. - Начаты бактериологические исследования на холеру. - Клинический диагноз подтверждается выделением культуры холерного вибриона. - Проводятся исследования материала из объектов внешней среды. - Исследователями выделены вибрионы 01 и не 01 групп, обладающие гемолитическими свойствами. VII пандемия 1961 г. - по настоящее время - Смена биотипа возбудителя - холера эльтор. - В практику вводятся ускоренные методы обнаружения возбудителя холеры, внедряются молекулярные методы его диагностики и идентификации. - Совершенствуются методы определения вирулентности возбудителя.
В сообщении R. Koch были и первые данные по гемолитической активности холерных вибрионов, он отметил, что «стул больного холерой, содержащий кровь, был засеян на желатиновую среду, в результате вокруг колоний бактерий были видны ясные зоны». На основании этого сделано заключение о том, что холерные вибрионы способны разрушать эритроциты и, возможно, другие клетки. Отсюда следует, что вибрион, выделенный R. Koch, вызвавший холеру у человека, был способен к гемолизу эритроцитов человека. В 1886 году Biter вёл наблюдение за действием фермента холерного вибриона на суспензии кроличьей крови. Следует отметить, что уже в то время появился интерес у исследователей в отношении действия ферментов холерного вибриона на эритроциты.
В начале 1906 года появилась серия работ (Gruber М., Durham Н., 1906; Kraus R. et al., 1906), в которых различия в вирулентности холерных вибрионов напрямую связывали с их способностью к агглютинации иммунной сывороткой. R. Kraus утверждал, что холерные штаммы склонны варьировать по своему антигенному строению, и наличие особых агглютиногенов явилось причиной отклонений от типичных штаммов, которые выделяли от больных во время вспышки холеры в Камарике (Аравия) в 1908 году. Обратив внимание на гемолитическую активность холерных вибрионов, R. Kraus рекомендовал использовать для дифференциации негемолитичных вибрионов от гемолитичных вибрионов (холероподобных) различные среды. Таким образом, уже в начале VI пандемии исследователи обратили внимание на то, что вибрионы, вызывающие холеру, гемолитическими свойствами не обладают. Однако вид используемых эритроцитов в рукописях тех лет не уточняется.
Возбудитель, обусловивший VII пандемию, был известен еще в начале двадцатого столетия: в 1905 году F. Gotschlich, исследуя фекалии 107 паломников, вернувшихся из Мекки, обнаружил в шести случаях вибрионы, агглютинирующиеся антихолерной сывороткой, и объявил, что эти вибрионы являются холерными. Вибрионы были выделены из кишечника трупов пилигримов в карантинном лагере Эль-Тор, организованном на западном берегу Синайского полуострова в конце 19-го столетия в целях профилактики заноса азиатской холеры в Египет. F. Gotschlich обнаружил, что они проявляют свойства подобные классическим холерным вибрионам, но гемолитичны. Впоследствии эти холерные вибрионы получили название по имени карантинной станции Эль-Тор. В 1906 году F. Gotschlich выделил вибрионы эльтор от больных дизентерией. Изучив выделенные им вибрионы, он пришел к выводу, что они отличаются от классических холерных вибрионов способностью гемолизировать эритроциты козы и барана. При этом Van Loghem (1913) отметил у данных вибрионов истинный гемолиз, когда происходит выход гемоглобина в раствор, в отличие от гемопереваривания, при котором гемоглобин разрушается протеолитическими ферментами до гематина.
На этом этапе начали отрабатываться различные методы и питательные среды для изучения гемолитической активности холерных вибрионов. Е. Greig (1914) описал два метода для определения гемолиза холерных и других вибрионов на плотных и жидких питательных средах. Эксперименты Е. Greig подтвердили, что вибрионы, выделенные из кишечника больных холерой (333 штамма) были не гемолитичными, а 100 штаммов от носителей и из воды вызывали гемолиз.
Метод определения гемолитической активности по Грейгу и по сей день (на протяжении почти ста лет) является одним из эффективных способов in vitro оценки эпидемической значимости штаммов наряду с методами ГЩР, ДНК-зондированием и определением чувствительности к фагам холерным эльтор ctx + и ctx". Методика Грейга была модифицирована и усовершенствована рядом авторов (Feely J.C., Pittman М, 1962).
До середины тридцатых годов 20-го столетия не было никаких доказательств патогенности вибрионов эльтор в отношении человека. Однако С. De Moor (1938) сообщил об эпидемической вспышке диарейного заболевания протекавшей с сентября 1937 по апрель 1938 года на острове Целебес (Индонезия), вызванного вибрионами эльтор. Болезнь протекала с симптомами типичной холеры: обильная диарея, неукротимая рвота, обезвоживание, одышка, алгид-ность, цианоз, судороги. Однако выделенные штаммы были гемолитически активны, и этот факт ставил под сомнение этиологическую роль вибрионов эльтор.
Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей структурных генов, составляющих hly область генома холерных вибрионов и их продуктов
Успехи современных информационных технологий, в частности, создание системы Internet, совершили революционный переворот во многих областях науки. Одним из наиболее характерных приемов является разработка и активное использование баз данных и широкого спектра прикладных программ для анализа структуры ДНК.
Для прогнозирования и объяснения свойств гемолизина холерных вибрионов нами был проведен компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов Ыу-области V. cholerae и их продуктов. В задачи работы входило: 1. Поиск в базах данных сведений о нуклеотидных последовательностях (НК) интересующих нас генов. 2. Поиск соответствующих аминокислотных последовательностей (АК) белков - продуктов изучаемых генов. 3. Идентификация похожих участков, то есть сравнение аминокислотных последовательностей исследуемых белков с участками аминокислотных последовательностей белков с уже известными функциями и свойствами, и определение степени их гомологии. 4. Определение имеющихся мотивов аминокислотных последовательностей, продуктов изучаемых генов.
Нам представлялось, что решение этих задач позволит объяснить уже известные свойства гемолизина и предположить возможности фенотипических проявлений каждого из генов, составляющих hly область V. cholerae.
Компьютерный анализ проводили при помощи системы интегрирован 64 ного запроса «Entrez» на сайте Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov). С помощью программного продукта двигателя Inter Pro\ f Scan, позволяющего проводить одновременный поиск в различных базах дану , ных (PROSITE; PRINTS; PFAM). " Из коллекции on-line инструментов для анализа аминокислотных и нук-леотидных последовательностей (www.expasy.ch/tools) был выбран алгоритм Scan Prosite для поиска коротких аминокислотных мотивов продуктов каждого гена. Программный алгоритм BLASTP 2.1.2. был использован для определения степени гомологии аминокислотных последовательностей продуктов изучаемых генов с АК последовательностями белков других организмов.
Компьютерный анализ аминокислотной последовательности полипептида, продукта гена ЫуА
Компьютерный анализ показал, что продуктом гена ЫуА является гемолизин-предшественник (Coelho А., 2000). Найдены полные АК и НК последовательности ЫуА и HlyA, зарегистрированные в базе данных под номерами доступа (№ д) AF 194418 и AF 08828 соответственно. Фрагмент секвенированнои НК последовательности составлял 2497 п.н., величина HlyA полипептида составляла 749 АК. Первые 40 аминокислот составляют сигнальный пептид (рис. 7). С 224 по 2449 нуклеотид-это структурная часть гена-предшественника (рис. 6).
При помощи программного алгоритма BLATP 2.1.2. (Altshul S.F. et al, 1997) было установлено, что АК последовательности HlyA различных штаммов V. cholerae проявляют высокую степень гомологии - диапазон значений идентичности составил от 80 до 100 %. Кроме того, достаточно высокую степень гомологичности HlyA проявили некоторые представители рода Aeromonas.
Для поиска АК мотивов в последовательности HlyA мы выбирали программный продукт InterProScan (www.expasy.ch/tools), позволяющий проводить j одновременный поиск в различных базах данных мотивов (PROSITE, PRINTS, PFAM-A) при помощи различных математических алгоритмов (PPsearch, J PFScan, FingerPRINTScan, HMMDecypher). Нами были обнаружены следующие Д АК мотивы в белке-предшественнике HlyA (рис. 8): комбинированный лейкоцидин/ASH 4 (№ IPR001340) в положении 288-481, имеющий краткую кодовую характеристику «hemolysin роге»; лектиновый домен р цепи рицина (№ IPR00772) в положении 484-600.
Впоследствии из коллекции «on-line» инструментов для анализа НК и АК последовательностей (www.expasy.ch/tools) был выбран алгоритм Scan Prosite для дальнейшего поиска коротких АК мотивов. Полученные нами предварительные данные позволяют говорить о наличии 5 потенциальных сайтов N-гликозилирования. Кроме того, обнаружены 2 потенциальных сайта фосфори-лирования цАМФ- и цГМФ-зависимых протеинкиназ; 4 сайта для протеинки-назы С и 13 - для казеинкиназы И. Обращают на себя внимание 2 сайта фосфо-рилирования тирозинкиназы. Выявлены 12 потенциальных сайтов N-миристилирования (рис. 9).
Наличие всех вышеперечисленных сайтов фосфорилирования дает возможность с высокой степенью вероятности утверждать, что Н1уА-полипептид способен участвовать в процессах обратимого фосфорилирования в качестве субстрата для различных протеинкиназ/фосфатаз. Несмотря на то, что возможность N-гликозилирования бактериальных белков некоторые авторы ставят под сомнение, существование бактериальных гликопептидов, к которым, скорее всего, относятся и гемолизины холерных вибрионов, не вызывает сомнения. Наличие в первичной АК последовательности Н1уА-полипептида 12 потенциальных сайтов миристилирования свидетельствуют в пользу возможности образования липогликопротеиновых комплексов HlyA.
Разработка питательной среды для выявления триацилглицероллипазной активности холерных вибрионов
До настоящего времени триацилглицероллипазная (липазная) активность холерных вибрионов изучена недостаточно. Она представляет интерес не только с позиций способности вибрионов гидролизовать различные жиры, но и для выяснения взаимосвязи ее с факторами патогенности, в частности с гемолитической активностью. Способность к лизису эритроцитов барана нетокси-генных штаммов холерных вибрионов является одним из тестов дифференциации холерных вибрионов по их эпидемической значимости.
Показано, что ген, кодирующий продукцию липазы у холерных вибрионов, располагается на малой хромосоме и является одним из структурных генов hly области, отвечающей за продукцию гемолизина. Эта область представляет собой консервативную для вариантов возбудителя холеры (классического, эль-тор, «Бенгал») комбинацию генов lee - hly - lip (лецитиназа, гемолизин, липаза) (FioreA., 1997).
Уникальный характер реакции катализа истинных липаз заключается в том, что ферменты растворимы в воде, а субстраты нерастворимы. Реакции происходят на поверхности раздела фаз липид-вода. Неудобство при работе с нерастворимым в воде субстратом явилось, вероятно, причиной неизученности этого феномена у холерных вибрионов. Животные и растительные жиры гидро-лизуются триацилглицероллипазой микроорганизмов только после очень тщательного эмульгирования. Если такое эмульгирование субстрата не будет осуществлено, то установить липазную активность у микроорганизма не удается (Бырдаров СВ., 1965). Немаловажным моментом методики является выбор подходящего субстрата. Один и тот же микроорганизм способен по-разному реагировать на разные жиры (Брокерхофф X., 1978). Поэтому отработка методики и поиск оптимального субстрата являются основополагающими для выявления и изучения закономерностей проявления липазной активности у холерных вибрионов. До сегодняшнего времени не существовало метода для определения липазной активности холерных вибрионов. Нами впервые разработан и предлагается метод её определения, а также способ дифференциации гемоли-тичных и негемолитичных штаммов на основе определения триацилглицерол-липазной активности.
Выделение ферментов разной степени чистоты является необходимым условием подробного изучения свойств и строения энзиматических белков. С физиологической же точки зрения выделенный из клетки такой белок является артефактом, демонстрирующим неизбежность абстракции от сложности биохимического аппарата клетки для изучения отдельных его частей. Поэтому целью работы явилось как определение липазной активности очищенных препаратов гемолизина, так и изучение закономерностей проявления липазной активности живых клеток холерных вибрионов.
Для достижения цели необходимо было провести методический поиск, позволяющий выявить субстратную специфичность липазы холерных вибрионов, определить оптимальную концентрацию субстрата, подобрать адекватный эмульгатор жира, демонстративный индикатор и определить временные параметры проявления максимальной активности.
Объектом исследования явились очищенные препараты гемолизина, ли зирующие эритроциты барана, а также токсигенные и нетоксигенные штаммы холерных вибрионов.
Исследовали три препарата гемолизина, любезно предоставленные сотрудниками Ростовского противочумного института, выделенные из штаммов V. cholerae поп 01 Р-11702 I типа а; V. cholerae eltor 9949 I типа а (лизирующие эритроциты барана через 24 часа), мутанта V. cholerae cholerae О" I типа Р (ли-зирующий эритроциты барана через 2 часа). Триацилглицероллипазную активность препаратов гемолизина определяли по методу О.Д. Кушмановой (1983). К исследуемым препаратам (50 мкл) добавляли 50 мкл необезжиренного молока и 10 мкл 1% раствора фенолфталеина и по каплям 1% раствор карбоната натрия до появления бледно-розовой окраски при рН 8,0. Пробирки помещают в термостат при 38 С на 30 минут, в случае положительной реакции наблюдается обесцвечивание окраски. В качестве контроля использовали пробу с водой. Под действием липазы нейтральные жиры подвергаются гидролизу, и реакция среды за счет жирных кислот сдвигается в кислую сторону, розовая окраска фенолфталеина исчезает.
Для выявления липазной активности живых клеток холерных вибрионов необходимо было сконструировать питательную среду, содержащую оптимальную концентрацию субстрата, эмульгатор жира, индикатор. Для этого к агару Мартена добавляли 1 %; 2 %; 3 % бараньего и куриного жира, сливочного масла, а растительные масла - подсолнечное, оливковое и кукурузное. Так как основным условием для проявления изучаемой активности является тщательное эмульгирование растворимого в воде субстрата, в качестве эмульгатора использовали 0,1 % «Прогресс», в качестве индикаторов - фенолрот - 0,5 % основного спиртового раствора или 0,1 % Нильского голубого сульфата - основной водный раствор.
Углеводная специфичность лектина (Н1у А), выявленная в реакции торможения гемолиза
По данным ряда отечественных авторов (Ушакова И.Е., 1993; Власов В.П., 1988; Монахова Е.В., 1987), ген гемолизина вибрионов (Ыу А) эльтор присутствует в геномах всех представителей вида V. cholerae, независимо от их биовара, принадлежности к 01 группе, наличия генов ctx и фенотипического проявления гемолитичности.
Токсигенные штаммы вызывают лизис эритроцитов кролика. Как было показано в предыдущем исследовании, лизис эритроцитов кролика всех Таблица 18. Результаты изучения влияния углеводов на лизис эритроцитов кролика и барана у холерных вибрионов (сводная таблица)
Серовар, биовар Гемолиз эритроцитов кролика Гемолиз эритр ингиби эцитов кролика рование Гемолиз эритроцитов барана Гемолиз эритроцитов барана ингибирование
Д-галак-тоза В-галак-тоза N-ацетил-галактоз-амин глюкоза Д-галак-тоза В-галак-тоза N-ацетил-галактоз-амин глюкоза Эльтор ctx Hly + гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз ингибиц. ингибиц. гемолиз гемолиз
Эльтор ctx "Uly гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз нет нет нет нет нет 0139 ctx Hly + гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз ингибиц. ингибиц. гемолиз гемолиз 0139 ctx ""Hly нет нет нет нет нет нет нет нет нет нет 569 ctx+Hly" слабый гемолиз слабый гемолиз слабый гемолиз слабый гемолиз нет нет нет нет 142 штаммов не связан с лектином HlyA. Следовательно, экспрессируемый продукт гена ЫуА (как установлено выше - галактозоспецифичный лектин) у токсиген ных штаммов можно обнаружить по способности последних к агглютинации эритроцитов при ингибировании агглютинации галактозой.
Иными словами, необходимо ответить на вопрос: принимает ли галактозо специфичный лектин участие в способности гемолитичных и негемолитичных (токсигенных) штаммов агглютинировать эритроциты?
В опыте использовали 28 штаммов холерных вибрионов: V. cholerae cholerae 569 В; V. cholerae eltor ctx+ 1310; 3119; 5879; 18210; 18228, 18229, 18231; V. cholerae eltor Hly+ 14156; 14293; 14863; 14959, 15037, 18118; 18250; 18324; 18325; 18326; V. cholerae 0139 ctx+ 16063; 16064; 16065; 16077; 16131; hly+ 17907,17674; 17625; 17673,17626.
С каждым штаммом ставили классическую реакцию агглютинации в 96 луночной панели, используя 1 млрд. взвесь агаровой культуры по стандарту мутности (50 мкл) и 50 мкл 2,5% взвеси эритроцитов барана и кролика, трижды отмытых физиологическим раствором, так как в опытах по изучению торможения гемолиза углеводами использовали именно эти эритроциты.
При положительной реакции в течение 5 минут наступала агглютинация эритроцитов в виде зонтика. Отрицательная реакция - выпадение эритроцитов в виде «пуговицы» в центре лунки.
Контроли: 1) 50 мкл физиологического раствора + 50 мкл 2,5% взвеси эритроцитов = отрицательная реакция (красная пуговица в центре капли); 2) 50 мкл физиологического раствора с испытуемой культурой.
Для метода подавления гемагглютинирующей активности лектина углеводами использовали тот же набор Сахаров: Д - галактоза (Serva), р - галактоза (Chemahol, Praha), N-ацетилгалактозамин (Cal-Biochem, USA), глюкоза («Ла-верна»). В 1 мл 1 млрд. взвеси холерных вибрионов растворяли навеску 0,01 мг каждого сахара и инкубировали в термостате при 37 С 20-40 минут. Затем 50 мкл приготовленной суспензии соединяли с 50 мкл 2,5%о взвеси эритроцитов. Результат положительной реакции - ингибирование гемагглютинации: выпаде 143 ниє осадка эритроцитов виде пуговки.
Классическую реакцию гемагглютинации и реакцию торможения ге магглютинации углеводами с каждой культурой ставили параллельно. В результате было показано, что к агглютинации эритроцитов барана способны практически все штаммы холерных вибрионов, кроме V. cholerae 0139 ctx+ (табл. 19). После многократного пассирования на питательных средах у некоторых штаммов V. cholerae 0139 ctx+ появляется слабая агглютинирую щая способность. У штамма V. cholerae cholerae 569 В агглютинирующая ак тивность подавляется (3 - галактозой, слабее - Д - галактозой. У штаммов V. cholerae eltor ctx+ - Д - галактозой и (3 - галактозой. У штаммов V. cholerae eltor и, Н1у+ - Д - галактозой и р - галактозой, N-ацетилгалактозамином. V. cholerae 0139 Н1у+ - Д - галактозой и р - галактозой (табл. 19,21).
Таким образом, было показано, что лектин, специфичный галактозидам, экспрессируется и в токсигенных штаммах и участвует в их способности к «склеиванию» эритроцитов барана.
Все штаммы холерных вибрионов способны агглютинировать эритроциты кролика, только у V. cholerae 0139 эта способность проявляется лишь в некоторых случаях. У штаммов V. cholerae eltor ctx+ она ингиби руется Д-галактозой и Р-галактозой, N-ацетилгалактозамином; у V. cholerae cholerae 569В также Д-галактозой и Р-галактозой, N-ацетилгалактозамином. У V. cholerae eltor Н1у+ - только Д-галактозой. У V. cholerae 0139 Н1у+ - р-галактозой и Д - галактозой активнее (табл. 20, 21).
По всей видимости, продукт дефектного гена Ыу А у V. cholerae cholerae 569В также является галактозоспецифичным лектином и принимает участие в гемагглютинации. По данным Goldberg S.L. (1984) нуклеотидная последова тельность Ыу локуса классического штамма имеет делецию в 11 нуклеотидных пар ЫуА гена, что приводит к нарушению рамки считывания и появлению стоп кодона в положении 734 н.п. и транскрипции гена лишь на 1/3. R.A. Aim (1991) w уточнил, что дефективным является только N-конец, С-конец остается полно ценным. По нашим данным компьютерного анализа и данным литературы 144 (Chattopadhyay К., 2003) на N-конце располагается домен каналоформирования (дефектный), а С-конец содержит домен Р-цепи рицина (углеводсвязывающий).
Поэтому вполне объяснимо, что он может принимать участие в процессе ге магглютинации классического холерного вибриона.
Вполне возможно, что лектин, специфичный галактозидам, (участвующий в гемолизе эритроцитов барана), принимает участие в агглютинации эритроцитов кролика как у токсигенных, так и у атоксигенных штаммов холерных вибрионов. Судя по результатам проведенных нами опытов, штаммы холерных вибрионов эльтор, гемолитичные и токсигенные при агглютинации эритроцитов барана и кролика, взаимодействуют с углеводными рецепторами на поверх ности мембраны эритроцитов III группы - 3,4 Онтранс Д-форма, аномерам р, в различных сочетаниях, характерных для каждой группы штаммов, что соответствует и характеристике гемолитического лектина HlyA. Однако можно предположить существование у холерных вибрионов еще одного галактозоспеци-фичного лектина, но об этом в литературе сведений нет. Штамм V. cholerae cholerae 569В обладает лектином такой же специфичности. Штаммы 0139 се-ровара токсигенные проявляют гемагглютинирующую активность не во всех случаях, которая ингибируется Д - галактозой и р - галактозой. По нашему мнению, фенотип гемолитической и агглютинирующей активности у штаммов серовара 0139 нуждается в дополнительном расширенном изучении.
Таким образом, галактозоспецифичный лектин, как и ген ЫуА гемолизина вибрионов эльтор присутствует у всех представителей вида V. cholerae независимо от их биовара, принадлежности к 01 группе, токсигенности; принимает участие в лизисе эритроцитов барана (но не эритроцитов кролика) и в ге-магглютинации эритроцитов кролика и барана токсигенными и атоксигенными представителями V. cholerae.
Похожие диссертации на Механизмы гемолитической активности холерных вибрионов
