Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Биологичекая фиксация азота как общепланетарный процесс 9
1.1.1. Строение нитрогеназной системы 11
1.1.2. Регуляция нитрогеназной системы 13
1.2. Эколого-физиологическая характеристика бактерий рода Azotobacter 15
1.2.1. Строение и особенности роста азотобактера 15
1.2.2. Основные физиологические свойства азотобактера 17
1.2.3. Влияние факторов внешней среды на характер роста бактерий рода Azotobacter 21
1.2.4. Характер распространения азотобактера 26
1.3. Взаимодействие с высшими растениями 28
1.3.1. Ризосфера как среда обитания 28
1.3.2, Взаимодействие с высшими растениями 30
1.4. Спектр биологического действия ИУК 33
1.4.1. Фитогормональная функция ИУК 34
1.4.2. Роль бактериальной индолилуксусной кислоты 36
1.4.3. Биосинтез ИУК клетками прокариот 41
1.5. Механизмы адаптации клеток прокариот к воздействиям внешней среды 44
1.5.1. Общие механизмы адаптации к неблагоприятным воздействиям 44
1.5.2. Действие пестицидов на клетки прокариот 50
ГЛАВА 2. Материалы и методы 53
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 64
3.1. Выделение штаммов рода Azotobacter 64
3.2. Идентификация и культуральные признаки выделенных штаммов 65
3.3. Генетический анализ 67
3.4. Антибиотикорезистентность штаммов Azotobacter chroococcum 71
3.5. Дозозависимый эффект действия тетраметилтиурамдисульфида (ТМТД) на жизнеспособность клеток штаммов A. chroococcum 75
3.6. Активность роста и продукция индолил-3-уксусной кислоты штаммами A. chroococcum 80
3.7. Действие неблагоприятных факторов на физиологическую активность батерий A. chroococcum 97
3.7.1. Влияние повышенной температуры на активность роста бактерий Y4. chroococcum 97
3.7.2. Продукция ИУК клетками A chroococcum после действия повышенных температур 102
3.7.3. Временнозависимый эффект действия различных концентраций пестицида ТМТД на жизнеспособность и активность роста бактерий A. chroococcum 105
3.7.4. Воздействие ТМТД на активность продукции ИУК клетками A. chroococcum 109
Заключение 114
Выводы 122
Цитированная литература 123
- Биологичекая фиксация азота как общепланетарный процесс
- Влияние факторов внешней среды на характер роста бактерий рода Azotobacter
- Идентификация и культуральные признаки выделенных штаммов
- Активность роста и продукция индолил-3-уксусной кислоты штаммами A. chroococcum
Введение к работе
Актуальность проблемы. Микроорганизмам принадлежит ведущая роль в геохимических процессах круговорота биогенных элементов в водных и наземных экосистемах. Эти процессы прямо или косвенно влияют на газовый состав атмосферы Земли. Обеспечение сбалансированной деятельности природных микробных сообществ, несомненно, является ключевым условием поддержания жизни на Земле (Заварзин, 1979; Аристовская, 1985).
Деградация почвенных экосистем, динамическое уменьшение многообразия групп микроорганизмов (редуцентов), снижение не только количества, но и их физиологической активности, нарушение структуры биоценозов и биогеоценозов - последствия антропогенного воздействия (Самсонов, 1987; Использование биологических тестов..., 2003). В связи с вышеизложенным возрастает роль физиологически значимых микроорганизмов, в плане регуляции круговорота биогенных элементов (азота), таких как Azotobacter (Громов, Павленко, 1989; Заварзин, Колотилова, 2001).
В биосфере азотобактер осуществляет регуляцию важнейших процессов:
Эволюционно-значимого процесса фиксации молекулярного азота, вовлекая его в биологический круговорот.
Средообразующих - как за счет азотфиксации, так и за счет продукции биологически активных веществ (БАВ): витаминов группы В, гиббереллинов, цитокининов и ауксинов, а также фунгистатического антибиотика азохроомицина (Мишустин, Марьенко, 1965; Умаров, 1982; Шильникова, Серова, 1983; Кравченко и др, 1991; Zahir et al., 2004)
Интерес к азотфиксирующим микроорганизмам, в частности азотобактеру, обусловлен необходимостью перехода от химизации сельского хозяйства к биологизации, что требует современных представлений о физиологическом состоянии, адаптационных возможностях и механизмах штаммов рода Azotobacter.
В настоящее время основной активирующий эффект действия от применения азотобактера в качестве бактериального удобрения связывают не столько с его азотфиксирующей способностью, сколько с продукцией различных биологически активных веществ, в частности индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) (Татарова и др., 1965; Siddiqui, Mahmood, 2001; Zahir et al., 2004). До сих пор нет четких представлений о гетерогенности штаммов Azotobacter по активности продукции БАВ, в частности ИУК, и связи различий с другими параметрами физиологической активности штаммов, таких как активность рості* и интенсивность азотфиксации.
В почве, как среде обитания, микроорганизмы находятся под влиянием биогенных и абиогенных факторов, которые, несомненно, оказывают воздействие на их физиологическую активность, в том числе, на синтез БАВ микроорганизмами. Известно, что ауксины участвуют в развитии защитных реакций растений в ответ на стрессирующее воздействие, в частности тепловой шок (Веселов и др., 1998). В работе М. В. Симко (2002) показано, что снижение интенсивности накопления ИУК может нарушить механизмы адаптации м и кромицетов-деструкторов к действию различных стрессоров. В отношении роли ИУК, продуцируемой прокариотами, в ответ на неблагоприятное воздействие, сведений в литературе не встречается. К настоящему моменту сложилась концепция, исходя из которой роль продуцируемой микроорганизмами ИУК многообразна, начиная с проявления различных сторон взаимодействия с высшими растениями до организации своей экологической ниши (Мишке, 1988).
Цели и задачи исследования. Целью работы явилась оценка биоразнообразия штаммов Azotobacter chroococcum на основе выявления генетических, культуральных, биохимических различий, а также изучение физиологической активности азотобактера при экстремальных воздействиях.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: I. Выделить и идентифицировать штаммы рода Azotobacter из образцов различных типов почв Нижегородской области;
Изучить гетерогенность штаммов по культуральным, морфологическим и биохимическим признакам, выявить генетические различия на основе анализа структуры гена пі/И)
Провести сравнительный анализ активности роста штаммов Azotobacter и продукции ими ИУК;
Исследовать эффект действия экстремальных факторов (температура и пестицид) на жизнеспособность, активность роста и продукцию ИУК клетками A. chroococcum
Научная новизна работы. Выявлено биоразнообразие штаммов азотобактера, выделенных из различных типов почв Нижегородской области на основе анализа генетических, культуральных и биохимических характеристик.
Впервые показаны различия в первичной структуре гена nifli внутри группы микроорганизмов, относящихся к одному виду A. chroococcum.
Впервые выявлена связь между активностью роста штаммов азотобактера и уровнем продукции индолилуксусной кислоты.
Установлена гетерогенность выделенных штаммов в отношении действия различных концентраций пестицида тетраметилтиурамдисульфида (ТМТД).
Исследовано действие различных доз пестицида и теплового шока на активность роста клеток азотобактера. Установлены дозы экстремальных воздействий, приводящих культуру к состоянию стресса.
Впервые проведены наблюдения за изменением уровня продукции ИУК клетками A. chroococcum, свидетельствующие об увеличении ее секреции в условиях стресса.
Практическая значимость работы. Проведен сравнительный
анализ выделенных культур Azotobacter chroococcum, позволивший выявить активно растущие штаммы, штаммы с наибольшим уровнем секреции ИУК, штаммы, устойчивые к действию пестицида ТМТД. Полученные результаты обосновывают практическое применение бактериальных удобрений,
содержащих физиологически активные культуры Azotobacter chroococcum, адаптированные к конкретным условиям среды. Положения, выносимые на защиту.
Штаммы азотобактера, выделенные из разных типов почв Нижегородской области, различаются по фенотипическим и генотипическим признакам.
Уровень продукции ИУК азотобактером зависит от степени неблагоприятного воздействия и активности роста штамма.
Апробация работы. Основные положения и результаты работы были доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Эколого-экономические основы формирования агробиогеоценозов» (Н.Новгород, 2002); Всероссийской научно-практической конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков» (Ярославль, 2003); Съезде физиологов растений России (Пенза, 2003); III сессии молодежной школы - семинара «Экологическая и промышленная безопасность» (Саров, 2003); VII научно-практической конференции «Экологической образование и воспитание в Нижегородской области» (Н.Новгород, 2003); XI Нижегородской сессии молодых ученых (естественнонаучные дисциплины) (Н.Новгород, 2004); VIII международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пушино, 2004); VIII Всероссийского популяционного семинара «Популяции в пространстве и времени» (Н.Новгород, 2005); X Нижегородской сессии молодых ученых (естественнонаучные дисциплины) (Н.Новгород, 2005) Структура и объем диссертации.
Материалы диссертации изложены на 141 страницах машинописного текста, иллюстрированы 6 таблицами и 20 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 179 источников, из которых 54 иностранных.
Биологичекая фиксация азота как общепланетарный процесс
В окружающей среде азот находится в основном в двух формах: в виде газообразного азота атмосферы (N2), который составляет около 80% воздуха (по объему) и не усваивается большинством растений, и в виде различных органических и неорганических соединений, подавляющая часть которых сосредоточена в почве, морях и океанах, поэтому запасы азота практически неисчерпаемы (3,8x1015т). Связанный азот в почве представлен четырьмя видами соединений: азотом аммонийных солей (NH4+), азотом нитратов (N03 ), органическим азотом белков и продуктами их расщепления -аминокислот, пептидов, аминов, а также азотом гумуса (Мишустин, Шильникова, 1968, Шлегель, 1987; Nitrogenase gene diversity..., 2003).
В природных условиях большое значение для питания растений азотом имеют почвенные микроорганизмы, минерализирующие содержащийся в почве органический азот, превращая его, в конечном счете, в аммиак, являющийся тем исходным соединением, которое используют растении для синтеза аминокислот и белков (Кретович, 1972, 1987). Круговорот азота в природе можно представить следующим образом (рис. 1).
Основной путь пополнения дефицита азота в природе — азотфиксация. Азотфиксация - биохимический процесс, свойственный только прокариотам и обусловленный нитрогеназной системой, которая детерминируется трансмиссивной группой генов. Вследствие этого способность к азотфиксации оказывается распространенной среди самых разнообразных организмов: анаэробных клостридий, фотосинтезирутощих анаэробных бактерий, цианобактерий, аэробных органотрофных бактерий, симбиотических азотфиксирующих микроорганизмов, развивающихся в высших растениях. Субстратом для азотфиксации может служить практически любой процесс, дающий АТФ, и поэтому азотфиксация обнаружена за счет окисления водорода, метана, фотосинтеза, маслянокислого брожения, сульфатредукции, дыхания (Заварзин, 1979; Самсонов, 1987). Если сопоставить количество аммиачного и нитратного азота, попадающего в почву в результате небиологической фиксации, то есть фотохимических процессов и электрических разрядов в атмосфере, с его количеством, которое вносится в почву благодаря фиксации микроорганизмами, то становится совершенно очевидной исключительная важность последнего процесса (Шлегель, 1987).
Все известные нитрогеназы содержат два кислородчувствительных компонента, содержащихся в соотношении 2:1, азоферредоксин (Fe-белок, компонент II) и молибдоферредоксин (MoFe-белок, компонент I). Компонент I - это комплекс из двух а-субъедениц (массой примерно 50 кДа каждая), двух Р-субъедениц (примерно 60 кДа каждая), 24 молекул железа и двух молекул молибдена. Каждая пара аР-субъедениц содержит комплекс двух металлокластеров Р-кластер и железомолибденовый кофактор, обозначаемый FeMoCo (Глик, Пастернак, 2002; Burris, 1991; Halbleib, Ludden, 2000; Rubio, Ludden, 2005). Р-кластер и FeMoCo расположены на поверхности макромолекулы MoFe-белка. FeMoCo выполняет каталитическую и структурную функцию, объединяя мономеры MoFe-белка в димеры, участвует в формировании активного АТР-связывающего центра нитрогеназы (Исследование структуры Fe-Mo-кофактора..., 1981; Молибдокофакторы..., 1981; Rubio, Ludden, 2005). Компонент II состоит из двух а-субъедениц (примерно 32 кДа каждая) и неизвестного числа молекул железа, причем его а-субъеденицы не аналогичны таковым в компоненте I.
Для фиксации азота необходимы оба компонента, комплекс магния и ATP, а также источник восстановительных эквивалентов (ферредоксина и флаводоксина): N2 + ЮН + 8е "+ nMgATP- 2 NH3 + Н2Т + nMgADP + nPi (n 16) (Halbleib, Ludden, 2000)
Компонент I катализирует собственно восстановление N2, а компонент II служит донором электронов (Биологическая фиксация азота в лесных..., 1980; Готтшалк, 1984; Глик, Пастернак, 2002; Rubio, Ludden, 2005). Восстановленный ферредоксин и флаводоксин переносит электроны на азоферредоксин. При избытке энергии, выделяющейся в результате гидролиза АТР, потенциал окислительно-восстановительных групп фермента продолжает понижаться, приводя, в конце концов, к образованию супервосстановленного молибдоферредоксина, который связывает N2. Что, по-видимому, происходит путем внедрения N2 в две металл-водородные связи, образованные при участии молибдена.
Каждая из входящих в состав нитрогеназы субъедениц имеет участок связывания АТР, и гидролиз АТР сопровождается как образованием супервосстановителя, так и восстановлением субстрата.
Влияние факторов внешней среды на характер роста бактерий рода Azotobacter
Значение рН среды
Азотобактер чрезвычайно требователен к реакции среды. Бактерии этого рода тяготеют к нейтральным почвам и плохо переносят подкисление (Мишустин, Шильникова, 1968; Мишустин, 1975; Колешко, 1981).
Зона рН, при котором происходит развитие азотобактера, может несколько смещаться в зависимости от состава среды и других факторов. Так на связанном азоте азотобактер может расти в более кислой среде, чем на молекулярном азоте. Можно считать, что азотобактер способен развиваться на средах, имеющих диапазон рН от 4,5 до 9,0. Однако процесс азотфиксации происходит в более узком интервале 5,5-7,2 (иногда 7,7). Штаммы азотобактера, выделяемые из почв с разными значениями рН, по данным многих исследователей, по-разному реагируют на рН питательной среды (Мишустин, 1975, Колешко, 1981).
Повышенная кислотность и щелочность отрицательно сказывается на интенсивности потребления энергетического материала и продуктивности азотфиксации. Физиологические и биохимические процессы протекают весьма неравномерно: чрезвычайно слабо в сильнокислой среде (рН 5,05-5,29), удовлетворительно в слабокислой и сильнощелочной (рН 5,8 и 9,12), относительно хорошо при рН 8,05-8,29 и наиболее интенсивно при 7,2-7,4 (Мишустин, Шильникова, 1968; Колешко, 1981; Дарзниек, 1982). Уровень аэрации
Рассматривая кислородный режим, необходимый азотобактеру, следует отметить, что данный микроорганизм является аэробом. Аэрация, как отмечают многие исследователи, благоприятствует размножению азотобактера (Хмель и др., 1965; Мишустин, Шильникова, 1968). Вместе с тем установлено, что азотобактер может размножаться и в микроаэрофильных условиях. При слишком высоком уровне аэрации может наблюдаться уменьшение накопления биомассы (Хмель и др., 1965). Влажность
Азотобактер является организмом, предъявляющим высокие требования к влажности почвы, Доммергес нашел, что потребность азотобактера во влаге аналогична потребностям высших растений. При осмотическом давлении около 4,0 атм развитие азотобактера прекращается. Доммергес отнес его к группе гигрофилов. Большая влаголюбивость отмечается и в других исследованиях (Мишустин, Шильникова, 1968; Мишустин, 1975). Это делает понятным зависимость во многих случаях динамики численности азотобактера в почве от ее влажности. Глубина проникновения азотобактера в почву также определяется в значительной степени обеспеченностью почвы влагой (Мишустин, Шильникова, 1968; Колешко, 1981). Температура
В отношении температуры азотобактер является типичным мезофилом. Положение оптимальной температурной точки развития может несколько меняться в зависимости от состава и рН среды. Большинство исследователей указывают, однако, на 25-30С как на оптимальную температурную зону развития этой бактерии (Мишустин, Шильникова, 1968; Колешко, 1981). Понижение температуры азотобактер переносит хорошо, и поэтому в зимний период, даже в северных широтах, численность его клеток заметно не уменьшается. Вегетативные клетки азотобактера не выносят высокие температуры (Мишустин, Шильникова, 1968). По данным О. И. Колешко (1981) даже пятиминутное прогревание культуры при 40С приводит к гибели до 15-20% клеток, при 50С отмирание клеток составляет до 30%. При увеличении экспозиции прогревания до 30 мин практически не оставалось жизнеспособных клеток. Минеральный состав почвы
Большое влияние на развитие азотобактера в почве и азотфиксацию оказывает минеральный состав почвы. Так, недостаток фосфора ингибирует рост и снижает жизнеспособность Azotobacter chroococcum (Dalton, Postgate, 1969). Может нарушаться структура клеточной стенки и, на примере Azotobacter vinelandii, было показано, что клетки становятся неспособными формировать цисты (Tsai et al, 1979).
Отличительной особенностью бактерий рода Azotobacter является их высокая требовательность к наличию в среде микроэлементов. Совершенно необходим для большинства культур молибден (Мишустин, Шильникова, 1968). Биохимические процессы с участием молибдена можно разделить на 3 группы;
1. Действие молибдена на ферментативные процессы восстановления нитратов, нитритов и гидр оке ил амина до аммиака и биосинтез аммиака. Фермент альдегиддегидрогеназа содержит одновременно один атом молибдена и 4 атома железа на молекулу фермента.
2. Участие фермента в симбиотической и несимбиотической фиксации азота микроорганизмами. Молибден участвует в переносе электронов, входит в состав ферментов оксидоредуктаз. Этот элемент образует комплексные соединения, участвующие в активации молекулярного азота. Фермент молибдоферредоксин содержит 1 атом молибдена на молекулу фермента плюс определенные количества железа.
Идентификация и культуральные признаки выделенных штаммов
Для выявления биоразнообразия бактерий рода Azotobacter и взаимосвязи биоразнообразия с особенностями почв собрано 36 образцов почв Нижегородской области. 19 образцов почвы взяты с окультуренных огородных участков, 17 - представлены неокультуренными почвами разных типов: №1 Чернозем оподзоленный (Арзамасский район) №2 Светло-серая лесная (Вадский район) №3 Серая лесная (Дальне-Константиновский район) №4 Темно-серая лесная (Арзамасский район) №5 Подзолистая почва (Дзержинский район) №6 Дерново-карбонатная (Дальне-Константиновский район) №7 Серая лесная (Дальне-Константиновский район) №8 Болотно-черноземная (Дальне-Константиновский район) №9 Дерново-подзолистая (Сосновский район д. Бочиха) №10 Выщелоченный чернозем (Дальне-Константиновский район) №11 Подзолистая (Сосновский район д. Бочиха) №12 Дерново-подзолистая (Сосновский район) №13 Пойма реки Сережа (Арзамасский район) №14 Болотно-подзолистая (Сосновый лес, п. Пыра, Дзержинский район) №15 Болотная (Верховое болото, п. Пыра, Дзержинский район) №16 Пойма озера Великое (п. Пустынь, Арзамасский район) №17 Подзолистая почва, образованная на суглинках (Уренский район)
Метод почвенных комочков для выделения культур азотобактера наиболее приближен к естественным условиям обитания, поэтому дает наилучший результат, что также отмечено в исследованиях L. Aquilanti et al. (2004). Из образцов почв нами выделено 20 диких штаммов бактерий рода Azotobacter. В 16 образцах, взятых с огородных участков, регистрировалось наличие значительного числа клеток азотобактера. Вокруг всех комочков почвы этих образцов на среде Эшби образовывались колонии азотобактера. В трех образцах почв, взятых с огородных участков, бактерий рода Azotobacter обнаружено не было. Из 17 проб неокультуренных почв клетки азотобактера присутствовали только в четырех образцах, в которых степень обрастания комочков почвы колебалась в пределах от 25 % и до 92,3 % в зависимости от типа почв. Наибольшая степень обрастания была обнаружена в образцах, полученных из черноземных типов почв: чернозем оподзоленный и чернозем выщелочный — 92,3 % и 85,7 %, соответственно, В образцах, полученных из темно-серой лесной и серой лесной, степень обрастания была равна 78,9 % и 25 %, соответственно. В дерново-подзолистых, подзолистых, светло-серых лесных, болотно-подзолистых, в почвах пойменных лугов реки Сережи клетки азотобактера обнаружены не были.
Полученные результаты согласуются с данными литературы (Виноградский, 1952; Мишустин, Шильникова, 1968; Шильникова, Серова, 1983; Звягинцев, 1987; Громов, Павленко, 1989) и еще раз подтверждают тот факт, что азотобактер достаточно требователен к условиям среды обитания. Чернозем, темно-серая и серая лесная наиболее соответствуют тем типам почв, которые создают азотобактеру условия, необходимые для роста.
По фенотипическим характеристикам, то есть по комплексу ключевых морфологических и биохимических признаков, а также по генетическим характеристикам все выделенные штаммы были отнесены к роду Azotobacter, виду Azotobacter chroococcum. Как видно на таблице 4, размеры клеток отличались незначительно у разных штаммов. Окраска пигмента варьировала от светло-коричневой до почти черной, что может наблюдаться у штаммов бактерий, относящихся к данному виду, как отмечается Колешко (1981). Практически все штаммы на вторые сутки культивирования образовывали на плотной среде достаточно крупные, слизистые, бесцветные колонии до 7 мм в диаметре. По мере старения колонии становились еще более слизистыми, и растекались по поверхности агара. Образование пигмента происходило на 5-е сутки культивирования.
Были выявлены штаммы, отличающиеся по культуральным признакам. Так, у штамма № 6 формировались колонии, имеющие значительно меньший размер (1-2 мм в диаметре). Колонии имели правильную округлую форму, были менее слизистыми, не растекающимися по поверхности. Клетки образовывали светло-коричневый пигмент на пятые сутки культивирования. Культура штамма № 10 образовывала плоские, достаточно крупные (5-7 мм в диаметре) колонии неправильной округлой формы. Клетки выделяли очень мало слизи. Образование пигмента наблюдалось уже на третьи сутки культивирования.
Активность роста и продукция индолил-3-уксусной кислоты штаммами A. chroococcum
Активность роста микроорганизмов - одна из основных физиологических характеристик культуры, отражающая скорость и уровень нарастания биомассы. Известно, что азотобактер в процессе роста проходит определенные стадии клеточного цикла, сопровождающиеся морфологическими изменениями. В молодом возрасте клетки имеют вид коротких толстых палочек с закругленными концами, часто встречаются делящиеся клетки или сочетания уже разделившихся. Слизистая капсула вначале тонка или отсутствует, поэтому в скоплениях клетки плотно прилегают друг к другу, часть молодых клеток подвижна. С увеличением продолжительности роста клетки укорачиваются и становятся круглыми, при недостаточном питании покрываются слизистой капсулой, часто деление клеток продолжается и после их капсулирования, в этом случае образуются сарциноподобные пакеты. Стадия цисты считается стадией покоя. Клетки бактерий на этой стадии более выносливы к различным неблагоприятным условиям и, особенно, к высыханию (до 10 лет). При высеве на свежие питательные среды капсульные клетки прорастают, капсула лопается и через разрыв выходит короткая палочка с тонкой оболочкой. При неблагоприятных условиях роста, особенно в старых культурах, клетки азотобактера дают инволюционные формы самых причудливых очертаний: чаще всего в виде длинных раздутых нитей, иногда в виде амеб или дрожжевых клеток (Колешко, 1981). Однако, в литературе нет сведений о том, какой фазе роста азотобактера соответствует определенная стадия клеточного цикла. В связи с этим, на примере штамма № 6 нами было проведено сравнительное изучение стадий клеточного цикла и фаз роста A, chroococcum в процессе культивирования на безазотной питательной среде Берка.
Для изучения особенностей клеточного цикла A. chroococcum в процессе роста и развития готовили препараты живых («висячая капля») и фиксированных клеток. Исследования проводили в динамике, с отбором проб через каждые 2 часа. В результате был прослежен цикл развития данного микроорганизма и установлена продолжительность каждой стадии во времени: 1 стадия - формирование крупных, одиночных, палочковидных клеток (0 14 часов); 2 стадия - постепенное округление палочковидных клеток и формирование скоплений, окруженных слизью (14-48 часов); 3 стадия - распад скоплений и образование слизистых капсул, содержащих по 2 шаровидные клетки (48-70 часов); 4 стадия - формирование цист (начиная с 70 часов)
Параллельно с изучением особенностей клеточного цикла, исследовалась динамика численности клеток A. chroococcum для определения фаз роста культуры.
По результатам исследований построена кривая роста для данной культуры - штамм № 6 (рис. 7). Численность клеток по отдельным фазам составила: в лаг-фазе (до 14 часов) - до 7 х 106 кл/мл в экспоненциальной (14-48 часов) — до 90x10 кл/мл в стационарной (с 48 часов) - до 110x10 кл/мл
Определив динамику численности клеток в процессе роста и временные интервалы каждой фазы, получили модель, на основе которой сопоставляли стадии клеточного цикла с фазами развития культуры. В итоге, лаг-фазе (0-14 часов) соответствовали клетки, имеющие вид одиночных крупных палочек. В экспоненциальной (14-48 часов) все клетки округлялись, активно делились и формировали скопления. При переходе в стационарную фазу (с 48 часов) клеточные скопления распадались и образовывали слизистые капсулы вокруг двойных шаровидных клеток.
На следующем этапе работы проведено сравнение активности роста различных штаммов. Были взяты штаммы № 6, 10, 15, выделенные из окультуренных почв и штаммы № 11, 12, 14 и 20, полученные из целинных почв различных типов.
Наибольшей активностью роста отличался штамм № 6 (рис. 8, А). Остальные культуры характеризовались очень слабым накоплением биомассы, максимальное значение ОП наблюдалось у штамма № 10 и составило 0,96, по сравнению со штаммом № 6, у которого значение ОП составило 1,9 к 48 часам культивирования. Для стимуляции роста в среду культивирования вносили экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) в концентрации 0,5 г/л.
Динамика роста микроорганизмов в этих условиях представлена на рис. 8, В. Штамм № 10 характеризовался быстрым приростом биомассы в первые часы культивирования, однако уже к 24 часам культура переходила в стационарную фазу роста, и к 48 часам изменения уровня биомассы не происходило. Таким образом, данный штамм отличался достаточно быстрым темпом прохождения фаз роста, накапливая при этом небольшую биомассу. Представленный характер роста хорошо сопоставим с характером роста данной культуры на плотной среде, когда образование пигмента происходило уже на 3 сутки культивирования, что свидетельствовало о быстром старении культуры.
По сравнению со штаммами № 6 и № 10 штаммы № 15, 14, 12, 20 характеризовались более длительной лаг-фазой (рис. 8, В). Ростовая динамика штамма № 11, выделенного из серой лесной почвы, отличалась очень слабым уровнем накопления биомассы по сравнению со всеми остальными культурами, как при культивировании на среде с добавлением ЭКД, так и на среде без ЭКД.
Похожие диссертации на Физиолого-биохимическая активность и биоразнообразие штаммов Azotobacter Chroococcum, выделенных из почв Нижегородской области
