Введение к работе
Актуальность проблемы. В род Burkholderia в настоящее время входят более 30 видов грамотрицательных глюкозу неферменти-рующих бактерий, подавляющее большинство которых являются сво-бодноживущими почвенными и водными микроорганизмами. Для медицинской практики имеет значение идентификация и биологические свойства 3-х видов буркхольдерий: В. mallei и В. pseudomallei, являющихся возбудителями особо опасных инфекций (сапа и мелиоидо-за), а также В. cepacia, способной в определенных условиях вызывать оппортунистические и нозокомиальные инфекции у больных с иммунодефицитным состоянием (Беляков, 1990).
В. cepacia является убиквитарным микроорганизмом, обладающим уникальным набором приспособительных механизмов, позволяющих ему создавать экологические ниши как во внешней среде, так и в симбиотических состояниях с растениями и животными (Беляков, 1990; Vandamme, 2001; Segonds, Chabanon, 2001; Colwell et al., 1995). Учитывая способность утилизировать широкий набор простых и сложных химических соединений, в том числе и токсических, В. cepacia используется для биоремидиации почвы (Holmes et al., 1998). Однако при этом приходится считаться с тем, что В. cepacia способна вызывать патологические изменения у растений, животных и человека (Rahme et al., 2000; Segonds, Chabanon, 2001; Speert et al., 2002).
Наиболее остро стоит проблема инфекции В. cepacia для больных муковисцидозом, у которых возможно возникновение серасіа-тндг рома, характеризующегося формированием некротической пневмонии и септицемией с неблагоприятным прогнозом (Шагинян, Чернуха, 2003; Hendry et al., 2000; Speert et al., 2002).
Проблемы лечения больных с В. cepacia инфекциями усложняются высокой устойчивостью этого микроорганизма к большинству современных антибиотиков, причем в ходе лечения возможно появление полирезистентных клонов, поэтому цикл химиотерапии этих пациентов длительный и базируется на комплексном сочетании антибиотиков с разным механизмом действия (Conway etal.,2003;Gibson et al.,2003).
Диагностика инфекций, вызванных В. cepacia, в настоящее время весьма несовершенна, идентификация культур и их внутривидовая дифференциация, как средство эпидемиологического анализа, требует высокого уровня подготовки специалистов и наличия специальных
средств генетической диагностики. Это возможно обеспечить только в специализированных центрах, в обычных клинических лабораториях выделение и идентификация культур В. cepacia происходит довольно редко, чаще всего подобные культуры идентифицируются как «необычные» псевдомонады или глюкозу неферментирующий вид бактерий (Беляков, 1990). В лабораториях, располагающих полуавтоматическими системами идентификации типа API, Nefermtest, Vitek, культуры В. cepacia идентифицируются чаще, однако этим методом они не дифференцируются на геномовары (виды группы В. cepacia) и не позволяют отличить от В. cepacia ряд близкородственных видов буркхольдерий.
Особенно опасны случаи неточности определения вида на уровне идентификации филогенетически близких возбудителей особо опасных инфекций В. mallei и В. pseudomallei как В. cepacia, что приводит к нарушениям режима работы и внутрилабораторным инфекциям (Schlech et al., 1981).
Цель работы: изучение культуральных, биохимических, патогенных свойств коллекции культур В. cepacia для установления набора тестов, имеющих принципиальное значение для разработки схемы идентификации и внутривидового типирования штаммов В. cepacia. Задачи исследования.
Выявить фенотипические признаки, имеющие принципиальное значение для установления видовой принадлежности культур В. cepacia.
Отобрать тесты, необходимые для внутривидового типирования (эпидемиологических маркеров) штаммов В. cepacia.
Оценить диапазон чувствительности культур В. cepacia к антибактериальным препаратам с целью разработки терапевтических рекомендаций и создания селективных сред.
Разработать практическую схему лабораторной идентификации и дифференциации культур В. cepacia.
Научная новизна.
В результате исследования набора штаммов В. cepacia и филогенетически близких буркхольдерий отобраны основные фенотипические дифференциальные признаки и разработан алгоритм идентификации культур вида В. cepacia.
Показана перспективность использования иммунологических реакций (РДД, МФА), особенно на этапе предварительной идентификации.
Изучен спектр чувствительности штаммов В. cepacia к современным химиотерапевтическим препаратам, и даны рекомендации по их использованию в диагностических и лечебно-профилактических целях.
Выявлены фено- и генотипические признаки внутривидовой дифференциации штаммов В. cepacia как факторов эпидемиологического анализа. Приоритетность исследований подтверждается двумя патентами на изобретение, оформленными по материалам диссертационной работы.
Теоретическая и практическая значимость. Проведенные исследования по идентификации буркхольдерий показали необходимость комплексных исследований с применением морфологических, биохимических, иммунологических и генетических методик, т. е. представлены доказательства необходимости использования принципов полифазной таксономии для идентификации и типирования бактерий рода Burkholderia.
Разработана схема идентификации В. cepacia, позволяющая определять вид, геномовары и биовары в условиях клинической бактериологической лаборатории. В лекционно-практический курс отдела подготовки специалистов по особо опасным инфекциям введен раздел принципов полифазной таксономии буркхольдерий, позволяющий на современном уровне устанавливать как видовую принадлежность, так и проводить инфравидовое разграничение исследуемых культур буркхольдерий.
На основании изучения спектра чувствительности культур В. cepacia к антибактериальным препаратам, предложен набор антибиотиков, пригодных для химиотерапии и разработки селективных сред.
Материалы диссертационной работы использованы при подготовке «Методических рекомендаций по приготовлению и использованию питательной среды для дифференциальной диагностики патогенных и близкородственных буркхольдерий», утвержденных директором Волгоградского НИПЧИ В. В. Алексеевым 12.12.2007 г.
Штамм В. cepacia КМ 203 - авирулентный продуцент сапного бактериофага депонирован в государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» 27.12.2006 г. Получен патент на изобретение №2339690 от 27.11. 2008 г «Штамм бактерий Burkholderia cepacia -авирулентный продуцент бактериофага, лизирующего культуры сапа». Получено решение о выдаче патента на изобретение от 05.05.2009 г. «Питательная среда для выделения возбудителя сапа», заявка № 2007126294, дата подачи заявки 10.07.2007 г.
Положения, выносимые на защиту:
1) отобранные на основе изучения фенотипических свойств культур В. cepacia стабильные и вариабельные признаки позволили создать практическую схему идентификации с определением вида и биоваров штаммов В, cepacia;
иммунологические методы диагностики (РДД и МФА) позволяют исключать или отрицать принадлежность культур к виду В. cepacia на стадии предварительной идентификации;
изучение антибиотикочувствительности культур В. cepacia позволяет выявить препараты, рекомендуемые для лечения инфекций (карбапенемы, хинолоны, тетрациклины), а также применяемые при создании селективных сред (полимиксин В, гентамицин, ванкомицин).
4) идентификация культур вида В. cepacia с помощью автомати
ческих тест-систем (API 20 NE или NEFERM-test) позволяет с вы
сокой степенью достоверности (> 90 %) установить видовую принад
лежность исследуемых культур, однако с целью исключения гипер
диагностики за счет филогенетически близких видов буркхольдерий,
требует постановки дополнительных лабораторных тестов;
5) принцип полифазной таксономии требует для окончательной идентификации штаммов В. cepacia комбинированного исследования культур с применением методов генотипического, фенотипического, серологического исследования, позволяющих в конечном итоге установить принадлежность культур не только к виду, но и к определенному био- или геномовару), что имеет важное значение для эпидемиологического анализа инфекций В. cepacia.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь,2007), на VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007) а также на научных межлабораторных конференциях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института в 2007,2008 гг.
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе одна из них в периодическом издании из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования науки России
и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени, получен один патент на изобретение.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 125 листах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 194 источника, в том числе 47 отечественных и 147 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 8 рисунками.
