Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 9
1.QS системы luxi-luxr тип а грамотрицательных бактерий 9
1. 1Функционирование QS системы LuxI-LuxR типа на примере Vibrio jischeiі . 9
1.2 АГЛ и функионирование Luxl—подобных белков 12
1.3 Функционирование LuxR-подобных белков '. 13
2. QS Системы грамположительных бактерий с участием аи пептидной природы 15
3.QS Системы, использующие АИ-2 V. 18
4. Обобщение данных о наиболее изученных синтазах аутоиндукторов, участвующих в синтезе агл и аи-2 : '. 22
5. QS системы бактерий рода pseudomonas 23
5.1. QS система Pi aeruginosa 23
5.1.1 LasI-LasR и Rhll-RhlR системы регуляции 23
5.1.2 Регуляция QS системы P. aeruginosa дополнительными факторами 27
5.2 QS системы других видов Pseudomonas '. 34
5.2.1 Pseudomonas aureofaciens /Pseudomonas chlororaphis 34
5.2.2. Pseudomonasfluorescens 36
5.2.3 Pseudomonas putida 37
5.2A Pseudomonas syringae 38
6. QS система бактерий комплекса bvrkholderia cepacia 39
. Материалы и методы 43
1. Среды и условия культивирования 43
2. Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды 43
3. Определение продукции АГЛ 48
4. Экстракция АГЛ из супернатантов и проведение идентификации АГЛ в культуралъных экстрактах
: 48
5. Методы работы с ДНК. 50
6. Транспозонный мутагенез и определение локализации инсерции минитранспозона. 52
7. Пласпозонный мутагенез и определение места инсерции пласпозона. 53
8. Идентификация генов с помощью ПЦР 54
9. Клонирование генов 55
10. Получение инсерционных мутантов P. chlororaphis 449 методом замены генов 57
П. Определение экспрессии гена у/г в клеточных лизатах 59
12. Анализ ферментативных активностей. 60
13. Определение способности клеток бактерий к миграции по поверхности среды (сворминг) 63
14. Определение антагонистической активности 63
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ. 65
А. Изучение quorum sensing регуляции у pseudomonas chlororaphis 65
1. Скрининг штаммов, синтезирующих агл, из коллекции почвенных бактерий 65
2. Характеристика группы бактерий p. chlororapbis 69'
2.1 Определение экзопротеазной, хитинолитической, полигалактуроназной и антагонистической активности у штаммов P. chlororaphis 69
2.2 Исследование влияния температуры на синтез АГЛ, феназиновых антибиотиков, экзопротеазную активность у штаммов P. chlororaphis . 72'
2.3 Идентификация с помощью ПЦР генов двух QS систем и генарЫОу штаммов P. chlororaphis 73
3. Quorum sensing системы p. chloroiuph1s449 и изучение их роли в регуляции клеточных процессов .74
3.1 Клонирование и секвенирование геновphzl, csal из P. chlororaphis 449 74
3.1.1 Клонирование генарШ из P. chlororaphis 449 74
3.1.2 Клонирование гена csal из P. chlororaphis 449 75
3.2 Получение мутации в гене csal у P. chlororaphis 449 77
3.3 Исследование влияния мутации в гене csal на свойства P. chlororaphis 449 78
3.3.1 Продукция АГЛ в штамме P. chlororaphis с мутацией в гене csal 78
3.3.2 Активность экзопротеаз в клетках штамма P. chlororaphis с мутацией в гене csal. 80
3.3.3 Липазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449 и штамма с мутацией в гене csal. 80
3.3.4 Полигалактуроназная и пектинметилэстеразная активность в клетках штамма P. chlororaphis с мутацией в гене csal. 81
3.3.5 Фосфатазная активность в клетках штамма/*, chlororaphis 449 и штамма с мутацией в гене csal. 81
3.3.6 Антагонистическая активность штамма P. chlororaphis с мутацией в гене csal. 82
3.3.7 Определение способности клеток штамма P. chlororaphis 449 и штамма P. chlororaphis с мутацией в гене csal к миграции по поверхности среды (сворминг) 82
3.4 Влияние плахмиды рМЕ6863, содержащей клонированный ген N-ацип-гомосерин лактоназы, на синтез АГЛ и регуляцию клеточных процессов P. chlororaphis 449. 83
4. Исследование взаимодействия двухкомпонентнои системы GACA-GACS с QS системой и ее роли в регуляции клеточных пюцессов у л chlorotbtphls 449 86
4.1 Получение транспозонных мутантов P. chlororaphis 449 с инактивированным геном gacS. 86
4.2 Клонирование и секвенирование части zeuagacS из P. chlororaphis 449 87
4.3 Исследование влияния .мутации в гене gacS на свойства P. chlororaphis 449 88
4.3.1 Продукция АГЛ в штамме P. chlororaphis 449 с мутацией в генерал!? 88
4.4.1 Активность экзонротеаз в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS. 88
4.4.2 Липазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS 89
4.4.3 Полигалактуроназная и пектинметнлэстеразная активность в клетках в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS 89
4.4.4 Фосфатазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449с мутацией в гене gacS 89
4.4.5 Антагонистическая активность штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS. 89
4.4.6 Определение способности клеток штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене gacS к миграции по поверхности среды (сворминг) 90
5. Клонирование, секвенирование и экспрессия гена vfr p. chlororaphis449, изучение его роли в регуляции клеточных процессов 90
5.7 Идентификация, клонирование и секвенирование гена vfr из P. chlororaphis 449. 90
5.2 Анализ аминокислотных последовательностей белков — гомологов Vfr и проведение исследования
экспрессии гена vfr из P. chlororaphis 449 92
5.2.1 Выравнивание последовательностей белков — гомологов Vfr 93
5.2.2 Клонирование гена vfr из P. chlororaphis 449 в экспрессионном векторе рЕХ20Т 94
5.2.3 Комплементация мутации в гене сгр в клетках Е. coli с помощью гена vfr аз P. chlororaphis 449 95
5.3 Получение инсерционногомутанта P. chlororaphis 449 с инактивированным геном vfr 96
5.4 Исследование влияния мутации в гене vfr на свойства P. chlororaphis 449 97
5.4.1 Продукция АГЛ в штамме P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr 97
5.4.2 Активность экзопротеаз в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr 97
5.4.3 Липазная активность в клетках штамма-P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr 98
5.4.4 Полигалактуроназная и пектинметнлэстеразная активность в клетках в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr 98
5.4.5 Фосфатазная активность в клетках штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr 98
5.4.6 Антагонистическая активность штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr 98
3.4.1 Определение способности клеток штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене vfr к миграции по поверхности среды (сворминг) 99
6. ПОЛУЧЕНИЕ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ ФЕНАЗИНОВОГО ОПЕРОНА P. CHLOROMPHIS 449 и ХАРАКТЕРИСТИКА
МУТАНТНЫХ ШТАММОВ : 102
В. ИЗУЧЕНИЕ QUORUM SENSING СИСТЕМЫ BURKHOLDERIA CEPACIA, РЕГУЛЯЦИИ.ЕЕ
ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С СИНТЕЗОМ ФАКТОРОВ ПАТОРЕННОСТИ
107
1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКЦИИ АГЛ в КОЛЛЕКЦИИ ШТАММОВ в. CEPACIA 107
2. ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ В. CEPACIA 108
2.1 Определение с помощью ПЦР генов QS системы CepI/CepR в коллекции штаммов В. cepacia 108
2.2. Изучение продукции потенциальных факторов патогенності!у штаммов В. cepacia 108
2.3 Определение антагонистической активности клинических штаммов В." cepacia по отношению к
P. aeruginosa и S. aureus. 109
3. ИЗУЧЕНИЕ QS СИСТЕМЫ, ЕЕ РЕГУЛЯЦИИ И РОЛИ В РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ У В. CEPACIA 370.. 111
3.1 Клонирование генов серій cepR из В. cepacia 370 ///
3.1.1 Клонирование гена сері из В. cepacia 370 111
3.1.2 Клонирование гена cepR из В. сераа'а370 113
3.2 Получение мутантных штаммов В. cepacia 370 с измененной продукцией АГЛ 115
3.3 Исследование влияния мутаций в генахpps, clpX, Ion на свойства В. cepacia 370 118
3.3.1 Определение продукции АГЛ 118
3.3.2 Определение экзопротеазной и липазной активности 120
3.3.3. Подавление роста фитопатогенного грнба Sclcrotinia sclerotiorum 120
3.3.4 Определение гемолитической активности 121
3.3.5 Определение способности клеток к миграции по поверхности среды (сворминг) 121
V. ОБСУЖДЕНИЕ 122
VI. ВЫВОДЫ 133
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- 1Функционирование QS системы LuxI-LuxR типа на примере Vibrio jischeiі
- Регуляция QS системы P. aeruginosa дополнительными факторами
- Экстракция АГЛ из супернатантов и проведение идентификации АГЛ в культуралъных экстрактах
- Определение экзопротеазной, хитинолитической, полигалактуроназной и антагонистической активности у штаммов P. chlororaphis
Введение к работе
Актуальность проблемы
Последние 10 лет внимание многочисленных исследователей, работающих с микроорганизмами в различных областях биологии и медицины, обращено на явление, получившее название Quorum Sensing (QS). QS— особый тип регуляции экспрессии генов, зависящей от плотности популяции бактерий; он основан на действии низкомолекулярных сигнальных молекул различной природы, аутоиндукторов,. которые накапливаются в культуре при высоких плотностях популяции бактерий. С помощью аутоиндукторов осуществляется коммуникация бактерий — передача информации.-между клетками бактерий, принадлежащих к одному и тому же или к разным видам, родам, и даже семействам. Примером аутоиндукторов грамотрицательных бактерий, являются ацил-гомосеринлактоны (АГЛ). Благодаря QS регуляции-бактерии*получают возможность координированное контролировать экспрессию генов* во всем сообществе. Передача информации* от клетки к клетке с использованием QS систем, которая приводит к индукции специализированных наборов генов, способствует быстрой адаптации» популяций бактерий к меняющимся условиям и их выживанию в природной среде.
В настоящее время QS регуляция обнаружена-более чем* у 50 видов< бактерий: Регуляторные. системы типа QS участвуют, во взаимодействии бактерий: с высшими' организмами— животными и растениями, в регуляции вирулентности, формировании* биопленок, регуляции экспрессии генов, связанных с синтезом различных экзоферментов, токсинов, антибиотиков и других вторичных метаболитов, в конъюгации и др. Исследование QS систем регуляции, их роли в метаболизме и взаимодействии, бактерий-определяет новый подход к изучению-поведения.бактерий в природных условиях. ЭТИ' исследования могут иметь огромное прикладное значение.
Особое внимание уделяется изучению роли QS в регуляции патогенности бактерий; Используя QS системы регуляции, патогенные бактерии, при достижении высокой < плотности популяции начинают синхронный синтез факторов вирулентности, вызывающих разрушение тканей организма, что способствует успешному преодолению бактериями иммунного ответа организма-хозяина. Данный факт обусловил появление нового направления, связанного с использованием QS регуляции в качестве потенциальной мишени для борьбы с инфекционными заболеваниями. Лекарственные средства, подавляющие функционирование QS систем, направлены непосредственно на подавление патогенности бактерий и получили название «ядов патогенности». В настоящее время этот подход рассматривается как новая, перспективная стратегия антимикробной терапии. Подобные лекарственные препараты могут быть
перспективными для использования не только в медицине, но и для борьбы с бактериальньми инфекциями животных и растений в сельском хозяйстве, а также в пищевых технологиях.
Большой интерес вызывает изучение QS регуляции у бактерий, используемых для биологической борьбы с заболеваниями растений, вызываемыми фитопатогенными грибами и бактериями. Экологически безопасные биологические методы защиты растений с помощью бактерий— антагонистов фитопатогенов рассматриваются как важная альтернатива традиционным методам, связанным с применением химических пестицидов. Использование и модификации QS систем могут повысить эффективность бактерий, используемых для биологической борьбы с заболеваниями растений.
В данной работе исследуются QS системы грамотрицательных бактерий двух родов — почвенных бактерий Pseudomonas chlororaphis, антагонистов фитопатогенных микроорганизмов, и бактерий Burkholderia cepacia, являющихся патогенами человека.
Цель работы и задачи исследования
Целью настоящей работы было изучение QS систем у Pseudomonas chlororaphis и Burkholderia cepacia, регуляции их функционирования и взаимодействия с клеточными процессами этих бактерий. В соответствии с этим в работе ставились следующие задачи:
исследовать распространение способности продуцировать АГЛ у почвенных и* ризосферных бактерий, включающих, различные виды Pseudomonas, и у клинических штаммов В. cepacia;
охарактеризовать ризосферные штаммы P. chlororaphis, продуценты АГЛ, исследовать их способность проявлять антагонистическую активность в отношении фитопатогенов, определить ряд ферментативных активностей, существенных для обитания бактерий в природных условиях;
охарактеризовать клинические штаммы В. cepacia, продуценты АГЛ, определить их способность продуцировать потенциальные факторы патогенности;
исследовать QS системы штамма P. chlororaphis 449, клонировать и секвенировать гены синтаз АГЛ, изучить взаимосвязь QS систем с регуляцией клеточных процессов;
исследовать QS систему штамма В. cepacia 370, идентифицировать гены серій cepR;
исследовать регуляцию функционирования QS систем P. chlororaphis 449 и В. cepacia 370, выяснить роль некоторых глобальных регуляторов экспрессии бактериальных генов в регуляции QS систем и их участие в регуляции клеточных процессов этих бактерий.
7 Научная новизна и практическая значимость
Изучена способность к синтезу АГЛ среди большого количества почвенных и ризосферных бактерий. Полученные данные свидетельствуют о широко распространенной способности псевдомонад синтезировать АГЛ; продукция АГЛ была обнаружена у 17% исследованных штаммов, при этом частота встречаемости продукции АГЛ варьировала у разных видов Psendomonas.
У группы штаммов P. chlororaphis, активных продуцентов АГЛ, выделенных в различных географических зонах, были идентифицированы гены двух QS систем (phzl, phzR и csal, csaR); т.к. все тестируемые штаммы были выделены из очень отдаленных мест, мы сделали вывод о частой встречаемости этих двух систем QS регуляции у почвенных штаммов P. chlororaphis. У штамма P. chlororaphis 449 гены phzl, csal, кодирующие синтазы АГЛ двух QS систем регуляции, были клонированы и .секвенированы. Показано, что клетки штамма 449 продуцируют 4 типа АГЛ, а именно. М-бутаноил-Ь-гомо серии лактон, К-гексаноил-Ь-гомосеринлактон, №(3-оксо-гексаноил)-L-гомосерин лактон, а также минорный, не определенный пока тип АГЛ, предположительно, >ї-(3-оксо-октаноил)-Ь-гомосеринлактон. Сравнение этих данных с имеющимися в литературе для P. chlororaphis позволяет высказать предположение о присутствии в клетках штамма PI chlororaphis 449 третьей QS^ системы, дополнительной к^ уже описанным.
Показано, что исследованные штаммы P. chlororaphis являются антагонистами широкого спектра фитопатогенных грибов и бактерий, синтезируют феназиновые антибиотики. Изучив свойства полученных нами производных штамма P. chlororaphis 449, несущих мутации в генах феназинового оперона (phzA, phzB, phzO), мы определили, что феназины играют существенную роль в антагонизме исследуемого штамма в отношении фитопатогенных грибов и бактерий. Впервые было обнаружено, что штаммы P. chlororaphis проявляют полигалактуроназную (ПГ) и пектинметилэстеразную (ПМЭ) активности (работа проводилась совместно с сотрудниками Института биохимии' РАН Проценко М.А. и Бузой Н.Л.).
На основании изучения мутантов P. chlororaphis 449 с инактивированным геном gacS показано, что GacA-GacS глобальная система регуляции положительно регулирует синтез всех типов АГЛ, феназиновых антибиотиков, экзопротеаз, ПГ, ПМЭ, антагонистическую активность этого штамма и практически не влияет на липазную и фосфатазные активности.
Впервые у P. chlororaphis клонирован, секвенирован, экспрессирован ген vfr, определена его локализация в хромосоме (у P. aeruginosa этот ген является глобальным
регулятором и принимает участие в контроле синтеза АГЛ). Показано, что белок Vfr P. chlororaphis 449 гомологичен соответствующему белку P. aeruginosa и белку CRP Escherichia coli, частично комплементирует мутацию в гене сгр Е. coli. Изучение полученного инсерционного vfr' мутанта показало, что белок Vfr P. chlororaphis 449 не участвует в регуляции синтеза АГЛ, феназиновых антибиотиков и исследованных ферментов.
Изучена способность клинических штаммов Burkholderia cepacia продуцировать АГЛ. Обнаружено, что 94% исследованных штаммов синтезировали АГЛ. У всех штаммов был идентифицирован ген QS системы cepR, у большинства штаммов был определен ген сері. Было показано, что штамм В. cepacia 370 синтезирует четыре вида АГЛ: М-гексаноил-Ь-гомосеринлактон, М-октаноил-Ь-гомосеринлактон и два минорных компонента, не определенные в настоящее время. Гены cepR и сері этого штамма были клонированы и секвенированы.
Впервые у бактерий В. cepacia были получены мутанты с инактивированными генами clpX и Ion (кодируют специфические протеиназы, глобальные регуляторы экспрессии! генов), а также мутант с инактивированным геном pps (кодирующим фосфоэнолпируватсинтазу). Показано, что мутации в генах clpXnpps увеличивают синтез АГЛ, а мутация» в гене Ion приводит к его резкому снижению. Определено влияние мутаций в этих генах на синтез потенциальных факторов патогенности (гемолизинов, экзопротеаз, липаз).
Практическая значимость работы связана с возможностью использования полученных данных об антагонистической активности и ее регуляции у P. chlororaphis 449 для/ разработки препаратов для биологической защиты растений на основе P. chlororaphis. Данные о регуляции синтеза потенциальных факторов патогенности у В. cepacia могут быть использованы в разработке методов подавления патогенных свойств данной бактерии.
1Функционирование QS системы LuxI-LuxR типа на примере Vibrio jischeiі
Наиболее подробно изучена QS система у биолюминесцентной морской бактерии V. fischeri. Рассмотрим функционирование QS систем LuxI-LuxR типа на примере этой бактерии.
Экологической нишей для V. fischeri служат светящиеся . орг&ны морских животных— рыб, головоногих моллюсков. Такой симбиоз взаимовыгоден. Бактерии получают от хозяина питательные вещества и укрытие. В случае с головоногим моллюском Euprymna scolopes свечение бактерий, напоминающее лунный свет, делает незаметным хозяина для хищников снизу, т.к. тело моллюска теряет тень.
Свечение зависит от плотности популяции бактерий. В толще морской воды популяция клеток невелика, и они не светятся. В светящихся органах культура V. fischeri достигает высокой плотности (10й клеток/мл) и происходит свечение [86].
Свечение обеспечивает фермент люцифераза; ее структурные гены (ІихАВ) являются- частью hixICDABE оперона с промотором PR (рис. 1). Гены luxA и luxB кодируют, соответственно, субъединицы аир люциферазы, гены luxCDE кодируют редуктазу жирных кислот (один из окисляемых субстратов, в ходе люциферазной реакции, приводящей к испусканию кванта света). Ген luxl кодирует Luxl, ацил-гомосеринлактон синтазу, ответственную за синтез аутоиндуктора Н-(3-оксогексаноил)-гомосеринлактона. Ген luxR с промотором PL является второй частью lux регулона, кодирует LuxR, транскрипционный регулятор, ответственный за связывание АИ и за активацию транскрипции luxICDABE оперона.
Схема QS регуляции /шг-оперона V. fischeri представлена на рис. 1. При низких клеточных плотностях luxICDABE оперон транскрибируется на низком базальном уровне (продуцируется низкий уровень АИ; гены, кодирующие люциферазу, обеспечивают низкий уровень свечения). АИ могут свободно диффундировать через клеточную стенку, концентрация АИ в окружающею среде становится равной внутриклеточной концентрации. По мере роста культуры АИ накапливаются до порогового уровня ( 1-10 мкг/мл), при достижении которого происходит связывание АИ с цитоплазматическим LuxR белком. Комплекс LuxR-АИ способен связываться с luxICDABE промотором и активировать продукцию.АИ1 и свечение. Комплекс LuxR-АИ также связывается с luxR" промотором; действуя как негативный1 регулятор экспрессии /их/?. Такая обратная связь регулирует механизм усиления, экспрессии luxICDABE, предохраняя клетку от расходования на свечение значительной части энергии [86; 168].
Белки Luxl и LuxR входят в семью гомологичных белков, имеющихся у разных бактерий [168; 12]. Среди белков, гомологичных Luxl и LuxR белкам V. fischeri, можно назвать Tral и TraR белки Agrobacterium tumefaciens (контролируют конъюгацию Ті1 плазмид), LasI, LasR и Rhll; RhlR белки Pseudomonas aeruginosa (контролируют синтез факторов вирулентности; образование биопленки), Esal и EsaR Pantoea stewartii (контролируют биосинтез факторов вирулентности; капсулярного полисахарида) и-другие белки (таблица 1) [168]1
Сигнальные молекулы АГЛ состоят из гомосеринлактонного кольца, и боковых ацильных групп (таблица 2). Описано более 40 видов АГЛ, отличающихся длиной ацильных цепочек и наличием замещающих группировок. Специфичность действия АГЛ определяется количеством атомов углерода в ацильной цепочке (от С4 до Сіб) и присутствием некоторых дополнительных группировок (у третьего углерода в цепочке может быть заместитель оксо- или гидрокси-группа). АГЛ, содержащие короткие ацильные цепи, свободно диффундируют через клеточные мембраны; АГЛ с длинными ацильными цепями (начиная с Сп) для выхода из клетки нуждаются в активном транспорте [84; 121; 181].
Luxl — ацил-гомосеринлактон синтаза, ведет синтез ЗОСб-АГЛ. Субстратами для ферментов Luxl-типа служат S-аденозилметионин (SAM) и ацил-переносящий белок (АПБ), который является промежуточным соединением в пути биосинтеза жирных кислот. Luxl соединяет специфический АПБ с SAM посредством образования амидной связи между боковой ацильной цепочкой АПБ и аминогруппой гомоцистеинового мотива SAM. Последующая лактонизация образовавшегося интермедиата с высвобождением метилтиоаденозина приводит к образованию АГЛ (рис. 2). Подобный механизм биосинтеза с использованием SAM и АПБ продемонстрирован для нескольких Luxl-подобньгх белков из различных бактерий, это Luxl из V. fischeri, ТгаІ из A. tumefaciens, Rhll из P. aeruginosa. Видимо, этот путь биосинтеза очень консервативен среди Luxl гомологов [102; 171; 177; 224]. Изучение структуры белков Luxl-типа показывает, что каждый такой белок обладает ацилсвязывающим карманом, который точно соответствует боковой ацильной цепочке синтезируемого АГЛ. Благодаря этой структурной особенности каждый белок Luxl-типа производит строго определенный АГЛ [96; 235].
Белок LuxR из V. fischeri содержит два домена. N-домен (аминокислотные остатки 20—156) отвечает за связывание молекул АИ (АГЛ-связывающая область — аминокислотные остатки 79—120); стабильный комплекс LuxR-АИ образуется при достижении в среде критической концентрации АИ, примерно 3 молекул на клетку. [47; 48; 81; 209]. С-домен (аминокислотные остатки 160-250) каждого LuxR-гомолога содержит высоко консервативный мотив спираль-поворот-спираль (аминокислотные остатки 190-210), который отвечает за связывание с ДНК. После связывания АИ с N-доменом, С-домен связывается с промоторной областью ДНК. LuxR активен только в форме димера, в мультимеризации участвует С-домен. [212; 213; 214]. Для активации транскрипции /ux-оперона необходимо также взаимодействие LuxR белка с С-терминальным доменом ос-субъединицы РНК-полимеразы, ot-CTD [80; 212; 213]. LuxR в комплексе с АИ связывается» с /их-боксом промотора мишени (рис. 1). lux-бокс представляет собой инвертирований повтор из 20 п.н. в области промотора PR на расстоянии -40 от старта транскрипции. lux-бокс консервативен у разных бактерий, однако, он имеется не во всех системах этого типа. Специфичность связывания комплекса с определенным промотором определяется конкретным АИ [64; 86].
Механизм активации транскрипции /ых-оперона QS системой сходен во многих отношениях с активаторным действием белка CRP в случае промоторов II класса (связывание комплекса CRP-цАМФ со специфическим сайтом, имеющим- двойную симметрию, напоминающим сайт связывания LuxR белка и расположенным в положении-41; контакт а-субъединицы РНК-полимеразы (a-CTD), с комплексом CRP-цАМФ и т.д.).
Структурно-функциональные исследования рецепторных белков LuxR-типа показали также, что эти белки в комплексе с АГЛ становятся значительно более устойчивыми к действию протеаз (TraR — в 20 раз); связывание с АГЛ происходит только в течение синтеза этих белков на полисомах (показано для TraR белка) и приводит к правильному фолдингу этих белков [229; 249; 82]. TraR был первым примером белка, который правильно сворачивался только в присутствии низкомолекулярного лиганда [217]. Без образования комплекса с АГЛ рецепторные белки типа LuxR выделить не удавалось, т.к. они образовывали аггрегаты. Было показано, что АГЛ полностью погружен («инкапсулирован») в карман N-терминального домена TraR белка, образованный остатками гидрофобных и ароматических аминокислот, и не имеет контакта с водной средой [229].
Регуляция QS системы P. aeruginosa дополнительными факторами
QS система P. aeruginosa связана с другими клеточными глобальными регуляторными сетями, в ее контроле принимает участие множество дополнительных факторов, действующих, как правило, в зависимости от фазы роста или реагирующих на изменение условий окружающей среды в дополнение к изменению плотности популяции, на которую отвечает QS. Ниже будут рассмотрены некоторые регуляторные белки, вовлеченные в этот контроль.
Ген qscR кодирует гомолог рецепторных белков LasR и RhlR; однако, никаких дополнительных синтаз— гомологов LasI и Rhll— обнаружено не было. Белок QscR регулирует работу QS системы в зависимости от фазы роста, предотвращает раннюю экспрессию QS-контролируемых генов, репрессируя во время логарифмической фазы роста транскрипцию гена lasl. В qscR мутанте раньше, чем в штамме дикого типа, происходит синтез ЗОСі2-АГЛ и транскрипция QS-контролируемых генов (phz, hen, lasB, gwe 105) [49]. Белок QscR репрессирует синтез, по крайней мере, двух факторов вирулентности, пиоцианина и цианида. Мутация в гене qscR приводила к существенному увеличению вирулентности штамма для Drosophila melanogaster по сравнению с родительским штаммом [49]. Синтез QscR регулируется с участием белка GacA GacS/GacA двухкомпонентной системы регуляции. При низкой концентрации АГЛ белок QscR образует мультимеры; он способен образовать олигомеры, ассоциированные или с ЗОСц-АГЛ или с С4-АГЛ, и гетеродимеры с белками LasR и RhlR [49; 135]. QscR воздействует (положительно или отрицательно) на транскрипцию более чем 400 генов, большинство из которых не контролируются LasI-LasR или Rhll-RhlR QS системами. Эти гены составляют специфический QscR-регулон. Предполагают, что QscR регулирует такие гены, используя ЗОСп-АГЛ [138]. Механизм действия белка QscR пока мало понятен.
RpoS (as субъединица, РНК-полимеразы) является ключевым фактором транскрипции большого количества генов, экспрессирующихся при переходе клеток в стационарную фазу роста и при различных стрессовых воздействиях [106]. При изучении-роли as субъединицы РНК-полимеразы в- регуляции конкретных процессов, связанных с QS, было показано, что в клетках мутанта по гену rpoS повышается количество С4-АГЛ (за его синтез отвечает Rhll-синтаза), увеличивается экспрессия гена rhll, увеличивался синтез пиоцианина, цианида, транскрипция гена phzC феназинового оперона. При-этом в мутанте по гену rpoS экспрессиятенов Щ hcnA, phzA начиналась раньше, чем-в клетках штамма дикого типа, что совпадало с появлением достаточных количеств С4-АГЛ в культуре. Полученные данные позволили авторам работы сделать вывод о том, что RpoS функционирует как репрессор rhll, и репрессия проявляется в ранней логарифмической фазе роста [241].
RpoS принимает участие в контроле формирования биопленки у P. aeruginosa — еще одном процессе, зависимом от QS- [109; 111]. Подробное исследование RpoS— регулона у P. aeruginosa и взаимодействия RpoS и QS показало, что cs субъединица участвует в регуляции экспрессии 772 генов во время» стационарной фазы, роста (экспрессияІ 504 генов была, индуцирована, и 268 подавлялась). RpoS воздействует на экспрессию более чем 40 % всех генов, которые находятся под контролем QS системы, т.е. RpoS является глобальным регуляторным фактором QS-контролируемых генов при переходе клеток к стационарной фазе роста [203]. Однако, кажется более вероятным, что большинство генов, принадлежащих к обоим регулонам, регулируются отдельно и RpoS, и QS. Эти две системы могут действовать независимо, т.к. QS является ответом на высокие плотности популяции бактерий, а RpoS контролирует ответ клеток на переход к стационарной фазе роста, который в природных условиях в большинстве случаев не сопровождается повышенными плотностями популяции, но, скорее, бывает вызван такими стрессовыми воздействиями, как ограничение питательных веществ [231].
RpoN (0м субъединица РНК-полимеразы) регулирует некоторые метаболические функции и участвует в регуляции вирулентности P. aeruginosa [231; 105]. Мутанты P. aeruginosa по гену rpoN синтезировали в богатой среде вдвое больше ЗОС12-АГЛ и в 5 раз больше С4-АГЛ в ранней и поздней логарифмических фазах роста клеток, чем штаммы дикого типа. При этом экспрессия генов lasRI и rhIRI также была более высокой, по сравнению с уровнями их экспрессии в исходном штамме. В rpoN мутанте происходило увеличение экспрессии генов, регулируемых QS системами— генов биосинтеза эластазы, рамнолипида, HCN. При этом экспрессия гена rhll повышалась в мутанте rpoN, когда клетки росли в бедной минимальной среде. Выяснение роли о субъединицы, РНК-полимеразы в регуляции функционирования- QS- систем и контролируемых ими клеточных процессов требуют дальнейших исследований [107, 231]. Не исключено, что RpoN оказывает опосредованное действие на QS регуляцию; так, показано, что эта сигма субъединица является отрицательным регулятором, экспрессии" гена gacA во время всего клеточного роста [107].
Два транскрипционных регулятора P. aeruginosa, RsaL и MvaT, принимают участие в репрессии QS системы при низкой клеточной плотности.
Гены QS системы lasR и laslразделены в хромосоме межгенным районом в 367 н.п. В этом- районе локализован ген rsaL, транскрибирующийся в противоположном направлении по сравнению с генами lasR и lasl. Ген rsaL кодирует белок RsaL (10,6 kDa); предполагается, что он принимает участие в ингибировании QS системы при низкой клеточной плотности [60; 231]. Мутант P. aeruginosa по гену rsaL продуцирует большие количества АГЛ по сравнению-со штаммом дикого типа. Белок RsaL регулирует, свою собственную транскрипцию. Промоторные области генов rsaL и lasl перекрываются, белок RsaL и комплекс LasR—ЗОС12-АРЛ конкурентно связываются с этой; общей промоторной областью, при увеличении концентрации- АГЛ происходит преимущественное связывание комплекса LasR—ЗОС12-АГЛ и, следовательно, увеличение транскрипции гена lasl. Связываясь с промотором lasl, RsaL действует как негативный регулятор QS системы [191].
Экстракция АГЛ из супернатантов и проведение идентификации АГЛ в культуралъных экстрактах
Экстракция АГЛ из супернатантов. Для проведения экстракции АГЛ из культуральных супернатантов использовали метод, описанный в [208]. 200 мл ночной культуры (17-20 часов роста) центрифугировали (40 мин 4500 об/мин) с охлаждением (4С). Полученные супернатанты отбирали и смешивали с одним объемом раствора этилацетата, содержащего 0,1% ледяной уксусной кислоты. Экстракцию проводили в течение 30 минут при размешивании. Водную (нижнюю) фазу отделяли с помощью делительной воронки и повторяли экстракцию. Этилацетаные фазы объединяли. Остатки воды в этилацетатной фазе убирали добавлением Na2S04, с перемешиванием. Безводную этилацетатную фазу отфильтровывали для удаления соли. Этилацетат выпаривали на роторном испарителе при 40С. После упаривания остаток растворяли в 3x0,5 мл этилацетата и переносили в эппендорфы. Выпаривали до сухости на SpeedVac и хранили при -20С.
Идентификаг\т АГЛ в культуральных экстрактах. Для идентификации АГЛ в культуральных экстрактах использовали метод, описанный в [208], в основе которого лежит Сі8-обращенно-фазовая тонкослойная хроматография (ТСХ). Ночные культуры реиоріерньїх шіаммов С. viulaceiim CV026 и A. tumefaciens NTl/pZLR4 растили в 5 мл жидкой питательной среды LB, с добавлением гептамицина в случае штамма NT1 /pZLR4.
При использовании в качестве репортера штамма CV026 АГЛ-метчики наносили в следующих количествах: 5 мкл Сб-АГЛ (0,01 мг/мл), 7 мкл С4-АГЛ (0,1 мг/мл), 5 мкл ЗОСб-АГЛ (0,1 мг/мл) и 2 мкл Cg-АГЛ (0,1 мг/мл); экстракты АГЛ наносили в следующих количесвах: 1 мкл экстракта АГЛ из P. chlororaphis 449, 1 мкл экстракта АГЛ из P. chlororaphis 449 рМЕ6863, 1 мкл экстракта АГЛ из P. chlororaphis 449-06 (gacS::mim-Тп5Кт2), 0,5 мкл экстракта АГЛ из P. chlororaphis 449 v/r:Gm и 5мкл экстракта АГЛ из P. chlororaphis 449 csaLKm, 2 мкл экстракта АГЛ из В. cepacia 370, 4 мкл экстракта АГЛ из В. cepacia 370-В2, 0,5 мкл экстракта АГЛ из В. cepacia 370-В6, 2 мкл экстракта АГЛ из В. cepacia 370-ВЮ; при этом исходный объем каждой пробы экстракта АГЛ составлял 160 мкл, за исключением экстрактов АГЛ P. chlororaphis 449 рМЕ6863, P. chlororaphis 449-06 (gacS::mimn5Km2) и В. cepacia 370-ВЮ, для них исходный объем составлял 20 мкл.
При использовании в качестве репортера штамма NTL4(pZLR4) АГЛ-метчики наносили в следующих количествах 5 мкл Сб-АГЛ (0,01 мг/мл), 1 мкл С4-АГЛ (0,1 мг/мл), 1 мкл ЗОС б-АГЛ (0,01 мг/мл) и 1 мкл С g-АГЛ (0,1 мг/мл); экстрак ты АГЛ наносили в следующих количесвах: 3 мкл экстракта АГЛ из P. chlororaphis 449, 1 мкл экстракта АГЛ из P. chlororaphis 449 рМЕ6863, 1 мкл экстракта АГЛ из P. chlororaphis 449-06 (gacS::mmi-Тп5Кт2), 1 мкл зкстрактаї АГЛ из P. chlororaphis 449 v/r:Gm и 1 мкл экстракта АГЛ из P. chlororaphis 449 csaLKm; 1 мкл экстракта АГЛ из В. cepacia 370, 2 мкл экстракта АГЛ из В. cepacia 370-В2, 0,5 мкл экстракта АГЛ из В. cepacia 370-В6, 1 мкл экстракта АГЛ из В. cepacia 370-ВЮ; при этом исходный объем каждой пробы экстракта АГЛ составлял 160 мкл, за исключением экстрактов АГЛ P. chlororaphis 449 рМЕ6863, P. chlororaphis 449-06 {gacS::m\mnSKm2) wB. cepacia 370-ВЮ, для них исходный объем составлял 20 мкл.
После нанесения всех проб пластинку просушивали на воздухе при комнатной? температуре в течение 15 мин для испарения растворителя. Хроматографию проводили в закрытом сосуде (камере). В качестве мобильной фазы использовали 60%-ый раствор метанола в воде. Пластинку, после достижения фронтом мобильной фазы Vs ее высоты, просушивали досуха при комнатной температуре в течение 1—1,5 часов. Ночную культуру репортерного штамма смешивали с 65 мл теплого (45С) мягкого агара (0,7% LA для CV026 и 0,7% агаризованная среда М9 с глюкозой и X-gal для NTl/pZLR4) и равномерно заливали полученным раствором поверхность пластинки. После застывания агара пластинку переносили в пластиковый кейс и инкубировали 12-18 часов при 28С.
Локализацию пятен проводили визуально, по появлению характерной фиолетовой окраски репортерного штамма CV026 и по появлению голубых зон гидролиза X-Gal в случае репортера NTl/pZLR4, возникающих в присутствии экзогенных АГЛ. В опыте использовали ЛГЛ-метчики с концентрациями 0,01 мг/мл для Сб-АГЛ и 0,1 мг/мл для С4-АГЛ, ЗОС6-АГЛ и Cs-АГЛ.
Определение экзопротеазной, хитинолитической, полигалактуроназной и антагонистической активности у штаммов P. chlororaphis
Среди штаммов P. chlororaphis 62, 64, 66, 205с, 445, 449, 464— активных продуцентов АГЛ— мы провели определение активностей экзоферментов — экзопротеазной, хитинолитической и полигалуктораназной активности, а также антагонистической активности в отношении фитопатогенных бактерий и грибов.
Протеолитические ферменты— ферменты класса гидролаз, катализируют расщепление пептидных связей в белках и пептидах. Мы проводили определение общей протеолитической активности, выделяемой из клеток в окружающую среду (продукция экзопротеаз).
Из приведенной таблицы 10 видно, что все исследованные штаммы обладают экзопротеазной активностью. Все штаммы были активными антагонистами - фитопатогенных бактерий и грибов (таблица 11).
Пектиновые вещества являются важным компонентом растительной клеточной стенки. Они представляют собой полимеры, построенные преимущественно из остатков aD-галактуроновой кислоты и ее метилового эфира. Пектин синтезируется и выделяется в клеточную стенку в высокометилированной форме и затем может деметилироваться при действии фермента пектинметилэстеразы (ПМЭ). Полигалактуроназа (ПГ)— один, из основных ферментов, разрушающих пектиновые вещества. У фитопатогенных микроорганизмов, синтезирующих ПГ, этот фермент является одним из факторов патогенности— разрушая пектин, он обеспечивает внедрение микроорганизмов в ткани растений [3].
Т.к. исследуемые нами штаммы P. chlororaphis обитают в ризосфере растений и могут использовать вещества растительного происхождения для своего питания, представляло интерес определить, продуцируют ли они ПГ и ПМЭ. Работа проводилась совместно с Лабораторией биохимии фитоиммунитета Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.
Нами было впервые обнаружено, что штаммы P. chlororaphis / aureofaciens, включая хорошо изученный штамм 30-84, проявляют активности ПГ (таблица 12). Уровень І активности этого фермента у штамма 30-84 был сравним с активностями ПГ штаммовїР. chlororaphis 449, 464, 66. У одного штамма, P. chlororaphis 445, активность ПГ не была обнаружена. Мы не нашли также активности ПГ у хорошо исследованного штамма P. fluorescens 2-79. Активность ПГ штаммов P. chlororaphis /aureofaciens была невысока, приблизительно в 10 раз ниже, чем у фитопатогенного гриба Verticillium.dahliae [2].
Хитинолитические ферменты разрушают хитин — неразветвленный, полисахарид, полимер; являющийся компонентом клеточных стенок грибов. Эти ферменты продуцируются природными бактериями и грибами и участвуют в разложении хитина растений, животных, микроорганизмов. Хитинолитические ферменты играют важную роль в биологическом контроле заболеваний растений, вызванных различными фитопатогенными грибами [19]. Ни у одного из исследованных штаммов P. chlororaphis не было обнаружено хитинолитической активности.
Продукцию АГЛ исследуемыми штаммами с использованием репортерного штамма С. violaceum CV026 наблюдали при 30С и не наблюдали при 37С; способность штамма CV026 отвечать на экзогенные АГЛ и синтезировать фиолетовый пигмент при» 37С была подтверждена с использованием штамма С. violaceum CVWT. Мы предположили, что активность АГЛ у P. chlororaphis деградирует при 37С. Подобный эффект был описан после окончания этой части нашей работы для" Pseudomonas aeruginosa и Yersinia pseudotuberculosis [248]; по данным авторов, АГЛ в супернатантах этих бактерий и при их росте деградировали при увеличении температуры до 37С (по сравнению с 30С).
Исследуемые штаммы Р: chlororaphis имеют оранжевую окраску колоний (синтезируют феназиновые антибиотики). Мы наблюдали отсутствие оранжевой.окраски колоний при выращивании бактерий при 37С. Кроме того, при росте бактерий при 37С мы наблюдали отсутствие экзопротеазной активности, по сравнению с теми же бактериями, выращиваемыми при 30С.
Сравнительное определение скорости роста исследуемых штаммов P. chlororaphis 449 и P. aureofaciens 30-84 в экспоненциальной фазе при 30С и 37С показало, что заметного изменения скорости роста при 37С не наблюдается — скорость роста при выращивании клеток при 37С у штамма 449 снижалась на 10%, а у штамма 30-84 увеличивалась на 16 % по сравнению со скоростью роста при 30С. Полученные данные свидетельствуют о различной чувствительности к температуре скорости роста клеток P. chlororaphis, отражающей процессы основного клеточного метаболизма, и процессов, относящихся к вторичному метаболизму (синтез АГЛ, феназішов, экзопротеаз).
К началу нашей работы были изучены QS системы у одного представителя P. chlororaphis / aureofaciens, штамма 30-84. Было показано, что у этого штамма синтез феназиновых антибиотиков находится под контролем PhzI-PhzR QS системы [250]:
Для, определения генов phzl и phzR y исследуемых нами штаммов P. chlororaphis были подобраны праймеры PHZIR-F и PHZIRAR по нуклеотидной последовательности соответствующих генов у штамма 3 0-84; праймеры были подобраны; в концах фрагмента ДНК, включающего оба тепа phzl wphzR, что позволяло определять наличие сразу двух генов. С этих праймеров по ДНК всех исследуемых штаммов амплифицировалсяг фрагмент размером 1075 п.н., такой же, как и в случае с P. aureofaciens 30-84, используемого в качестве контроля (рис. 9).
Используя пары праймеров С SAIR-F и CSAIR-R, подобранные по нуклеотидной последовательноститеновоуа/и csaR второй? QS системы штамма 30-84-мы определили; что все 7 исследованных штаммов содержат; гены csaPи csaR: С праймеров GSAIR-F. и; GSAIR-R по ДНК всех исследуемых штаммов- амплифицировалсяз фрагмент размером: 1330 п.н., такой же, как и в случае с P. aureofaciens 30-84, используемого в5 качестве контроля.
