Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Дрожжи рода Saccharomyces Meyen ex Reess 11
1.1.1. Краткая история систематики дрожжей рода Saccharomyces 11
1.1.2. Виды-двойники в комплексе Saccharomyces sensu stricto 14
1.1.3. Генетическая концепция рода дрожжей Saccharomyces 17
1.1.4. Идентификация дрожжевых культур 19
1.2. Плодово-ягодные вина 24
1.2.1. Классификация плодово-ягодных вин 24
1.2.2. Характеристика основных видов сырья для плодово-ягодного виноделия 27
1.2.2.1. Яблоки 29
1.2.2.2. Черная смородина 32
1.2.2.3. Малина 34
1.2.2.4. Черника 35
1.2.2.5. Черноплодная рябина : 37
1.2.3. Современные тенденции производства плодово-ягодных вин и их краткая характеристика 38
1.3. Дрожжи для плодово-ягодного виноделия 41
1.3.1. Основные расы дрожжей для производства яблочных вин 41
1.3.2. Основные расы дрожжей для производства ягодных вин 46
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 50
2.1. Объекты исследования 50
2.2. Материалы и методы 52
2.2.1. Физиологические тесты 52
2.2.2. Молекулярная дифференциация штаммов 55
2.2.3. Изучение динамики бродильной активности 58
2.2.4. Методы анализа ароматических веществ 62
2.3. Результаты 64
2.3.1. Физиологическое тестирование штаммов 64
2.3.1.1. Видовая идентификация штаммов 64
2.3.1.2. Определение максимальных температур роста штаммов 74
2.3.2. Молекулярно-биологическое тестирование штаммов 77
2.3.2.1. Молекулярная дифференциация штаммов 77
2.3.2.2. ПЦР с микросателлитным праймером (GTG)5 80
2.3.2.3. Молекулярное кариотипирование 81
2.3.3. Изучение динамики бродильной активности 89
2.3.3.1. Определение скорости и глубины сбраживания субстратов 89
2.3.3.2. Накопление этанола 94
2.3.3.3. Накопление биомассы дрожжей 97
2.3.3.4. Результаты газохроматографического анализа виноматериалов 102
Выводы 182
Список цитируемой литературы 185
Приложения 196
- Краткая история систематики дрожжей рода Saccharomyces
- Современные тенденции производства плодово-ягодных вин и их краткая характеристика
- Молекулярная дифференциация штаммов
- Определение максимальных температур роста штаммов
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ- По данным Департамента пищевой и
перерабатывающей промышленности Минсельхозпрода РФ, объемы
n производства винодельческой продукции в Российской Федерации за
^ последние годы колеблются, что связано с резким ухудшением материально-
f^ сырьевой базой всей виноградовинодельческой отрасли России. В результате
политики 80-х относительно производства и потребления алкоголя и
последующих, не всегда удачных, экономических преобразований
винодельческие предприятия страны в последние 10 лет оказались
» практически без сырья. Поскольку с распадом СССР к России отошли лишь
некоторые винодельческие регионы, площади виноградных насаждений по
всей стране сократились на 65-70%.
Большинство винодельческих предприятий России находятся в
критическом положении, связанном с нехваткой виноградного сырья и
л- виноматериалов. Заводы вторичного виноделия России, ранее
использовавшие для производства вин сырье, закупаемое в республиках бывшего СССР, в настоящее время обеспечены виноматериалами не более, чем на 15-20% из-за значительного сокращения площадей под виноградом.
Мощности винодельческих предприятий загружены лишь на 15-20% и
значительная часть сырья поступает за счет импорта из зарубежья. На
сегодняшний день доля виноградного вина, произведенного из
отечественного винограда, не превышает 30-40%. Взамен качественных
виноградных вин предприятия предпочитают выпускать более выгодные
» винные напитки [Ханунов Э.Р., 1999; Оганесянц Л.А, 2001; Смирнов К.В.,
2002].
В тоже время РФ обладает надежной сырьевой базой для развития
*' промышленного производства высококачественных плодовых вин [Панасюк
4 АЛ., 1992а].
5 Исследования последних лет подтвердили, что плодово-ягодные вина по
своему лечебному действию не уступают лучшим красным виноградным
винам благодаря высокому содержанию биологически активных веществ
(витаминов, флавоноидов) [Меньшов В .А. и др., 1998; Heinonen I.M. etal.,
1998; Vuorinen Н. etal., 2000]. Поэтому их потребление и производство во
всем мире растет с каждым годом [Bradstock N., 2003].
Особенностью сырьевой базы плодово-ягодного виноделия является то, что климатические и почвенные условия России позволяют выращивать самые разнообразные виды плодов и ягод. Главные районы выращивания плодовых культур - Северный Кавказ и Центрально-Черноземный район, где сконцентрировано более 60% площадей и валового производства плодов и ягод. Существенную роль играют также хозяйства некоторых областей Центрального и Поволжского районов. В этих четырех районах получают около 90% урожая, поступающего на переработку [Панасюк А.Л., 1992а].
Для сбраживания различных плодово-ягодных соков рекомендуется использование соответствующих рас дрожжей, например, для черносмородинового сока - раса Черносмородиновая - 5 и 7, для яблочного -Яблочная - 7, Сидровая - 101 и т.д. Так, например, наиболее популярные марки советских плодово-ягодных вин — сухие яблочные вина «Предгорное» и «Яблоневый цвет», а также оригинальные яблочные вина с хересными тонами марки «Янтарное», наряду с внедрением новых технологических приемов, были созданы именно благодаря применению новейших рас дрожжей [МехузлаКА. и др., 1984; Панасюк АЛ., 1991].
Сейчас для производства плодово-ягодных вин в России и в других странах СНГ используется довольно ограниченный перечень рас дрожжей [Деменков А.П. и др., 1998], выделенных еще в конце 30-х годов и уже не отвечающих тем требованиям, которые предъявляют к ним современные технологии -скорость и полнота брожения, органолептические свойства и т.д.
Однако, в последние 20-30 лет поиск новых рас для плодово-ягодного виноделия практически не проводился, а за рубежом, за редким исключением
(Польша, Германия), совершенно отсутствуют специализированные расы
дрожжей для плодово-ягодного виноделия.
Поэтому, в настоящее время назрела необходимость поиска новых рас
дрожжей для производства яблочных и ягодных вин. В этой связи особого
i внимания заслуживает работа, которая совсем недавно была проведена в
^ , этом направлении в Беларуси, где из различных ягод было выделено свыше
* 500 штаммов дрожжей рода Saccharomyces, для сбраживания плодово-
ягодных соков [Колесник И.М. и др., 2004].
Производство плодово-ягодных вин должно стать одним из приоритетных направлений отечественного виноделия и все исследования в данной области являются важными и актуальными.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ- Основная цель диссертационной работы состоит в изучении физиолого-биохимических, молекулярных и технологических свойств 32 штаммов дрожжей рода Saccharomyces различного происхождения с позиции их использования в отраслях бродильных производств (первичном и вторичном виноградном и плодово-ягодном виноделии, шампанском и спиртовом производстве, пивоварении и хлебопечении) и селекции новых наиболее перспективных рас для плодово-ягодного виноделия. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи;
1) Определение и описание морфологических и физиолого-биохимических
характеристик дрожжевых штаммов, выделенных из плодового и ягодного
сырья.
2) Определение видовой принадлежности исследуемых штаммов дрожжей на
основе стандартных физиологических тестов (сбраживание Сахаров,
ассимиляция).
3) Изучение термостабильности дрожжей с позиции их дальнейшего
использования для получения препаратов активных сухих винных дрожжей
(АСВД).
4) Видовая идентификация штаммов современными молекулярно-
биологическими методами анализа генома (ПЦР-анализ и молекулярное кариотипирование) и установление генетического родства изучаемых штаммов дрожжей.
5) Проведение лабораторных испытаний по изучению динамики сбраживания
плодово-ягодных субстратов новыми штаммами для плодово-ягодного
виноделия.
Определение основных физико-химических характеристик получаемых виноматериалов.
Характеристика суммы метаболитов при анаэробном способе жизни дрожжей.
Отбор плодово-ягодных штаммов, отличающихся наибольшей скоростью и глубиной сбраживания субстрата и дающих наибольший процент выхода спирта с единицы сахара и наиболее разнообразную композицию ароматических соединений.
9) Проведение сравнительных производственных испытаний отобранных
штаммов для плодово-ягодного виноделия.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ:
1) Изучены морфологические и физиолого-биохимические характеристики
изучаемых штаммов дрожжей. На основании стандартных физиологических
тестов установлено, что все изучаемые дрожжевые штаммы принадлежат к
одному биологическому виду Saccharomyces cerevisiae, хотя и отличаются
между собой по ряду признаков, обозначенных в определителе как
вариабельные.
2) Определены максимальные температуры роста дрожжевых штаммов и
выяснено, что наиболее термостабильными являются плодово-ягодные
культуры, что позволяет рекомендовать их к дальнейшему исследованию по
получению препаратов АСВД.
8 4} Проведена дифференциация штаммов современными молекулярно-
биологическими методами анализа генома с применением техники ПЦР-
анализа, молекулярного кариотипирования и Саузерн-гибридизации.
Показано, что пять культур,, идентифицированных по! физиологическим
тестам как S. cerevisiae, являются межвидовыми гибридами S. cerevisiaex S.
tcvarum.
5} Определена динамика сбраживания плодово-ягодных субстратов новыми
штаммами, выделенными с плодов и ягод культур Западного региона
Беларуси.
В полученных плодовых виноматериалах определены основные физико-химические показатели и установлено, что все виноматериалы, полученные с применением новых плодово-ягодных культур, соответствуют требованиям ГОСТ 51146-98 «Виноматериалы плодовые сброженные и сброженно-спиртованные. Технические условия». В виноматериалах проанализированы основные ароматические компоненты.
Отобраны штаммы, которые показали наибольшую скорость и глубину сбраживания субстратов при наибольшем выходе спирта с единицы сахара.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ:
В результате проведенных исследований изучены новые штаммы дрожжей для плодово-ягодного виноделия, их морфология, физиология, определена видовая принадлежность культур.
Освоен и предложен новый подход к идентификации дрожжевых культур, основанный на совмещении стандартных физиологических методов (первичная идентификация) и молекулярных методов анализа генома исследуемых культур.
3) Среди культур, идентифицированных ранее как S. cerevisiae, обнаружены
межвидовые гибриды S. cerevisiaex S. uvarum.
4) На основании изучения динамики сбраживания плодово-ягодных
субстратов, определения показателей выхода этанола с единицы сахара и
9 других химико-аналитических показателей полученных виноматериалов
отобраны 5 наиболее перспективных плодово-ягодных культур.
Проведено депонирование пяти отобранных плодово-ягодных штаммов во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). Штаммам присвоены следующие коллекционные номера: ДЧК-1 - ВКПМ Y-3096, ГМ-8 - ВКПМ Y-3097, ГВ-4 - ВКПМ Y-3098, ВЧР-3 - ВКПМ Y-3099, ГСЧ-1-ВКПМ Y-3100.
Подана заявка на получение патента на штамм S. cerevisiae ВКПМ Y-3097 для производства вин из ягод малины.
7) Проведены заводские испытания плодово-ягодных культур дрожжей в
филиале «Винзавода «Ключ жизни» ОАО «Бахус» г. Елец Липецкой области.
Испытания показали, что исследуемые дрожжевые штаммы обеспечивают
получение виноматериалов с более благоприятными органолептическими
свойствами по сравнению с контролем. Виноматериалы отличались более
насыщенным цветом, ярко выраженным сортовым ароматом и обладали
гармоничным и мягким вкусом. Расы отличаются высокими
технологическими показателями, позволяют интенсифицировать процесс
брожения, обеспечивая получение высококачественных виноматериалов.
Расы рекомендованы для использования на предприятиях плодового
виноделия. Результаты испытания подтверждены Актом из филиала
«Винзавода «Ключ жизни» ОАО «Бахус» г; Елец Липецкой области.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:
Основные положения работы докладывались на международных конференциях: Международной конференции молодых ученых «Молодые ученые - пищевым и перерабатывающим отраслям АПК (технологические аспекты производства)» (Москва, 2000 г.) и П Международной научно-практической конференции «Качество, безопасность и экология пищевых продуктов и производств. Прогресс в области агроиндустрии» (Ялта, 2001 г.).
10 Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ., в
том числе 5 статей в сборнике «Актуальные вопросы пищевой
промышленности», в научно-производственных журналах «Виноделие и
виноградарство)), «Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья», в
журнале «Микробиология». Проведено депонирование 5 штаммов дрожжей в
ВКПМ, подана заявка на получение патента РФ.
Краткая история систематики дрожжей рода Saccharomyces
Систематика дрожжей этого рода многократно пересматривалась, и в разных определителях число видов, входящих в род Saccharomyces сильно варьирует. Хотя характерная почкующаяся форма дрожжей была зафиксирована еще Ван Левенгуком в 1680 году, более детальное описание и идентификация дрожжей продолжали оставаться сложной задачей. Поскольку у вегетативных форм большинства дрожжей нет каких-либо характерных морфологических особенностей, их нелегко идентифицировать путем обычного визуального наблюдения. Род Saccharomyces получил свое название в 1837 году от Меуеп, который объединил различные виды дрожжей в один род. Первоначально название Saccharomyces употреблялось по отношению ко всем дрожжам, выделенным из спиртных напитков, и Меуеп различал в соответствии с источником выделения три вида сахаромицетов: S. vini - из вина, S. cerevisiae - из пи ва, S. ротогит - из сидра [Берри Д., 1985; Сагг J. 1974]. Половые споры у дрожжей были обнаружены в 1837 году Шваином, но только в 1870 году, после того как Reess описал образование спор дрожжами, к роду Saccharomyces стали причислять исключительно те дрожжи, которые образуют споры. В род Saccharomyces Reess включил все аскомицетовые дрожжи, не образующие истинный мицелий, размножающиеся почкованием и образующие аски с 1-4 аскоспорами [Reed G., etal., 1988; Barnett J.A., 1992]. Согласно его классификации, пивные дрожжи по-прежнему назывались S. cerevisiae, а дрожжи, сбраживающие фруктовые соки, получили название S. elUpsoideus. Позднее Hansen, придерживаясь этой классификации сахаромицетов, отнес к виду S. cerevisiae все пивные дрожжи верхового брожения, а дрожжи низового брожения назвал S. carlsbergensis, В монографии 1931 года, посвященной аспорогенным дрожжам, Stelling-Dekker относит к роду Saccharomyces 23 вида, включая вид S. fragilis, отличительной особенностью которого является образование бобовидных аскоспор. В этой работе вид S. elUpsoideus рассматривается как разновидность или синоним вида & cerevisiae, т.к. разница между ними заключается в небольшом отличие по форме и размерам вегетативных клеток. По Stelling-Dekker дрожжи рода Saccharomyces отличают круглые, овальные, иногда удлиненные клетки, часто объединенные в короткие цепочки, размножающиеся вегетативно многосторонним почкованием. Аски, образующиеся после конъюгации, содержат круглые или овальные аскоспоры, которые обычно прорастают после предварительной конъюгации. Все виды активно сбраживают D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу и другие сахара, не утилизируют нитраты. Род Saccharomyces был разделен на два подрода: Saccharomyces и Zygosaccharomyces. Отличительной особенностью зигосахаромицетов была непременная конъюгация, предшествовавшая образованию аскоспор. Следующие значительные изменения систематики рода Saccharomyces относятся к 1952 году, когда в свет выходит первый определитель дрожжей под редакцией Lodder. Lodder и Kreger-van-Rij объединили в род Saccharomyces не только около 20 представителей Zygosaccharomyces по классификации Stelling-Dekker, но еще 3 вида Torulaspora binder и типовые культуры рода Debaryomyces Klocker. Теперь численность сахаромицетов возросла до 30 биологических видов. Однако, не все таксономисты согласились с предложенной Lodder классификацией. В. И. Кудрявцев, например, включает в род Saccharomyces только диплоидные дрожжи, выделяя гаплоидные виды в Zygosaccharomyces, а виды с автогамным половым процессом в род Debaryomyces. Кроме того, дрожжи, сбраживающие лактозу, местообитанием которых являются молочные продукты, Кудрявцев выделяет в отдельный род - Fabospora. [Кудрявцев В.И., 1954]. В 1970 году Lodder опубликовывает второе издание своего определителя. В этой работе Ван дер Вальт увеличивает количество видов Saccharomyces до 41, среди которых есть диплоидные, гаплоидные и виды с соматогамной автогамией. В этом определителе к синонимам S. cerevisiae теперь относится вид S. willianuSy S. carlsbergensis и S, logos считаются синонимами вида S. uvarum, а вид S. oviformis Osterwalder рассматривается как синоним вида S. bayanus [Walt J.P. van der, 1970]. H.A. Красильников рассматривает виды, объединенные у Ван дер Вальта в род Saccharomyces, в -трех родах - Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Torulaspora [Красильников НА., 1954]. Такое деление на роды с изменением в составе видов было поддержано в дальнейших исследованиях [Агх von J.A. et аЦ 1977]. Согласно Yarrow в роде Saccharomyces оставлено 5 видов с преимущественно диплоидной вегетативной фазой: S. cerevisiae, S. fduyveri, S. exiguus, S. dairensis, S. servazii [Yarrow D., 1984]. Описанный Р.Д. Зубковой [Зубкова P.Д., 1971] вид Kazachstania viticola Zub. рассматривается как синоним S. dairensis Naganishi [Агх von J.A. et. al., 1977]. К сокращению числа видов привело применение методов ДНК-реассоциации и гибридизации. Так, 17 отдельных биологических видов по классификации Ван дер Вальта, были объединены в один вид S. cerevisiae, включая S. bayanus, S. chevalieri Guilliermond, S. diastaticus, S. uvarum; 10 видов отнесены к роду Zygosaccharomyces, а 8 - к роду Torulaspora [Yarrow D.r 1984]. Ha сегодняшний день по классификации Vaughan-Martini и Martini к роду Saccharomyces отнесены 14 биологических видов [Vaughan-Martini A. et al., 1998]. По существу, все дрожжи Saccharomyces, прямо или косвенно связанные с деятельностью человека, являются культурными и, за небольшим исключением, относятся к виду S. cerevisiae. Гибридологическим анализом была изучена большая коллекция культурных дрожжей Saccharomyces выделенных из многочисленных антропогенных источников в различных регионах мира, и показана их принадлежность к одному биологическому виду S. cerevisiae [Наумов Г.И. и др., 1989а; Naumov G.L, 1996]. Такие изменения в систематике объясняются разработкой новой концепции вида, основанной на изучении генетических и молекулярно-биохимических свойств дрожжей. Современная таксономия относит к синонимам вида S. cerevisiae дрожжи, используемые в виноделии, и другие промышленно важные расы дрожжей, которые ранее рассматривались как самостоятельные виды: S. ellipsoideus, S. awamori, S. intermedins, S. validus, S. batatae, S. fructuum, S. italicus, & chevslieri, S. lindneri, S. oviformis, S. hispanica, S. cheresiensis, S. oxydans, S. capensis, S. prostoserdovii, S. sake, 5. steineri, S. vini [Vaughan-Martini A. et al., 1998]. Однако, микробиологи — производственники считают, что было бы неверным отказаться от названий дрожжей, применяющихся в виноделии, которые традиционно связаны с определенными технологическими процессами или продуктами, и заменить их одним видом S. cerevisiae [Саришвили Н.Г. и др., 2000].
Современные тенденции производства плодово-ягодных вин и их краткая характеристика
Производство плодово-ягодных вин в странах Европейского Союза регулируется и контролируется Ассоциацией Производителей Сидров и Плодовых Вин (AICV), объединяющей 180 крупнейших производителей плодово-ягодных вин в 10 различных странах ЕС (Франции, Испании, Англии, Ирландии, Германии, Бельгии, Дании, Голландии, Швейцарии и Финляндии). Согласно генеральному постановленгао AICV, регулирующему правила производства плодово-ягодных вин и их основные характеристики (Codex of Practice), вступившему в силу с апреля 1998 года, яблочные вина, полученные сбраживанием яблочного сока или его концентрата, называются «Сидрами» (Cider), грушевые вина, полученные сбраживанием грушевого сока или его концентрата - «Пуарре» (Perry), ягодных соков - «Фруктовыми винами» (Fruit wines) [Capshew В., 2001]. При этом, для сидров и пуарре запрещается дополнительное внесение спирта в готовое вино. Если же в технологическом процессе приготовления вина дополнительно используется спирт, то такое оно также получает название «Фруктовое вино». Очень важным моментом является то, что и сидры и фруктовые вина являются продуктами спиртового брожения. Постановление оговаривает то, что содержание спирта в сидре должно быть в пределах 1,2-8,5% об. Обычно же содержание спирта в сидрах составляет около 5-7% об. - такую крепость имеют около 95% продаваемых сидров. Таким образом, сидры, выпускаемые в ЕС, являются слабоалкогольными освежающими напитками, полученными в результате сбраживания свежего или восстановленного яблочного сока. Следует отметить, что популярность натуральных некрепленых яблочных вин в странах ЕС очень высока, благодаря чему общее производство сидров и пуарре составило в 2001 году около 9,5 млн. гектолитров [Bradstock N., 2003]. При этом 98% этих вин потребляется внутри ЕС. Согласно номенклатуре AICV все виды ягодных вин попадают в категорию «Fruit wines». Общее производство этих вин в ЕС составляет около 5 млн. дал в год, и они могут выпускаться как натуральные столовые, так и крепленые этиловым спиртом. Для фруктовых вин предельным содержанием спирта является 22% об. Следует отметить, что благодаря исследованиям, проведенным в последние 5-7 лет и показавшим, что ягодные вина обладают значительной антиоксидантной активностью [Hainonen L М- etal, 1998; Vuorinen Н. et.al., 2000], а некоторые их компоненты, в особенности флавонолы и фенольные кислоты, проявляют антиканцерогенные и антимутагенные свойства, производство ягодных вин в ЕС в последние годы стремительно возрастает [Bradstock N., 2003]. При этом, основной упор делается на натуральные вина с естественным набродом спирта. В отличие от западного рынка плодово-ягодные вина, в подавляющем большинстве своем представлены сухими столовыми винами, в бывшем СССР основную массу составляли крепкие плодово-ягодные вина, полученные на основе яблочного сока с добавлением сахара и этилового спирта до 16-17% об., из. которых основной маркой было «Яблочное крепкое». Несмотря на то, что выпуск таких вин был очень большим, качество их было низким, и они не пользовались популярностью среди населения, что и послужило одной из причин резкого сокращения производства плодово-ягодных вин при переходе предприятий на рыночные отношения. Даже в самые благополучные для плодово-ягодного виноделия СССР годы (1983-1984) из 101 марки плодово-ягодных вин 65 были креплеными, и только 7 - столовыми [Годес Е.З. и др., 1982]. Наиболее высококачественными столовыми сухими яблочными винами были «Предгорное» и «Яблоневый цвет», отличавшиеся мягким вкусом, полным ароматом с ярко выраженными тонами яблок.. Эти марки вин производились брожением яблочного сока в аппаратах с иммобилизованными дрожжами - аппаратах с насадками, где происходило обогащение вина высокомолекулярными веществами автолизированных дрожжей, значительно облагораживающих букет вина [Дрбоглав Е.С. и др., 1984; Сигал М.М. и др., 1984; Парагульнов О.Д. и др., 1984а; 19846]. Менее качественными, но все же пользующимися в то время относительно высоким спросом, были сухие вина марок «Белое сухое», «Яблочное сухое», «Апорт столовый», «Пыльтсамааское», «Кибрай». Достаточно оригинальными были яблочные вина специального типа, приготовляемые с помощью ферментации виноматериалов хересными дрожжами. Эти вина, наиболее известными из которых были «Арес» и «Янтарное», отличались интересным сложным ароматом с преобладанием хересных тонов [Мехузла НА. и др., 1984]. Производство яблочных игристых вин в СССР освоено не было — выпускались только шипучие вина - «Яблочное шипучее» и «Миргородское шипучее» [Вечер А.С. и др., 19766; Деменков А.П. и др., 1998]. В странах бывшего союзного государства столовые ягодные вина производились в основном из черной, белой и красной смородины, крыжовника, клюквы, а также из яблок в сочетании с черной смородиной и черникой. Кроме того, выпускалось немалое количество купажных вин [Макаров В.И. и др., 1996; Литовченко А.М. и др., 2002а; 20026]. К сожалению, в настоящее время ассортимент натуральных плодово-ягодных вин в СНГ является крайне скудным и совершенно не соответствует ни огромным потенциальным возможностям стран СНГ в производстве вин данной категории, ни запросам современного рынка.
Молекулярная дифференциация штаммов
Выделение ДНК из клеток дрожжей проводили по методу» описанному ранее [Naumov G.I. et al., 1997]. Дрожжи культивировали при 28С на полной YPD (yeast peptone dextrose broth) среде следующего состава (г/дм3): глюкоза — 20, дрожжевой экстракт - 10, пептон — 10, агар - 20. Петлю дрожжей суточной культуры суспендировали в 200 мкл буфера (50 мМ трис НС1, рН 7.8; 50 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 500 мМ 2-меркапто-этанол; 2% N-лаурол-саркозин; 500 мкг/см3 протеиназы К). Смесь инкубировали в течение часа при 65С для лизиса клеток; затем концентрацию NaCl доводили до 1М, добавляли равный объем хлороформа/изоамилового спирта (24:1) и встряхивали в течение 15 минут. После центрифугирования при 12000g в течение 5 минут, верхнюю фазу переносили в другую пробирку, и ДНК осаждали изопропиловым спиртом (0.6 объема) центрифугированием в течение 15 минут. Осадок промывали охлажденным 70% этанолом (добавить 500 мкл и центрифугировать 5 минут) и растворяли в 50 мкл ТЕ буфера (1 мМ трис НО, рН 7.8; 0.1 мМ ЭДТА) - 48.5 мкл ТЕ +1.5 мкл РНКазы (10 мг/см3). Конечная концентрация ДНК составляет около 200 нг/мкл.
Выделение хромосомной ДНК. Дрожжи выращивали в 10 см3 жидкой среды YPD при 28С в течение 16 часов. Дрожжи осаждали центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5мин и дважды промывали осадок в 1 см буфера ЭДТА/Трис (50мМ ЭДТА, ЮмМ Трис, рН 7.5). Клетки ресуспендировали в 200 мкл ЭДТА/Трис, содержащих 4 мг энзиматического препарата Novozym 234 (Novo Industri A/S, Дания) и инкубировали в течение 10-15 мин при 42С. К клеточной суспензии добавляли по 800 мкл 1%-ной легкоплавкой охлажденной до 38-42С агарозы (Bio-Rad, США), переносили смесь в специальные формы и выдерживали на льду 30-60 мин для застывания агаровых блоков. Инкубировали образцы в буфере LET (0.5 мМ ЭДТА; ЮмМ Трис, рН 7.5) при 37С в течение 3 часов. Затем заменяли буфер LET на NDS (0.5М ЭДТА; ЮмМ Трис, pH 7,5; 1%-ный сарказин, рН 9.5; 1 мг/см протеиназы К) и инкубировали при 48С в течение ночи. Промывали агаровые блоки в растворе ЭДТА/Трис и хранили при 4С. ПЦР и анализ продуктов. Амплификацию 5.8S рДНК и внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 (5.85-1Т5-фрагмент) осуществляли с помощью праймеров pITSl (5 CCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ) и pITS4 (5 CCTCCGCTTATTGATATGC-3 ) [Наумов Г.И. и др., 2003]. Для амплификации NTS2 -ETS-фрагмента рДНК использовали праймеры NTS2 (5 -AACGGTGCTTTCTGGTAG-3 ) ETS1 (5 GTCTTCAACTGCTTT-3 ), позволяющие амплифицировать ДНК-фрагмент длиной около 1320 п.н. [Nguyen H.-V.et al., 1997]. ПЦР проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей ПЦР-буфер 20 мМ (NH SO 3 мМ MgCb, 0.25 М dNTP, 1.0 мкл каждого праймера, 0.5 ед. Taq-полимеразы («Синтол», Россия) и 20 нг анализируемой геномной ДНК. Использовали ДНК-амплификатор «Терцик» («ДНК-технология», Россия) в следующем режиме. Для 5.85-1Т5-фрагмент начальная денатурация — 3 мин при 94С, затем 30 циклов: денатурация ДНК — 94С, 2 мин; отжиг праймеров — 60С, I мин; синтез ДНК — 72С, 2 мин и конечная достройка - 10 мин при 72С. Для амплификации NTS2-ETS фрагмента - начальная денатурация ДНК - 94С, 5 мин; затем 35 циклов: денатурация ДНК - 94С, 5 мин; отжиг праймеров - 52С, 30 с; синтез ДНК — 72С, 2 мин; конечная достройка — 10 мин при 72С. ПНР с микросателлитным праймером (GTG s проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей ПЦР-буфер 20 мМ (NH SC , 3 мМ MgCb, 0.25 М dNTP, 1.0 мкл праймера, 0.5 ед. Taq-полимеразы («Синтол», Россия) и 20 нг анализируемой геномной ДНК. Использовали ДНК-амплификатор «Терцик» («ДНК-технология», Россия) в следующем режиме:, начальная денатурация ДНК - 94С, 5 мин; затем 40 циклов: денатурация ДНК — 94С, 1 мин; отжиг праймера - 52С, 2 мин; синтез ДНК — 74С, 3 мин; конечная достройка - 10 мин при 72С. Продукты амплификации подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле при 60-65В в 0.5хТВЕ (45 мМ трис, 45 мМ борная кислота, 10 мМ ЭДТА, рН 8.0) в течение 2 часов и окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе Vilber Lourmat (Франция). Рестриктазный анализ. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) 5.88-1Т5-фрагмента осуществляли с помощью эндонуклеаз НраІІ и НаеШ («Fermentas», Литва). Рестрикцию NTS2-ETS фрагмента рДНК проводили эндонуклеазами Alul и BshNI («Fermentas», Литва). В пробирку-эпендорф помешали по 2 мкл соответствующего ПЦР-продукта и добавляли 8 мкл рестриктазной смеси (0.5 мкл соответствующей рестриктазы, 2 мкл буфера и 5.5 мкл воды). Аккуратно смешивали содержимое, осаждали на центрифуге и ставили в водяную баню при 37 С на ночь. Разделение фрагментов рестрикции осуществляли в 1.6%-ном агарозном геле при 55-60В в 0.5хТВЕ в течение 3 ч. Гель окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе Vilber Lourmat (Франция).
Пульс-электрофорез. Для разделения хромосомной ДНК использовали аппарат CHEF-DRTM Ш («Bio-Rad», США). Образцы, предварительно промытые в 0.05 М ЭДТА, помещали в щели 1%-ного агарозного геля. Пульс-электрофорез проводили при 200В в течение 24 часов: 15 часов при времени переключения полей 60 с и 9 часов при времени переключения полей 90 с (охлаждение до 14С). В качестве буфера использовали трис-борат (45 мМ трис, 45 мМ борная кислота, 10 мМ ЭДТА, рН 8.0). После электрофореза гель окрашивали бромистым этидием в течение 1 ч, промывали в дистиллированной воде в течение 2 часов и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе Vilber Lourmat (Франция). Саузерн-гибридизация. Перенос хромосомных ДНК на нитроцеллюлозную мембрану проводили Саузерн-блотом [Маниатис Т. и др., 1984]. ДНК фиксировали на мембране отжигом при 80С в течение 2 ч. В качестве зонда использовали ПЦР-фрагмент гена ARG4 длиной 3000 п.н. Метку вводили нерадиоактивным методом по «Boehringer Manneheim» (Germany) с использованием дигокситена dig-II-dUTP [Naumov G.I. et. al., 1993]. Гибридизацию и проявление гибридизационных сигналов также проводили по инструкции фирмы «Boehringer Manneheim».
Филогенетические родственные связи изучаемых дрожжей-сахаромицетов и построение дендрограммы осуществляли по результатам ПЦР с микросателлитным праймером (GTG)s с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECON [Van de Peer Y. et. al., 1994]. В качестве внешней группы использовали штамм S. uvarum ВКМ Y-1146. Индексы бутстрепа, определяющие статистическую достоверность выделения групп, определяли для 100 реплик.
Определение максимальных температур роста штаммов
Ранее было установлено, что виды-двойники комплекса Saccharomyces sensu stricto различаются последовательностями внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 рДНК [Naumov GJ. et.al., 2000], и могут быть дифференцированы на основании анализа длин фрагментов рестрикции этого участка [Namnova E.S. et.al., 2003]. С помощью эндонуклеаз НаеШ и НраІІ можно различить виды S. cerevisiae, S. bayanus и S. paradoxus. Дрожжи S. uvarum, S. pastorianus и S. bayanus имеют идентичные ПДРФ - профили. При НаеШ - рестрикции ПДРФ-профили идентичны у видов S. cerevisiae и S. paradoxus, и у видов S. bayanus, S. uvarum, S. pastorianus [Fernandez-Espinar MX et.al., 2000]. При НраІІ-рестрикщга ПДРФ-профили идентичны у дрожжей S. cerevisiae, S. bayanus, S. uvarum и S. pastorianus, тогда как ПЦР -продукт 5". paradoxus не подвергается ферментативному расщеплению этой эндонуклеазой.
Была проведена амплификация 5.8S-ITS и NTS2-ETS фрагментов рДНК у 32 исследуемых штаммов и пяти видовых тестеров. У всех 37 штаммов размер 5.8S-ITS ПЦР - продукта был одинаков и составил примерно 850 п.н. (РисЛа). Размер амплифицированного NTS2-ETS участка рДНК также оказался одинаковым у всех 37 изучаемых штаммов и составил примерно 1320 п.н. (Рис.16). Полученные результаты свидетельствуют о принадлежности исследуемых дрожжей к комплексу Saccharomyces sensu stricto [Наумов ГЛ. и др., 2003; Nguyen H.-V. et. al., 1997].
Продукты ПЦР анализировали с помощью ферментативного расщепления эндонуклеазами НраІІ и НаеШ (Рис. 2а, 26). По сходству рестрикционных профилей все изученные дрожжи были разбиты на 2 группы. В первую группу вошли тест-штамм S. cerevisiae CBS 1171, 10 белорусских штаммов (ВВ-1, ВВ-2, ГВ-1, ГВ-4, ГСЧ-U ДЧК-1, ВЧР-3, ГМ-8, ГМ-15, ГМ-17) и 17 штаммов из других коллекции. Они характеризуются наличием четырех НаеШ- фрагментов размером примерно 320, 230, 170 и 130 п.н. (Рис. 2а, дорожки 3, 10-36) и двух НраІІ-фрагментов размером примерно 730 и 120 п.н. (Рис. 26, дорожки 3,10-36).
Три тест-штамма S. uvarum ВКМ Y-1146, S. pastorianus CBS 1538, S. bayanus CBS 380 (Рис. 2a, 26, дорожки 4, 1, 2 соответственно) имеют три НаеШ- фрагмента размером примерно 490, 230 и 130 п.н., а по НраІІ-профилям рестрикции неотличимы от штаммов первой группы.
Ко второй группе исследуемых штаммов были отнесены три белорусских штамма (ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11) штаммы Шампанская 11/12 и Л-80-4, обладающие уникальными НаеШ - профилями 5.8S-ITS участка рДНК (Рис. 2а, дорожки 5-9 соответственно). Штаммы этой группы обладают идентичными паттернами с четырьмя фрагментами приблизительно равными 320,230,170 и 130 п.н., характерными тест-штамму S. cerevisiae CBS 1171, и одним дополнительным фрагментом длиной около 490 п.н. Наличие фрагмента такой длины обнаруживается у штаммов S. bayanus CBS 380, S. pastorianus CBS 1538, S. uvarum BKM Y-1146 (Рис. 2a, дорожки 2, 1, 4). НраІІ-профили этих пяти штаммов идентичны штаммам первой группы (Рис. 26, дорожки 5-9). Амплифицированный МТ82-ЕТ8-фрагмент рДНК анализировали рестриктазами Alul, BshNI (Рис. За, 36). Ранее было показано [ Nguyen H.-V. et al., 1997; 2000], что на основании рестрикции NTS2-ETS parMeHTa рДНК с помощью данных эндонуклеаз можно различить виды-двойники S. cerevisiae, S. paradoxus и S. uvarum; Дрожжи S. bayanus и S. pastorianus имеют идентичные профили.
Тест-штаммы S. pastorianus CBS 1538 и S. bayanus CBS 380 характеризуются отсутствием BshNI-сайта (Рис. 36, дорожки 1, 2 соответственно), а при Alul-рестрикции имеют идентичные паттерны с четырьмя фрагментами приблизительно равными 470, 370, 240 и 170 п.н. (Рис. За, дорожки 1,2). У тест-штамма S. uvarum ВКМ Y-1146 также наблюдается отсутствие BshNI-сайта, а Alul-профиль характеризуется тремя фрагментами размером около 620, 520 и 180 п.н. (Рис. За, 36, дорожка 4).
Все исследуемые штаммы по сходству рестрикционных профилей были разбиты на две группы. В первую группу вошли тест-штамм S. cerevisiae CBS 1171 (Рис. За, 36, дорожка 3) и 27 исследуемых штаммов, имеющие стандартные ПДРФ-профили: по два AIuI-фрагмента ДЛИНОЙ около 1150 и 170 п.н. и три BshNI-фрагмента приблизительно равных 740, 420 и 220 п.н. (Рис. За, 36, дорожки 10-18; на рисунках приводится часть исследуемых штаммов).
Ко второй, группе мы отнесли пять штаммов, обладающих уникальными профилями при BshNI- и Alul- рестрикции. Это три белорусских штамма (ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11) и штаммы Шампанская 11/12 и Л-80-4. Они отличаются наличием четырех Alul- фрагментов: трех, характерных для тест-штамма S. uvarum ВКМ У-1146, длиной примерно 620, 520 и 180 п.н. и одним дополнительным фрагментом длиной примерно 1100 п.н. как при Alul- рестрикции штамма S. cerevisiae CBS 1171 (Рис. За, дорожки 5-9). При BshNI-рестрикции штаммы этой группы имели идентичные паттерны с тремя фрагментами приблизительно равными 740, 420 и 220 п.н., характерные для тест-штамма S. cerevisiae CBS 1171 и одним фрагментом размером примерно 1300 п.н., характерным тест-штамму S. uvarum ВКМ Y-H46 (Рис.3 б, дорожки 5-9).
Таким образом, на основании рестриктазного анализа мы смогли дифференцировать исследуемые штаммы комплекса Saccharomyces sensu stricto. Согласно проведенному ПДРФ-анализу 27 исследуемых штаммов относятся к виду S. cerevisiae. Пять штаммов с уникальными НаеШ, AIuI и BshNI-рестрикционными профилями (ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11, Шампанская 11/12, Л-80-4) представляют собой гибриды S. cerevisiaexS. uvarum:
На Рис. 4 представлены результаты ПЦР амплификации с праймером (GTG)s дрожжей комплекса Saccharomyces sensu stricto. Размеры фрагментов амплифицированной ДНК варьировали у разных штаммов от 250 до 2100 п.н. По сходству ПЦР-паттернов все изученные дрожжи были условно разбиты на две группы. В первую группу вошли 28 штаммов, имеющих сходные паттерны с мажорными фрагментами размерами примерно 2100, 1500, 750 и 670 п.н. Наличие мажорных фрагментов указанной длины подтверждает принадлежность штаммов к виду S. cerevisiae [Naumova E.S. et.al., 2000]. Внутри этой группы наблюдается незначительная изменчивость ПЦР паттернов, проявляющаяся в наличии или отсутствии отдельных минорных полос. К этой группе отнесены и ПЦР - профили штаммов, идентифицированных как гибриды S. cerevisiaex S. uvarum. Они отличаются от тест-штамма S. cerevisiae CBS 1171 [Naumova E.S; et.al., 2000] отдельными минорными полосами. Штамм 985-Т отличается от штаммов первой группы наличием дополнительного мажорного фрагмента размером 1750 п.н. (Рис. 4, дорожка 23).
Ко второй группе отнесены штаммы, имеющие идентичные паттерны с тремя мажорными фрагментами размером 670, 500 и 375 п.н. (Рис. 4, дорожки 24-27). Три штамма этой группы характеризуются наличием трех дополнительных минорных полос размером примерно 1000, 875 и 750 п.н. Следует отметить, что дрожжи этой группы имеют похожее происхождение. Все четыре культуры выделены из винограда районированных сортов, произрастающего в разных географических областях (Беларусь, Украина, Грузия) и предназначены для сбраживания виноградных виноматериалов.
