Введение к работе
Актуальность работы. Муковисцидоз (кистозный фиброз) — тяжелое системное генетически детерминированное заболевание, обусловленное мутацией трансмембранного регулятора муковисцидоза, характеризующееся поражением экзокринных желез. Оно поражает все внутренние органы, выделяющие слизь, в первую очередь - легкие и пищеварительную систему. (Капранов Н.И., 1974, 1985, 1995, 2001; Самсонова М.В., Черняев А.Л., Амелина Е.Л., 2006).
На сегодняшний день это самое распространенное аутосомно-рецессивное наследственное заболевание среди представителей белой европеоидной расы и встречается в среднем у 1 из 400 родившихся детей. В большинстве стран Европы и Северной Америки муковисцидозом заболевают от 1:2000 до 1:4000 новорожденных. Частота гетерозиготного носительства мутантного гена среди населения в ряде стран (США, Швейцария, Франция), а также в нашей стране составляет от 2 до 20%. Прогноз заболевания в первую очередь зависит от поражения органов дыхания, в патогенезе которого весомую роль играет инфекция. Больные муковисцидозом на протяжении всей жизни страдают от рецидивирующих и хронических инфекций респираторного тракта, которые являются основной причиной заболеваемости, частых госпитализаций и смертности. Инфекционное поражение респираторного тракта является причиной смерти более чем 90% больных MB. (Капранов Н.И., Шабанова Л.А., Каширская Н.Ю. и др., 2002). Инфекционные осложнения при муковисцидозе характеризуются полиэтиологичностью, при. этом лидирующее положение занимают S. aureus, Haemophilus influenzae и P. aeruginosa, причем два первых микроорганизма выявляются главным образом у детей раннего возраста, тогда как для более старших возрастных групп основное значение приобретает синегнойная папочка. (Шагинян И.А., Чернуха М.Ю., 2005). Инфекция, вызванная В. cepacia, развивается обычно на фоне хронической колонизации Pseudomonas aeruginosa. Нередко присоединение В. cepacia ведет к быстрому прогрессированию бронхолегочного процесса при муковисцидозе, в ряде случаев - с летальным исходом (Капранов Н.И., Шабалова Л.А., Каширская Н.Ю. и др., 2002; Капустина Т.Ю., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И. и др., 2005).
Инфицирование больных муковисцидозом бактериями комплекса В. cepacia представляет особую опасность, так как данный микроорганизм обладает природной антибиотикоустойчивостью и быстро приобретает резистентность к антимикробным препаратам. Это затрудняет его эрадикацию в процессе лечения, приводя к быстрому переходу острой инфекции нижних дыхательных путей в хроническую форму и значительному ухудшению функции легких. (Зубков М.Н., Самойленко В.А., Гугуцидзе Е.Н., 2001; Leitao J. Н., Sousa S. A., Cunha М. V. et al.,
2008). Больные, инфицированные В. cepacia, являются источником возбудителя этой инфекции и представляют опасность для других пациентов. Также этот возбудитель способен вызывать так называемый «цепация-синдром» - некротизируюшую пневмонию с септицемией, нередко приводящую к летальному исходу. (Isles et al., 1984, Gilligan P.H.,1995, Lutter E., Lewenza S., Dennis J.J. et al., 2001).
Кроме того, колонизация нижних дыхательных путей бактериями В. cepacia является противопоказанием для пересадки легких, являющейся важной частью программы по увеличению продолжительности жизни у больных, муковисцидозом. (Liou T.G., Adler F.R., FitzSimmons S.C. et al., 2001).
Эпидемиологические проявления хронической инфекции В. cepacia остаются малоизученными, поскольку не внедрены пока в широкую практику лабораторные методы этиологической диагностики этой инфекции, поэтому она не подлежит официальной регистрации, и отсутствуют сведения о широте ее распространении в популяции.
К началу наших исследований при инфекционных осложнениях (бронхитах, пневмониях) у больных муковисцидозом исследователи выделяли из мокроты больных Burkholderia cepacia, но не было ясно, способны ли данные бактерии самостоятельно вызывать легочную инфекцию или являются только маркером тяжелого поражения легких. Не был изучен вопрос, в каком возрасте происходит колонизация больных этими возбудителями, в какие сроки начинает развиваться хроническая или персистирующая инфекция и как она формируется, какие микроорганизмы доминируют при колонизации и в каких сочетаниях. Также не были достаточно изучены эпидемиологические особенности: источники инфекции, механизмы и пути распространения возбудителя и широта циркуляции штаммов В. cepacia в популяции больных муковисцидозом.
В течение последнего десятилетия были получены данные о том, что бактерии В. cepacia являются оппортунистическими микроорганизмами, способными вызывать внутрибольничные инфекции (раневые, катетер-ассоциированные инфекции, пневмонии). В последнее время участились случаи госпитальных пневмоний, вызванных В. cepacia, у послеоперационных больных, находящихся на искусственной вентиляции легких (Чернуха М.Ю., 2008). В настоящее время вместо термина «внутрибольничные (госпитальные, нозокомиальные) инфекции» в научной литературе, публикациях ВОЗ и нормативных документах большинства стран мира используется термин «инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи» - «healthcare-associated infections - HALs» как более точный и объединяющий характер этого понятия. (В.И. Покровский, В.Г. Акимкин, Н.И. Брико, 2011).
Бактерии комплекса В. cepacia обладают одним из самых сложных и пластичных геномов, что обусловливает сложность идентификации и дифференциации этого возбудителя внутрибольничных инфекций, до настоящего времени оставляя его за пределами внимания госпитальных эпидемиологов и микробиологов клинических лабораторий.
Среди всех представителей бактериальной микрофлоры: P. aeruginosa, S. aureus, Haemophilus influenzae, грибы рода Candida, Stenotrophomonas spp., Acinetobacter spp. (Шагинян И.А., Капранов Н.И. и др., 2010), способных вызывать хроническую инфекцию у больных муковисцидозом, диагностика и типирование бактерий комплекса В. cepacia представляет наибольшие трудности, так как требует комплекса микробиологических и молекулярно-генетических методов. Таких разработок в стране до настоящих исследований не было, поэтому практические клинические лаборатории испытывают трудности с идентификацией бактерий этого вида. Точная и быстрая индикация и идентификация данного возбудителя необходима для ранней диагностики, вьывления потенциальных источников возбудителя инфекции и определения других эпидемиологических особенностей.
Для того чтобы изучить ряд важных вопросов эпидемиологии и микробиологии инфекций, вызванных В. cepacia, необходимо было разработать такой алгоритм идентификации и типирования данного возбудителя, который бы позволял: а) идентифицировать его до геномовара; б) изучать его патогенные свойства; в) определять потенциальную способность В. cepacia вызывать хроническую инфекцию; г) выявлять эпидемиологическую значимость штаммов.
Цель работы: изучить эпидемиологические и микробиологические особенности формирования хронической инфекции, вызванной бактериями комплекса В. cepacia у больных муковисцидозом, с помощью разработанных молекулярно-генетических схем идентификации и типирования.
Задачи исследования;
-
Изучить структуру микрофлоры нижних дыхательных путей у детей разных возрастных групп, страдающих муковисцидозом для определения эпидемиологической значимости бактерий комплекса В. cepacia.
-
Усовершенствовать алгоритм идентификации и типирования бактерий комплекса В. cepacia с целью улучшения диагностики инфекций, вызванных данным возбудителем.
-
Создать коллекцию клинических штаммов В. cepacia, вьщеленных от пациентов Российского Центра Муковисцидоза, многопрофильных стационаров г. Москвы и других регионов Российской Федерации. Изучить особенности штаммов данного возбудителя (генетическое родство, устойчивость к антибиотикам, патогенные свойства) с целью получение данных о структуре популяций госпитальных штаммов и изучения их широты циркуляции среди больных муковисцидозом и пациентов многопрофильных клиник.
-
Провести многолетний молекулярно-генетический мониторинг штаммов В. cepacia, выделенных от больных муковисцидозом, для определения возможных источников инфекции и путей передачи возбудителя, характеристик персистирующих штаммов («микроэволюция»).
-
Выяснить эпидемиологические и микробиологические закономерности формирования, распространения и циркуляции штаммов В. cepacia в лечебно-профилактических учреждениях, используя методы молекулярной эпидемиологии.
6. Обосновать тактику профилактических мероприятий для
предупреждения инфицирования пациентов данным возбудителем и
ограничения распространения инфекции, вызванной В. cepacia, в
стационарах разного профиля.
Научная новизна
Оценено эпидемиологическое значение бактерий комплекса В. cepacia. Показано, что характерным проявлением инфекционных осложнений у больных муковисцидозом является смешанная инфекция, вызванная ассоциацией микроорганизмов, среди которых особое значение имеет сочетание В. cepacia и Pseudomonas aeruginosa.
Доказано, что у больных муковисцидозом штаммы В. cepacia, не элиминируются, а длительно персистируют в нижних дыхательных путях, что имеет важное эпидемиологическое значение, так как эти больные являются источниками возбудителя инфекции и представляют угрозу для других пациентов.
Установлено, что бактерии комплекса В. cepacia способны формировать биопленки на различных поверхностях и медицинских приборах и передаваться от пациента к пациенту.
Собрана и охарактеризована российская коллекция штаммов бактерий комплекса В. cepacia по фенотипическим и генотипическим признакам, в том числе методами молекулярной эпидемиологии с помощью ПЦР и
пульсэлектрофореза, что может быть использовано для дальнейших эпидемиологических исследований.
Разработанный алгоритм для идентификации и типирования бактерий В. cepacia дополнен ПЭФ и апробирован на коллекции штаммов В. cepacia с целью усовершенствования лабораторной диагностики данного возбудителя.
Обоснована тактика профилактических мероприятий для предупреждения инфицирования больных муковисцидозом штаммами В. cepacia и распространения этой инфекции в стационарах, состоящая в ранней и точной диагностике инфекции, вызванной данным возбудителем, изоляции и ограничении контактов больных, дезинфекции инфицированных предметов.
Практическая значимость
Впервые усовершенствованы методы лабораторной диагностики штаммов бактерий комплекса Burkholdereria cepacia с помощью алгоритма, включающего в себя молекулярно-биологические методы (ПЦР, пульсэлектрофорез) для ранней диагностики В. cepacia и выявления возможных источников инфекции;
Изучена широта распространения штаммов В. cepacia в Российском Центре Муковисцидоза, многопрофильных стационарах г. Москвы и других регионов РФ;
Рекомендованы профилактические мероприятия для снижения риска инфицирования больных муковисцидозом штаммами В. cepacia;
На основе полученных результатов разработаны Методические рекомендации «Выявление и идентификация бактерий комплекса Burkholdereria cepacia» (Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Шагинян И.А., Москва, 2005) для клинических бактериологических лабораторий, утвержденные советом по внедрению ФГБУ «НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России, и учебно-методическое пособие для врачей-бактериологов «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и её применение в бактериологии» (Ред. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Москва, 2006).
Положения, выносимые на защиту
1. Показана необходимость совершенствования тактики лабораторной диагностики инфекции, вызванной В. cepacia, поскольку применение для идентификации штаммов бактерий комплекса В. cepacia только коммерческих биохимических тест-систем в ряде случаев может приводить к ошибкам идентификации. Геномовары В. cepacia имеют
очень похожие фенотипические признаки, их невозможно дифференцировать, учитывая только биохимические тесты. Также невозможно поставить этиологический диагноз по клиническим проявлениям инфекции.
2. Вьивлено, что наиболее эпидемиологически значимым является
геномовар В. cenocepacia подтип ЗА. В каждом регионе РФ циркулируют
специфические для этих территорий штаммы. В московском регионе
установлена циркуляция штаммов, характерных как для данного
стационара, так и общих для нескольких клиник
3. Больные муковисцидозом, инфицированные В. cepacia, могут быть
опасны как источник инфекции для других пациентов, т.к. штаммы В.
cepacia не элиминируются из нижних дыхательных путей в течение
длительного времени. Штаммы В. cepacia способны формировать
биопленки на различных поверхностях и медицинских приборах и
представлять эпидемиологическую опасность для пациентов клиник.
Апробация материалов диссертации
Материалы диссертации доложены на III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва 2004); 5-й Всероссийской конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва 2004); международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней» (Санкт- Петербург 2003); IV Российской научной конференции (Оренбург 2003); XXXVII научной конференции «Оптимизация больничной среды средствами новых технологий» (Санкт-Петербург 2004); Международном конгрессе МАКМАХ (Москва 2006); конференции «Инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами» (Москва 2007); X Национальном конгрессе «Муковисцидоз у детей и взрослых» (Ярославль, 2011).
Апробация диссертации состоялась 29.06.11 на научной конференции отделов эпидемиологии и медицинской микробиологии ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России.
Все исследования, представленные в работе, были проделаны лично автором.
Публикации
По результатам исследований опубликовано 19 работ, в том числе 6 статей, в журналах рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы
