Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Получение и свойства индуцированных мутантов холерного вибриона 9
1. Алкилирующие агенты, механизм действия нитроэо-гуанидина 9
2. Получение мутантов холерного вибриона и изучение их свойств 15
3. Использование мутантов холерного вибриона для генетического анализа .34
Собственные исследования 40
ГЛАВА II. Материалы и методы 40
1. Штаммы и препараты 40
2. Методики 43
ГЛАВА III . Получение множественно маншрованных мутантов холерного вибриона 50
1. Подбор оптимальных условий воздействия нитрозо-гуанидина на клетки холерного вибриона с целью получения мутантов 50
2. Моноауксотрофные мутанты холерного вибриона и их идентификация 55
3. Полиауксотрофные мутанты холерного вибриона классического биовара . 58
4. Полиауксотрофные мутанты холерного вибриона биовара Эль Тор . 73
5. Получение антибиотикоустойчивых штаммов холерного вибриона . 80
6. мутанты холерного вибриона, с измененной продукцией токсина 83
7. Мутанты холерного вибриона с нарушенным синтезом О-антигена 87
8. Получение мутантов холерного вибриона, продуцирующих меланин и гемолизин; изучение их свойств 93
ГЛАВА ІV . Изучение возможносги использования множественно маркированных мутантов для картирования хромосомы холерного вибриона 100
I . Определение частоты передачи селектируемых маркеров при скрещивании донорного штамма с полиауксотрофными реципиентами 100
2. Определение положения некоторых маркеров на хромосоме холерного вибриона по сцепленности не-селектируемых маркеров с селектируемыми 103
Заключение 108
Выводы 116
Литература 118
- Алкилирующие агенты, механизм действия нитроэо-гуанидина
- Штаммы и препараты
- Подбор оптимальных условий воздействия нитрозо-гуанидина на клетки холерного вибриона с целью получения мутантов
- . Определение частоты передачи селектируемых маркеров при скрещивании донорного штамма с полиауксотрофными реципиентами
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Начавшаяся в 1961 году седьмая пандемия холеры продолжается и в настоящее время. За этот период холера проникла во все регионы мира, вызывая вспышки и эпидемии различной интенсивности. За период 1970-1982 годов в Европейском регионе было поражено холерой 15 стран, выявлено более 6222 больных (Иванов В.А., Шмеркевич Д.Л., Кологоров А.И. и др., 1983). В последние годы холера постоянно регистрируется в некоторых странах, имеющих водные и сухопутные границы с СССР, что создает опасность заноса инфекции.
Таким образом, проблема холеры продолжает в настоящее время оставаться актуальной, как для отдельных государств, так и для всего человечества.
Особенностью течения пандемии последних лет является выраженная изменчивость возбудителя холеры, позволяющая ему приспосабливаться к новым условиям обитания. У выделяемых из объектов внешней среды и от больных людей штаммов холерного вибриона наблюдается изменчивость морфологических, биохимических и антигенных свойств, признаков биовара, вирулентности и патогенности. Причиной многих эпидемий являются штаммы холерного вибриона, получившие устойчивость как к отдельным антибиотикам, так и несущие факторы множественной лекарственной устойчивости ( Hedjes
R.W,, Viaiard J.b., Pearson її.J. et al., 1977; Glass R.I., Hug M.I., bee J.V. et al., 1983; Sundaram S.P., Murpby K.V.,
1984).
Появление штаммов с измененными свойствами, значительно затрудняющее своевременную диагностику и организацию эффективных профилактических и противоэпидемических мероприятий, требует углубленного исследования механизмов этой изменчивости. Законо-
мерности проявления наследственности и изменчивости, протекающие в природе, могут быть изучены на модели мутантов, полученных в лабораторных условиях. Наличие большого числа различных мутантов позволяет решать такие проблемы, как изучение метаболических путей, картирование различных генов, исследование строения белков и регуляции их продукции, анализ генетических основ патогенности и вирулентности.
В отечественной литературе опубликован ряд работ о получении индуцированных ауксотрофных мутантов холерного вибриона, нуждающихся в различных факторах роста (Мартиневский И.Л., Стогова А.Г., 1973; Рощин В.В., Степанов В.М., Куница Н.К., 1974; Юсупов А.А., Домарадский И.В., Рапопорт И.А. и др., 1973; Валлама-тов СТ., 1980). Получены мутанты с измененной продукцией факторов вирулентности (Ливанова Л.Ф., Гончарова Н.С, 1982; Смирнова Н.И., Ильина Т.С., Смирнов Г.Б., 1982) и антибиотикоустой-чивые мутанты (Уралева B.C., Воронежская Л.Г., Фецайлова О.П. и др., 1972; Фецайлова О.П., Уралева B.C., 1976а; Фецайлова О.П., Помухина О.И., 1977). Однако описанные мутанты холерного вибриона несут не более одной-двух, в редких случаях трех мутаций по генам факторов роста. Мутанты по факторам вирулентности или резистентные к антибиотикам обычно не являются полиауксотрофами, свойства их недостаточно охарактеризованы. Между тем, знание фенотипических свойств мутантов может дать представление об особенностях функционирования определенных генов. Для проведения эффективных и всесторонних генетических исследований возбудителя холеры, в частности, для картирования его хромосомных генов необходимо наличие полимаркированных мутантов, несущих наряду с потребностями в шести-семи факторах роста также мутации по различным детерминантам вирулентности. Такие множественно
маркированные штаммы получены за рубежом, но они мало доступны для отечественных исследователей.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ- заключалась в создании коллекции множественно маркированных штаммов холерного вибриона и изучении возможности их использования для картирования отдельных хромосомных генов.
ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Подобрать оптимальные условия обработки нитрозогуанидином штаммов холерного вибриона классического и Эль Тор биоваров, дающие высокий выход ауксотрофных мутантов.
Получить полиауксотрофные мутанты холерного вибриона обоих биоваров, несущие мутации в генах синтеза различных факторов роста: аминокислот, оснований, витаминов; выделить антибиотико-устойчивые варианты полиауксотрофных мутантов.
Выявить среди полиауксотрофных мутантов холерного вибриона штаммы с измененной продукцией токсина, 0-1 соматического антигена и гемолизина, дать их подробную фенотипическую характеристику.
Определить возможность использования полученных множественно маркированных мутантов в экспериментах картирования хромосомы холерного вибриона.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА.
I. Разработан эффективный метод получения полимаркированных штаммов холерного вибриона, на первом этапе использования которого последовательным многократным воздействием нитрозогуани-дина получают полиауксотрофные мутанты изучаемых штаммов, несущие до восьми зависимостей от факторов роста; на втором этапе из полиауксотрофных штаммов выделяют мутанты, устойчивые к антибиотикам и имеющие нарушения в синтезе факторов вирулентности и иммуногенности-токсина, 0-1 соматического антигена, гемолизина.
Впервые в стране создана коллекция полимаркированных штаммов классического и Эль Тор биоваров, которая может служить основой генетического и молекулярно-биологического анализа возбудителя холеры. Изучение свойств мутантов по продукции гемолизина дало основание предположить общий механизм регуляции генов, ответственных за синтез гемолизина и меланина.
Использование полимаркированных штаммов в экспериментах конъюгационного переноса позволило определить локализацию 12 генов на хромосоме холерного вибриона, два из них картированы впервые.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ работы заключается в следующем:
Депонированы в музее живых культур ВНИПЧИ "Микроб" и могут быть использованы в качестве реципиентов в экспериментах по конъюгации восемь антибиотикоустойчивых полиауксотрофных штаммов холерного вибриона.
Составлены методические рекомендации "Получение мутантов холерного вибриона с измененной продукцией токсина", одобренные Ученым Советом института "Микроб" (протокол № 10 от б июня 1984 года) и утвержденные директором института 9 июня 1984 года.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты диссертационного исследования доложены на Всесоюзной школе - семинаре молодых ученых и специалистов противочумной системы по молекулярной генетике в г.Марк-се в 1982 году; на научной конференции института "Микроб", посвященной ИЗ годовщине со дня рождения В.И.Ленина в 1983 году; на Всесоюзной конференции по молекулярной биологии, генетике и иммунологии возбудителей особо опасных инфекций в г.Ростове-на-Дону в 1984 году.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСЯЩИЕСЯ НА ЗАЩИТУ.
I. Путем оптимизации условий обработки штаммов холерного ви-
бриона нитрозогуанидином (доза 100-150 мкг/мл, 3-4-часовая бульонная культура, рН 5,5) получен высокий выход мутантов, достигающий 3,8-15$.
Для создания множественно маркированных штаммов целесообразно получать полиауксотрофные мутанты под действием нитрозо-гуанидина с последующим отбором среди них клонов с нарушенной продукцией факторов вирулентности и иммуногенности.
Полученные полиауксотрофные ідутантн могут быть использованы в качестве реципиентов в экспериментах по конъюгации с целью картирования хромосомы возбудителя холеры.
Алкилирующие агенты, механизм действия нитроэо-гуанидина
Первые химические мутагены были открыты более сорока лет назад и с тех пор стали широко применяться в генетических исследованиях. Наибольший интерес среди них представляют алкилирующие агенты, переносящие алкильные группы на биологически важные молекулы в физиологических условиях. В 1939 году И.А.Рапопорт (1948) впервые доказал исключительно высокую мутационную активность этиленимина. Позже было обнаружено, что такими же свойствами обладают иприт, этиленоксид, диэпоксибутан, этилметансуль-фонат, метилметансульфонат, нитрозогуанидин и другие. Все они отличаются типом переносимых алкильных групп (метильная, этиль-ная и т.д.) и числом алкильных групп, которое может отдавать одна молекула алкилирующего агента, то есть функциональностью.
Механизм действия алкилирующих соединений будет рассмотрен нами на примере нитрозогуанидина, относящегося к классу нитрозо-соединений. Его мутагенные свойства были открыты в I960 году ( Mandell J#D., Greenberg J», I960). Нитрозогуанидин ( СН-ІГ(Ж )С(!Щ)ВШ02 ) - мощный супермутаген, позволяющий получить большое количество мутаций при относительно низком леталь ном эффекте. Стабильность нитрозогуанидина в буфере зависит от температуры, рН, ионной силы и других факторов. Его наибольшая устойчивость наблюдается при рН 5,0 ( Oerda-Olmedo Б,, Haaawalt Р.С., 1967) - 5,5 (Mandell J.D.P Greenberg J,, I960). При высоких концентрациях водородных ионов (рН 3,0) нитрозогуанидин разлагается с образованием больших количеств IT -метил- н»-нит-розогуанидина и азотистых радикалов, которые быстро превращаются в азотистую кислоту ( McKay A.F., Wright G.F., 1947). В сильно щелочных растворах (рН 13-14) нитрозогуанидин образует 72,6$ диазометана ( McKay А.Р., 1948), однако, при рН 4-8 этот продукт разложения не определяется. При рН 6-9 продуктами разложения нитрозогуанидина являются соли нитроцианамидов и алкил-диазогидроксид ( bawley P«D,t Thatcher С»J., 1970). В прошлом многие исследователи считали, что диазометан ( СН2ш2 ) представляет собой то промежуточное соединение, которое отвечает за реакцию метилирования, свойственную нитрозогуанидину ( Cerda-Olmedo Е«, Hanawalt P.С, 1968a). Однако, использование изотопов позволило показать, что промежуточным алкилирующим соединением является ион диазония CH-Hg, а его предшественником -алкилдиазогидроксид ( bawley P.D», 1974; Osterman-Golkar S., 1974).
Нитрозргуанидин также, как нитрозометилмочевина ( Osterman-Golkar S., 1974) и другие нитрозосоединения ( Lawley P.D., Brookes Р», 1963; Singer В., 1975) реагирует с нуклеофильны-ми центрами ДНК. Наиболее значительные повреждения ДНК, вызыва-емые нитрозогуанидином, заключаются в образовании 0 -метилгуани-на ( Nagato С., Takeda Е., Aida М., 1982). Количество образованного 0 -метилгуанина, приобретающего благодаря ионизации тенденцию к спариванию с тимином вместо цитозина, и скорость его вырезания определяют число традиционных мутаций типа ГЦ AT ( Lawley P.D., 1974). Некоторые другие алкилированные основания, такие как 7-метилгуанин и 3-метиладенин могут спонтанно утрачиваться ДНК. Кроме того большинство алкилированных оснований вырезается из ДНК со скоростью более значительной, чем спон - II тайная ( Samson L., Cairns J., 1977; Karran P., Idndahl Т., Griffin В., 1979; Karran P., at evens s.t Sedwick В., 1982; Morohoshi P., Munakata H.f 1983). И спонтанная, и ферментативная утрата алкилированных оснований обуславливает нестабильность сахарофосфатной связи с соседним нуклеотидом, что приводит к разрыву цепи ДНК. Чаще всего разрыв сахарофосфатной цепи будет приводить к летальным последствиям и лишь иногда может \[ обуславливать крупные перестройки, в то время как депуринизация может вызывать образование мутаций. Ярко выраженный мутагенный эффект депуринизации описан рядом авторов ( Kreig D.R., 1963; W&tson W.A.F., 1966). Потеря основания при следующем акте репликации может приводить к заполнению бреши любым из оснований. Возможность образования таким образом транзиций и трансверсий была подтверждена E.B.Freeze (1961) и J.Wnitfield, R.G.Martin, B.H.Ames (1969). Нитрозогуанидин способен также вызывать сдвиг рамки считывания и вызывать другие перестройки ДНК ( Your-no J., Heatn S., 1969).
Обычно выделяют два типа механизмов мутагенеза. Согласно первому мутации возникают из-за ошибок репликации, а в соответствии со вторым - благодаря системе репарации, способной допускать ошибки ( error prone repair system ). Показано, что у E.coli и H.influenzae индукция мутаций под действием нитро-зогуанидина происходит независимо от такой системы репарации ( Jeggo P., Defais М», Samson L. et al., 1977; Kimball R P., Boling II.E., Perdue S.W., 1977). Так у E.coli нитрозогуанидин индуцирует одинаковое число мутаций в Rec -, ЕХГ" -клетках, клетках дикого типа и Uvr"-мутантах ( Ishii Y.t Kondo s., 1965). Однако, данные некоторых экспериментов на фагах говорят в пользу индукции нитрозогуанидином системы репарации, способной допускать ошибки ( Kondo a., Isnikawa Н., 1973; Yamamoto К», Kondo S., Sugixmira Т., 1978).
Нитрозогуанидин способен активно взаимодействовать с белками системы синтеза ДНК и вызывать ингибирование этого синтеза ( Cerda-Olmedo В., Hanawalt Р. С, 1967). В системе in vitro нитрозогуанидин инактивирует полимеразную и экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы Ш ( Jimenez-Sanchez А», Cerda-Olmedo Е., 1975). По мнению авторов, эта инактивация может быть причиной остановки под действием нитрозогуанидина продвижения точки репликации in vivo и индукции мутаций преимущественно в этом участке. У Pol А1 -мутанта E.coli после обработки нитрозо-гуанидином in vivo обнаружены изменения ДНК-полимеразы Ш и одновременно пятикратное возрастание активности ДНК-полимеразы П, которое происходит сразу же после обработки ( Miyaki Ы., Sai G., Katagiri S. et al.t 1977). Нитрозогуанидин также модифицирует ДНК-полимеразу I ( Miyaki М., Suzuki К,, Aihara н et al., 1983).
Штаммы и препараты
Штаммы. В работе использовали шесть штаммов холерного вибриона - три штамма классического биовара (569В, RV 31 и KB46G) и три штамма биовара Эль Тор (218, RV 79 и КМ605). Характеристика штаммов представлена в таблице I.
Среды и химические реактивы. В качестве полноценных сред применяли бульон Хоттингера, BHJ -( Dlfco ), казаминовый ( Difoo ) и синказный ( Finkelstein R.A., Atthasampunna P., Chulasamaya M. et al. , 1966) бульоны (pH 7,6), агары Хоттингера и BHI (рН 7,6). Для приготовления синказного агара использовали агар Noble (Difoo). Минимальной твердой средой служила глюкозо-солевая среда ( Bhaskaran К,, Rowley D., 1956), приготовленная на основе агара Difco.
Аминокислоты ( Reanal, Oalbioohem, Serva, Merck ) добавляли в концентрации 40 мкг/мл. Концентрации антибиотиков (отечественное производство) составляли: стрептомицина - 100 мкг/мл, канамицина - 25 мкг/мл, рифам-пицина - 50 мкг/мл, налидиксовой кислоты - 20 мкг/мл. При получении мутантов использовали и-метил-н -нитро-N-нитрозогуанидин ( Serva ), буферы: 0,1 М цитратный (рН 5,5) и 0,1 М фосфатный (рН 7,0) (Миллер Д., 1976). Для определения продукции токсина применяли комплемент морской свинки (Пермский институт вакцин и сывороток) и антитоксическую кроличью сыворотку, полученную против очищенного токсина, имеющего титр в кожной пробе Крейга 1:1000000. Титр сыворотки в реакции преципитации с холерным токсином составлял 1:32-1:128. Мутагенез и идентификация мутантов. В качестве мутагена использовали нитрозогуанидин в концентрации 100-150 мкг/мл. Обработку клеток холерного вибриона проводили ПО методу E.A.Adelberg, M.Mandel, G.О.С.Chen (1965). Штаммы выращивали в течение трех-четырех часов в бульоне Хоттингера при 37С в условиях интенсивной аэрации (конечная концентрация клеток составляла 10у в мл), однократно отмывали в цитратном буфере, суспендировали в нем до исходного объема и добавляли необходимое количество нитрозогуанидина. Смесь инкубировали на водяной бане при 37С в течение 30 минут. Отмытые фосфатным буфером клетки суспендировали в исходном объеме бульона или физиологического раствора и высевали на полноценную твердую среду по 0,1 мл в соответствующем разведении для получения изолированных колоний. Выросшие колонии наносили методом отпечатков на полноценный и соответствующий минимальный агар. Ауксотрофные мутанты определяли по их неспособности расти на минимальной среде. Питательные потребности мутантов идентифицировали по схеме Холлидея методом реплик ( Holliday R.A., 1956).
Частоту возникновения мутантов определяли как отношение числа полученных мутантов к общему числу проверенных клеток, подвергнутых действию нитрозогуанидина. Определение частот реверсии мутант о в. У выделенных ауксотрофных мутантов определяли час - 44 тоты реверсии полученных признаков. Для этого по 0,1 мл суспензии клеток концентрацией Ю9 кл/мл 18-часовой агаровой культуры мутанта высевали в ряде разведений на минимальную среду, содержащую все необходимые питательные вещества, и такую же среду, из которой исключен тот фактор роста, реверсия по которому проверяется. Отношение числа клеток, выросших на неполной минимальной среде, не содержащей данного фактора роста, к числу клеток на полной среде составляет частоту реверсии полученного признака. Мутанты, реверсия которых превышала 10 , как правило, в дальнейших экспериментах не использовали.
Получение антибиотикоустойчивых мутантов. Для получения антибиотикоустойчивых мутантов холерного вибриона производили высев 10 -10 А клеток изучаемого штамма на агар Хоттингера, содержащий либо 100 мкг/мл стрептомицина, либо 50 мкг/мл рифампицина или 20 мкг/мл налидиксовой кислоты. Выросшие на агаре с антибиотиком изолированные колонии повторно рассевались на этой же среде. Отбирали клоны, стабильно сохраняющие устойчивость к антибиотику.
Определение продукции токсина осуществляли тремя способами: методом радиального пассивного иммунного гемолиза, определением фактора кожной проницаемости и выявлением холерогенности в петле кишечника кролика. а) Метод радиального пассивного иммунного гемолиза( Bramucoi M.G., Holmes R.K., 1978). В работе использовали 0,5 и 1% синказные агары, содержащие 5 и 10 грамм агара Hoble на литр синказного бульона. Во все синказные среды добавляли 5 грамм сахарозы на литр. Синказный кровяной агар готовили, добавляя I объем дважды отмытых и суспендированных в синказном бульоне бараньих эритроцитов - 45 к 5 объемам растопленного до 55С 1% синказного агара. Пять мл кровяного синказного агара наслаивали на пластинку (10 мл) 1% синказного агара, давали застыть и на его поверхность методом отпечатков при помощи штампа наносили изучаемые культуры. Параллельно делали отпечаток на агар Хоттингера. При проверке продукции токсина у ауксотрофных мутантов в кровяной синказный агар добавляли необходимые факторы роста. Чашки инкубировали при 30 и через 18-24 часа заливали сверху 5 мл 0, синказного агара, содержащего 0,1 мл кроличьей антитоксической сыворотки, 0,8 мл цельного комплемента морской свинки и 0,2 мл азида натрия исходной концентрации 40 мкг/мл. Чашки инкубировали два-три часа при 37С. Вокруг макроколоний, продуцирующих токсин, наблюдали образование круговых зон гемолиза. б) Определение фактора кожной проницаемости ( Creig JYP., 1965). Клетки исследу емых штаммов выращивали в казаминовом бульоне при 37С в тече ние 18 часов в условиях интенсивной аэрации, а затем центрифу гировали при 4000 g 20 минут. Супернатант, обработанный мерти олятом натрия, конечная концентрация которого составляла 1:10000, титровали в физиологическом растворе. Супернатант вы сокотоксигенных штаммов разводили и испытывали в титре 1:100 1:6400, а супернатант слаботоксигенных и атоксигенных штаммов изучали без разведения и в разведении 1:2-1:32. По 0,1 мл каж дого разведения вводили внутрикожно в освобожденный от шерсти участок спины взрослого кролика. Все образцы испытывали одно временно на двух животных. Результаты учитывали через 24 часа. Результат считался положительным, если размеры кожного уплот нения равнялись или превышали 5 мм.
Подбор оптимальных условий воздействия нитрозо-гуанидина на клетки холерного вибриона с целью получения мутантов
В последние годы для получения ауксотрофных мутантов различных бактерий наиболее часто используется метод, предложенный E.A.Adelberg, M.Mandel, G.С.С.Chen (1965), который основан на применении супермутагена нитрозогуанидина. Авторы, исследовав влияние условий обработки клеток E.coii нитрозогуанидином на частоту возникновения мутантов, определили, что оптимальное время воздействия мутагена составляет 15-30 минут, температура-37С, рН - 5,5. Существенным был возраст культуры: у клеток
E.coii, находящихся в логарифмической фазе роста,мутаген индуцировал в пять раз больше мутаций, чем у клеток в ранней стационарной фазе, и в десять раз больше по сравнению с клетками, находящимися в поздней стационарной фазе. Испытанные дозы нитрозогуанидина составляли 10, 30, 100, 300, 1000 мкг/мл. Максимальная частота образования ауксотрофных мутантов наблюдалась при использовании 1000 мкг/мл нитрозогуанидина (42,5$), в то время как мутанты, устойчивые к валину, с максимальной частотой (0,2%) возникали под действием 100 мкг/мл мутагена.
Цель данного этапа нашей работы заключалась в том, чтобы подобрать на основе метода E.A.Adelberg, M.Mandel, G.С.О.Chen оптимальные условия мутагенеза холерного вибриона и, в частности, концентрации нитрозогуанидина, наиболее эффективные для изучаемых нами штаммов вибрионов классического и Эль Тор биова ров. В работе использовали пять штаммов холерного вибриона: высо - 51 котоксигенный V.cholerae classica 569В, слаботоксигенный V.cholerae classica KB460, атоксигенный V.cholerae classica RV 31, токсигенный V.cholerae eltor RV 79, атоксигенный V.cholerae eltor 218 (табл.I). Выбор штаммов обусловлен их различной токсигенностью, что позволяло надеяться на создание коллекции маркированных мутантов, которая необходима для генетического анализа холерного вибриона и, в частности, для картирования генов, участвующих в синтезе холерного токсина.
Согласно рекомендациям E.A.Adelberg, М«Handel, G.С.С.Chen для обработки мутагеном всегда использовалась трех-четырехчасо-вая бульонная культура холерного вибриона, находящаяся в логарифмической фазе роста. Для выявления оптимальной дозы нитрозогуанидина, позволяющей получать высокую частоту образования ауксотрофных мутаций холерного вибриона классического и Эль Тор биоваров, клетки штаммов V.cholerae classica КВ460 И V.cholerae eltor 218, находящиеся в логарифмической фазе роста, обрабатывали в соответствии с методом указанных авторов в течение 30 минут при 37С и рН 5,5 различными концентрациями мутагена (10, 25, 50, 100, 150, 300, 500 мкг/мл). Результаты нескольких повторностей экспериментов, отражающие зависимость гибели и мутирования клеток этих штаммов от концентрации нитрозогуанидина, представлены на рисунках 5 и 6. Наибольшая частота образования мутации при использовании доз 10, 25, 50 мкг/мл равнялась 2,4$ у V.cholerae classica KB 460 и 8,5$ у V.cholerae eltor 218. При использовании 100-150 мкг/мл нитрозогуанидина частота возникновения мутаций у КВ460 составила 5,0-5,7$, а у 218-11,6-15$. Выживаемость клеток обоих штаммов была значительной и составила 0,1-1,8$. При увеличении концентрации нитрозогуанидина до 300 мкг/мл частота возникновения мутаций несколько уменьшалась, составляядля V.cholerae classica KB460 5,1% и для V.cholerae eltor 218 - 9,8%. В то же время выживаемость клеток уменьшалась значительно и составляла для обоих штаммов около 0,003%. Обработка клеток 500 мкг/мл мутагена приводила к их полной гибели. На основе статистически достоверной разницы частот возникновения мутаций ауксотрофных мутаций при использовании 50, 100, 150 и 300 мкг/мл нитрозогуанидина (табл.2), а также исходя из достаточно высокого уровня выживаемости при использовании 100-150 мкг/мл мутагена, был сделан вывод об оптимальности дозы в 100-150 мкг/мл для получения ауксотрофных мутантов холерного вибриона.
По-видимому, V.cholerae является более чувствительным к действию нитрозогуанидина, так как обработка клеток холерного вибриона дозой в 500 мкг/мл приводила к полной гибели клеток обоих штаммов, в то время как при действии 1000 мкг/мл мутагена на клетки E.coli выживаемость составляла 5%, и частота возникновения ауксотрофных мутаций при этом была максимальной.
Использование 100-150 мкг/мл нитрозогуанидина для индуцирования мутаций у трех других изучаемых штаммов v.cholerae classica 569В, V.cholerae classica RV 31 и V.cholerae eltor RV 79 также обеспечило получение высокой частоты образования мутантов (3,8-7,3%), гибель клеток этих штаммов составила 99,0-99,9% (табл.3). Частоты возникновения мутаций при использовании оптимальных доз нитрозогуанидина были существенно выше у штаммов биовара Эль Тор (5,7-15,0%) по сравнению со штаммами классического биовара (3,8-5,7%).
. Определение частоты передачи селектируемых маркеров при скрещивании донорного штамма с полиауксотрофными реципиентами
Цель данного этапа исследования заключалась в том, чтобы показать возможность использования полученных множественно маркированных штаммов холерного вибриона в генетических исследованиях- для картирования хромосомы возбудителя холеры.
Для этого произвольно были выбраны два полимаркированных мутанта V.cholerae classica КМ432 his 52 eye 60 arg 61 аго 60 thi 61 ile 62 и V.cholerae сіаввіса KM43I ilv I arg I his I aro 70 pur 70 pro 70, несущие по шесть мутаций в различных генах.
В качестве донора был использован штамм V.cholerae eltor КМ605, сконструированный ранее (Смирнова Н.И., Ерошенко Г.А., Ильина Т.С. и др., 1983) на основе использования плазмиды RP1ts, термочувствительной по репликации собственной ДНК. Этот штамм обладал способностью к ориентированному переносу хромосомных генов. Точка начала переноса локализована вблизи маркера his I. В таблице 13 представлены частоты наследования селектируемых маркеров донора при скрещивании с реципиентами V.cholerae classica KM43I и V.cholerae classica КМ432.
Наследование различных селектируемых маркеров происходило с разной частотой. С наибольшей частотой при скрещивании с реципиентом V.cholerae classica КМ432 происходило наследование маркера his (10 ), что свидетельствует о его проксимальном расположении к точке начала переноса. Остальные маркеры передавались с более низкими частотами. Разница в частотах переноса проксимальных и дистальних маркеров составляла три-четыре порядка; наблюдался четкий градиент переноса хромосомных маркеров, позволявший судить об их расположении на карте сцепления генов хромосомы холерного вибриона. Анализ частот наследования селектируемых маркеров предполагает следующий порядок расположения генов на хромосоме холерного вибриона: his « Не.. thi... аго. arg«. cys.
При скрещивании донора с реципиентом V,cholerae classlca KM43I также с наибольшей частотой происходило наследование гена his. Частоты наследования других маркеров существенно ниже (табл.13). На основе сопоставления частот переноса селектируемых маркеров донора при скрещивании с реципиентом KM43I был определен следующий порядок расположения генов на хромосоме холерного вибриона: his.., ilv... pur... arg... pro... аго. холерного вибриона по сцепленности неселектируемых маркеров с селектируемыми
Для того, чтобы подтвердить предположенный на основе анализа частот переноса селектируемых маркеров порядок расположения изучаемых генов, у полученных рекомбинантов определяли частоту наследования неселектируемых маркеров. Всего было проверено около двух с половиной тысяч рекомбинантов.
Данные анализа представлены в таблицах 14 и 15. Как видно из таблицы 14, ген his при скрещивании с реципиентом V,cholerae classics КМ432 показал незначительную сцепленность (1,3) лишь с геном cys» Рекомби-нанты, отобранные по маркеру cys, в 16,8$ случаев наследовали маркер his. Сопоставление этих двух величин позволяет расположить ген cys следом за геном his на карте сцепления генов холерного вибриона, несмотря на низкую частоту переноса маркера cys - Таблица 14
Частота наследования неселектируемых маркеров,донора рекомбинантами, полученными при скрещивании V.cholera eltor КМ605 с V.cholerae olaesica КМ432 hie 52 oys 60 arg 61 aro 60 thi 61 ile Селектируемый: маркер :- Частота наследования неселектируемых маркеров (%) hisПримечание:
В скобках указано количество изученных реком бинантов каждого типа. Отмечена большая величина процента совместного наследования маркеров Ші и ile, превышающая 60%, и маркеров аго и arg (70%), что говорит в пользу близкого расположения этих генов. Низкий процент сцепления генов каждой пары с геном Ms (0-2,2). говорит об их значительном удалении от этого маркера.
Похожие диссертации на Получение множественно маркированных штаммов холерного вибриона и их использование для картирования хромосомы
