Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. ДНК-идентификация личности
1.1.1. Идентификация личности 11
1.1.2. ДНК-идентификация личности на основе вариабельного числа тандемных повторов VNTR-локусов 14
1.1.3. ДНК-идентификация личности на основе коротких тандемных повторов STR-локусов 18
1.1.4. ДНК-идентификация личности на основе однонуклеотидного полиморфизма ДНК 25
1.2. Методы обнаружения однонуклеотидных замен 29
1.2.1. Однонуклеотидное удлинение праймера 32
1.2.2. Аллель-специфичная ПНР 36
1.2.3. Анализ снипов путем определения температур плавления дуплексов 39
1.2.4. Инвазивное расщепление 41
1.2.5. Методы анализа снипов, основанные на лигировании 43
1.2.6. Аллель-специфичная гибридизация 45
1.2.7. Анализ однонуклеотидных замен с помощью ДНК-чипов 48
1.2.8. Изготовление ДНК-чипов 49
2. Объекты и методы исследований
2.1. Краткая характеристика объектов исследований 52
2.2. Выделение геномной ДНК человека 54
2.3. Синтез и очистка олигодезоксирибонуклеотидов 54
2.4. Фосфорилирование олигонуклеотидов 55
2.5. Полимеразная цепная реакция - ПНР 56
2.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени - ПЦР- РВ 56
2.7. Лигазная цепная реакция в реальном времени - ЛЦР-РВ 57
2.8. Аналитический гель-электрофорез ДНК 57
2.9. Технология циклирующей пробы - ТЦП 58
2.10. Иммобилизация олигонуклеотидов на стекло 59
2.11. Объединение циклической амплификации по типу катящегося кольца и технологии циклирующей пробы 60
2.12. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 62
2.13. Реактивы и материалы 62
2.14. Составы использованных стандартных растворов 63
3. Результаты и обсуждение
3.1. Принципы генетического штрих-кодирования 64
3.2. Методы детекции однонуклеотидных замен
3.2.1. Лигазная цепная реакция в режиме реального времени 78
3.2.2. Технология циклирующей пробы 87
3.2.3. ТЦП в чиповом варианте 95
3.2.4. Объединение циклической амплификации по типу катящегося кольца и технологии циклирующей пробы с рибобиконом 97
3.3. Базы данных по генетическим штрих-кодам населения и их программное сопровождение 104
Заключение 115
- Методы обнаружения однонуклеотидных замен
- Изготовление ДНК-чипов
- Объединение циклической амплификации по типу катящегося кольца и технологии циклирующей пробы
- ТЦП в чиповом варианте
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время человечество стоит перед необходимостью однозначно идентифицировать любого человека по только ему свойственным биологическим признакам вследствие высокого уровня криминалитета, терроризма, происходящих природных и техногенных катастроф, приводящих зачастую к многочисленным, иногда неподдающимся опознанию жертвам. Начало ДНК-идентификации личности, которая насчитывает уже более двух десятилетий, было положено работами А. Джеффриса, впервые предложившего использовать высокополиморфные локусы для генетической паспортизации человека [Jeffreys et al., 1985; Gill et al., 1985]. На основе минисателлитного участка, присутствующего в первом интроне миоглобинового гена, ими были созданы гибридизационные пробы 33.15 и 33.6, получившие впоследствии название «пробы Джеффриса». Помимо них для ДНК-идентификации личности применялись и другие гипервариабельные гибридизационные пробы, в том числе основанные на тандемных повторах, локализованных в гене белка 3 фага М13 [Рысков и др., 1988; Иванов и др., 1989]. Однако сопоставление электрофоретических картин полиморфизма ДНК разных людей велось практически по принципу «похоже - не похоже», что сильно затрудняло их сравнение. Несмотря на определенные трудности в использовании проб, относящихся к VNTR-локусам (Variable Number of Tandem Repeats), они широко использовались в криминалистике на протяжении целого десятилетия и при этом сыграли значительную роль в установлении виновности подозреваемых.
В начале 90-х гг. прошлого столетия на смену проб к VNTR-локусам пришел анализ STR-локусов (Short Tandem Repeats), отличающихся от первых более короткими, как правило, 2-5 нуклеотидными повторяющимися мотивами [Edwards et al., 1991]. Поскольку нередки случаи обнаружения на месте преступления биологических следов в крайне малых количествах и подчас содержащих ДНК в деградированном состоянии, не позволяющем
7 провести анализ VNTR-полиморфизма, то одним из главных преимуществ использования STR-локусов стало то, что для их анализа требовалось значительно меньшее количество ДНК. В последние годы наблюдается тенденция использования в ДНК-идентификации личности так называемых miniSTR-локусов, характеризующихся сближенным расположением праймеров к непосредственно микросателлитным повторам, что способствует повышению точности анализов при работе с сильно фрагментированной ДНК [Butler et al., 2003; Coble, Butler, 2005].
Серьезным недостатком использования для ДНК-идентификации STR-локусов была и остается их сильная зависимость от расовых и национальных особенностей, из-за которой в одной только Великобритании существует 3 разных базы данных, где сведения о людях хранятся сообразно их расовым признакам. В одной из них содержатся сведения о европейцах, в другой - об азиатах, включая индусов, в третьей собраны данные о выходцах из стран Африки и Карибского бассейна. При этом базы данных не могут быть сравнены между собой. Следовательно, для определения принадлежности неизвестных ДНК-следов, оставленных на месте преступления, экспертам необходимо проводить несколько анализов, используя разные коммерческие наборы с соответствующими STR-локусами. Это свидетельствует в пользу необходимости замены используемых маркерных признаков на основе STR-локусов другими, в гораздо меньшей степени зависимыми от расовой и национальной принадлежности носителей ДНК.
В настоящее время на роль новых маркеров - маркеров третьего поколения, претендуют однонуклеотидные замены [Budowle et al., 2005; Divne, Allen, 2005; Dixon et al., 2005; Vallone et al., 2005]. Они теоретически могут обеспечить уникальность каждого индивидуума при ДНК-идентификации [Gill, 2001] и пригодны для создания на их основе истинно цифровых баз данных с возможностью поиска и сравнения по ним.
В сегодняшний день анализ снипов ведется разными методами, однако разработка новых более производительных методов продолжается. Серьезное
8 внимание уделяется подходам, которые потенциально могут быть переведены в более производительный и дешевый биочиповый формат. Обилие методов анализа снипов свидетельствует о том, что не предложен метод, удовлетворяющий всем требованиям.
Цель и задачи исследования. Целью исследования явилась разработка принципов однозначной ДНК-идентификации личности и новых методов обнаружения однонуклеотидного полиморфизма в режиме реального времени.
В задачи исследования входило:
сформулировать принципы выбора генетических маркеров, способных обеспечить индивидуальность каждого члена общества;
разработать принципы генетического штрих-кодирования на основе индивидуального полиморфизма ДНК человека;
создать прообраз банка данных по генетическим штрих-кодам людей и его программное сопровождение;
разработать новые методы обнаружения однонуклеотидных замен в режиме реального времени с возможностью их перевода в ДНК-чиповый формат.
Научная новизна и практическая ценность. Впервые предложен способ генетического штрих-кодирования человека, основанный на индивидуальном полиморфизме однонуклеотидных замен, теоретически обеспечивающий однозначную ДНК-идентификацию личности. Впервые созданы прообразы банка данных по генетическим штрих-кодам людей, написаны компьютерные программы для ввода данных, их поиска и сравнительного анализа. Лигазная цепная реакция (ЛЦР) амплификации фрагментов ДНК преобразована для ее проведения в режиме реального времени. Предложены новые методы детекции однонуклеотидных замен, основанные на лигазной цепной реакции, на объединении технологии циклирующей пробы с молекулярным рибонуклеотидным сигнальным огнем (рибобиконом), а также на объединении двух последних с изотермической амплификацией по
9 типу «катящегося кольца». Для последнего подхода предложен более экономичный вариант за счет применения на стадии лигирования дополнительного короткого олигонуклеотида с дискриминирующими нуклеотидами на З'-конце, что позволяет более длинный олигонуклеотид сделать общим для детекции всех вариантов нуклеотидов в конкретном снипе. Показана принципиальная возможность перевода объединенной технологии поиска однонуклеотидных замен с помощью циклирующей пробы и рибобикона в более удобный для массовых анализов ДНК-чиповый формат.
Практическая значимость работы заключается в разработке генетического штрих-кода человека, который может стать дополнительной характеристикой каждого индивидуума, упорядочить учет граждан, помочь правоохранительным органам в борьбе с преступностью. Социальная значимость генетических штрих-кодов и баз данных по ним заключается в однозначной идентификации тел погибших без привлечения для анализа ДНК родственников. Предложенные варианты лигазной цепной реакции в реальном времени применимы также для целей общей высокочувствительной и специфичной ДНК-диагностики.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III съезде ВОГиС "Генетика в XXI веке" (Москва, 2004), на II и III съездах Общества биотехнологов России (Москва, 2004, 2005), на международном симпозиуме "Трансгенные растения и проблемы биобезопасности" (Москва, 2004), на VI Международном форуме "Высокие технологии XXI века" (Москва, 2005), на 2-ой международной конференции "Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда" (Пущино, 2005), на республиканской научно-практической конференции «Успехи интеграции академической и вузовской науки по химическим специальностям» (Уфа, 2006). Конкурсная поддержка работы. Исследования были выполнены в соответствии с Федеральной целевой программой «Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 гг.», с Научной программой Министерства науки и высшего образования РФ «Развитие научного
10 потенциала высшей школы», в рамках Программы государственной поддержки ведущих научных школ РФ -НШ-2217.2003.4 и НШ-1003.2006.4 и Государственных контрактов ФЦНТП №№ 02.438.11.7003 и 02.445.11.7018. Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 234 работы отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 144 страницах, содержит 29 рисунков и 4 таблицы.
Методы обнаружения однонуклеотидных замен
Выявление однонуклеотидных замен de novo составляет ныне важную часть исследований геномов людских особей. Одна из серьезных причин этого - использование информации по снипам для целей фармакогеномики [Twyman, 2004], что уже составляет значительную долю бизнес-проектов, непосредственно связанных со здоровьем и лечением людей. В связи с этим во всем мире происходит бум вокруг совершенствования старых и разработки все новых методов детекции снипов, которые, однако, больше касаются выявления у широких масс населения уже известных однонуклеотидных замен и при этом активно патентуются, чему посвящен специальный обзор [Twyman, Primrose, 2003]. Что касается de novo обнаружения в человеческом геноме мест, которые соответствуют снипам, то существующий метод один - это секвенирование, сопровождаемое анализом in silico. Такие методы обнаружения мутаций во фрагментах ДНК, как ПДРФ, SSCP-анализ, ВЭЖХ в денатурирующих условиях, электрофоретическое разделение в градиенте денатурирующих агентов или температурном градиенте, носят по существу вспомогательный характер и лишь указывают исследователю, для каких фрагментов ДНК нет нужды определять последовательность нуклеотидов, а какие необходимо секвенировать, чтобы выявить в них конкретный нуклеотид, подверженный заменам. При этом метод секвенирования ДНК с дидезокситерминаторами слишком дорог, трудоемок и плохо масштабируем для массового определения однонуклеотидных замен. Однако следует отметить, что в последнее время для выявления снипов de novo прибегают к секвенированию пула ДНК различных особей, и в случае однозначного определения нуклеотидной последовательности те места, где будут представлены не один, а два и более нуклеотидов, потенциально могут являться снипами.
В связи с тем, что главный интерес для нас представляет выявление у различных людей уже известных снипов, то основное внимание в дальнейшем изложении будет уделено методам, рассчитанным на массовую детекцию снипов за короткое время и с минимальными затратами. Серьезную проблему для всех методов анализа представляют размеры фрагментов ДНК, содержащих однонуклеотидную замену. При размере, фрагмента в 60 пн он будет составлять приблизительно одну стомиллионную долю от диплоидного генома человека, и выявить его на фоне всей остальной геномной ДНК непросто, поскольку чувствительности большей части современных методов недостаточно. Здесь на помощь приходят методы амплификации ДНК или методы, основанные на накоплении детектируемого сигнала при работе с единичными копиями определенного снипа. В основе практически всех методов выявления снипов лежит взаимодействие по принципу комплементарности двух цепей ДНК. Одна из них, анализируемая и несущая потенциальную однонуклеотидную замену, должна быть природной или быть представленной ее амплифицированными копиями. Вторая цепь может представлять собой химически синтезированные обычные или модифицированные олигонуклеотиды, в том числе служащие праймерами. Подходы к регистрации результатов молекулярной гибридизации с образованием дуплексов или даже триплексов, в том числе и с использованием неприродных аналогов ДНК, могут быть различными и включать в себя целый комплекс разных методов. Так, ПЦР может служить для одних методов лишь подготовительной стадией, тогда как для других она выполняет роль непосредственно детектирующего метода. При исследовании снипов во фрагментах ДНК проводится разделение последних по размеру с помощью электрофореза, времяпролетной масс-спектрометрии, хроматографии; выявление различий в их нуклеотидной последовательности путем определения температур плавления, световой эмиссией или измерением электрохимического і потенциала. В свою очередь, методы детекции снипов, основанные на световой эмиссии, можно подразделить на четыре группы, в которых ведется регистрация просто флуоресценции, поляризации флуоресценции, переноса флуоресцентной резонансной энергии и регистрация люминесценции. Регистрация флуоресценции имеет место в случаях применения меченных флуорохромами праймеров или дНТФ, а также при использовании интеркалирующих красителей. Обычно требуется приложить дополнительные усилия по удалению не вступивших в реакцию ингредиентов (праймеров, дНТФ) или как-то иначе обеспечить материал ДНК в виде только одной цепи.
Измерение поляризации флуоресценции основано на том, что небольшие флуоресцентно-меченные молекулы вроде дНТФ при их включении в состав ампликона пространственно упорядочиваются, свободное вращение красителей замедляется и возникает поляризация. Поляризация флуоресценции часто дает даже большую амплитуду, чем просто изменение флуоресценции, что находит весьма широкое применение в различных подходах анализа снипов [Kwok, 2002]. Флуоресцентный резонансный перенос энергии требует использования уже двух флуорохромов, один из которых выступает донором, а другой -акцептором энергии. Преимуществом данного подхода является отсутствие необходимости в удалении избытка ни того, ни другого. Люминесценция возникает в методе так называемого пиросеквенирования при окислении люциферина люциферазой, чему предшествует целый ряд других энзиматических стадий. Одним из наиболее популярных подходов к детекции снипов является так называемое однонуклеотидное удлинение праймера. Несмотря на серьезные различия в выборе методов анализа получаемых результатов, существуют все же общие моменты, которые заключаются в предамплификации участка ДНК, содержащего снип, последующем разрушении с помощью экзонуклеазы I или аналогичного фермента невступивших в реакцию праймеров и разложении с помощью щелочной фосфатазы дНТФ. Далее добавляются соответствующие ддНТФ и новые генотипирующие праймеры, подобранные с таким расчетом, что первым включаемым нуклеотидом для них будет как раз тот, что стоит против снипа. Так, в работе [Nikiforov et al., 1994] генотипирующие праймеры были пришиты к лункам иммунотитратора, а разные дНТФ мечены биотином и флуоресцеином соответственно. В результате их включения с помощью новой порции ДНК полимеразы после соответствующих отмывок стало возможным регистрировать колориметрически по реакции с антителами, конъюгированными с пероксидазой и щелочной фосфатазой. В работе других авторов включаемые ддНТФ были мечены флуорохромами, а в качестве носителя было использовано стекло и опробованы разные способы пришивки к нему генотипирующих праймеров [Lindroos et al., 2001].
Изготовление ДНК-чипов
ДНК-чипы представляют собой небольшие пластины из различных материалов (стекло, полимеры, кремний, металлы и др.) с нанесенными на их поверхность короткими, 6-80 нуклеотидов, фрагментами ДНК [Cheung et al., 1999; Case-Green et al., 1998]. Существующие способы создания ДНК-чипов можно разделить на две группы. К первой относятся методы, основанные на адресном синтезе олигонуклеотидов непосредственно на поверхности чипа. Синтез проводят путем поэтапного добавления к растущей олигонуклеотидной цепи нуклеотидов, содержащих на 5 -конце лабильную защитную группу, которую удаляют под действием светового излучения, электрического напряжения [Roget, Livache, 1999] или в ходе кислотного гидролиза. К настоящему времени наибольшее распространение получил фотоактивируемый in situ синтез олигонуклеотидов, в основе которого лежит применение фотолитографических масок [Beier, Hoheisel, 2000; Rampal, 2001]. В случае непрямой фотодепротекции кислотный депротектор образуется под действием светового излучения. Наиболее используемыми являются сложные эфиры и ониевые соли. К последней группе относятся предложенные не так давно иодониевые соли [Gao et al., 2001]. Вторым способом создания ДНК-чипов является иммобилизация предварительно синтезированных олигонуклеотидов на подложке. С целью создания прочной ковалентной связи между поверхностью подложки и молекулой прикрепляемого олигонуклеотида последний подвергают модификации. Преимущественно используют олигонуклеотиды, несущие гидроксильную или аминогруппу на 5 -конце молекулы. Прикрепление олигонуклеотидов осуществляется различными способами. Наиболее распространенным является непосредственное нанесение раствора модифицированного олигонуклеотида на подготовленную поверхность подложки. В результате протекающей реакции конденсации полинуклеотидная цепь оказывается фиксированной на ней [Joos et al., 1997]. Для иммобилизации наиболее часто используется стекло в силу ряда его характерных свойств: нерастворимость в органических и неорганических растворителях; относительная химическая инертность; низкая фоновая флуоресценция; отсутствие неспецифических взаимодействий; достаточная прочность, доступность и простота в обращении. Перед прикреплением молекул олигонуклеотидов стекло подвергают очистке, в результате которой поверхность становится более гладкой, с нее удаляются возможные органические загрязнения, ионы тяжелых металлов и освобождаются гидроксильные группы [Zammateo et al., 2000].
Затем проводят функционал изацию стекла действием алкоксисиланов [Walsh et al., 2001]. Возможна дальнейшая функционализация, осуществляемая путем взаимодействия поверхностных групп с различными соединениями [Roger et al., 1999; Raddats et al., 2002; Podyminogin et al., 2001]. Иммобилизация, как правило, осуществляется за счет реакций конденсации. В связи с этим вполне обоснованным является использование в качестве модификатора олигонуклеотидов такого сильного нуклеофила, как аминогруппа. В случае образования азометиновой группировки дополнительно проводят ее восстановление боргидридом натрия, приводящее к более устойчивым вторичным аминам. Интересен подход, в котором для иммобилизации используется электросополимеризация пиррола и олигонуклеотидов, несущих на конце цепи остатки пиррола [Livache et al., 1998]. Приложение напряжения к электроду приводит к полимеризации пиррол-мономеров, в результате молекулы олигонуклеотидов оказываются фиксированными на поверхности. Несколько отличный от предыдущих метод предложен Kumar et al. [2000]. Стекло не фунционализируют, а проводят взаимодействие алкоксисилана с олигонуклеотидом, получая силилированные нуклеиновые кислоты, которые затем прикрепляют к стеклу согласно обычной методике модификации стекла. Разработана группа методов, основанных на реакциях сополимеризации [Proudnikov et al., 1998; Rehman et al., 1999]. Олигонуклеотиды, несущие на 5 -конце остатки акриламида, вовлекают в реакцию. Олигонуклеотидные пробы оказываются фиксированными в тонком слое полиакриламидного геля. Иммобилизация в объеме геля значительно увеличивает емкость чипа, что повышает чувствительность измерений. Жесткая фиксация исключает взаимодействие молекул олигонуклеотидов друг с другом и с поверхностью подложки, где гетерофазные процессы протекают более сложным образом. Однако полиакриламид имеет высокую фоновую флуоресценцию, что вносит определенную погрешность в результаты анализа. Для повышения емкости ДНК-чипов предложены методы создания дендримерных структур [Benters et al., 2002; Le Berre et al., 2003]. Увеличение количества функциональных групп на поверхности обеспечивает более плотную посадку молекул олигонуклеотидов. Однако в случае чрезмерной загрузки поверхности при проведении гибридизации возникают стерические затруднения, что приводит к уменьшению величины детектируемого сигнала [Shchepinov et al., 1997]. Значительное внимание, уделяемое способам изготовления ДНК-чипов неудивительно. Оно вызвано в первую очередь тем, что использование биочипов резко повышает производительность экспериментов по молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, включая поиск и обнаружение однонуклеотидных замен. Выделение ДНК осуществляли методом последовательной фенольно-хлороформной экстракции из венозной крови [Mathew, 1984]. Кровь набирали в пробирки, в качестве консерванта использовали глюгицир в соотношении 4:1.
Образцы хранили при 4С не более двух недель. Выделение ДНК проводили прибавлением к 8-10 мл крови 50 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCb, 10 мМ Трис-HCl, рН 7.6. Полученную смесь перемешивали и центрифугировали при 4С, 4000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 8 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8.0) и 75 мМ NaCl, ресуспензировали, добавляли 0.8 мл 10% ДДС, 50 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубировали образец при 37С в течение 16 часов. После этого к лизату добавляли 0.5 мл 5 М перхлората натрия и последовательно проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, смеси фенол-хлороформ (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут и отбором водной фазы после каждого этапа. ДНК осаждали из раствора добавлением двух объемов охлажденного 96% этанола. Осадок ДНК растворяли в деионизированной воде и хранили при -20С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, реакций циклической амплификации и циклирующей пробы. 2.3. Синтез и очистка олигодезоксирибонуклеотидов Синтез олигонуклеотидов был осуществлен на автоматическом синтезаторе ASM 102U фосфорамидитным способом, очистка проводилась на установке OPS 201. За ходом синтеза следили визуально по интенсивности окраски отходящего раствора, содержащего диметокситритил-катион. Масштаб синтеза составлял 12 мкл (100 нмоль). Реагенты для синтеза были подготовлены соответствующим образом: навески амидофосфитов и тетразола высушены над Р2О5 (18 ч), ацетонитрил и метиленхлорид для заправки емкостей синтезатора высушены над СаСЬ и перегнаны с дефлегматором, в синтезатор загружены с молекулярными ситами (размер пор 0.3 нм). Для растворения амидофосфитов и тетразола использовали абсолютный ацетонитрил (Merck), концентрации амидофосфитов составляли 40 мг/мл (=0.13 М), тетразола- 35 мг/мл (0.5 М). После проведения автоматического синтеза носитель (CPG, пористое стекло с размером пор 500 А) извлекали из реакционной колонки, помещали в пробирку типа eppendorf, приливали 500-700 мкл 25%-ного водного раствора аммиака, выдерживали 18 ч при 20-25С, центрифугировали. Раствор олигонуклеотида сливали с твердой фазы, приливали к ней 200 мкл деионизированной воды (Milli-Q), вновь центрифугировали, раствор отделяли и объединяли с первой фракцией. Полученные растворы упаривали на вакуумном испарителе (SpeedVac) до 300 мкл. Олигонуклеотиды очищали методом ВЭЖХ на установке OPS 201 или высаживали абсолютным этанолом в зависимости от протокола синтеза.
Объединение циклической амплификации по типу катящегося кольца и технологии циклирующей пробы
Для проведения амплификации по механизму катящегося кольца сначала была получена кольцевая олигонуклеотидная матрица. Замыкание олигонуклеотида Colzo в циклическую структуру осуществляли путем лигирования его после отжига на «поддерживающем» олигонуклеотиде EcorU. Для этого после фосфорилирования олигонуклеотида Colzo реакционную смесь прогревали при 80С в течение 20 мин для инактивации Т4 полинуклеотидкиназы, затем добавляли в эквимолярном количестве EcorU и проводили отжиг при постепенном понижении температуры смеси с 95 до 25С. Вносили Т4 ДНК лигазу (5 ед. акт.) и выдерживали при 12С в течение 18 ч. При использовании наряду с Colzo дополнительных олигонуклеотидов HV12 и HV12g их отжиг проводили на другой матрице, в качестве которой выступал синтетический олигонуклеотид EcHV. После фосфорилирования олигонуклеотидов Colzo, HV12 и HV12g инактивировали Т4 полинуклеотидкиназу, отжиг и лигирование проводили аналогично первому варианту. Полученные таким образом циклические ДНК-матрицы использовали в дальнейшем без очистки. Циклическую амплификацию и разрушение пробы (рибобикона) осуществляли одновременно, «в одной пробирке». Процесс проводили в режиме реального времени в ДНК-амплификаторе iCycler iQ. Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала буфер для ДНК полимераз (в случае ДНК полимеразы рЫ29: 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 10 мМ MgCl2, 10 мМ (NHO2SO4, 4 мМ ДТТ; в случае ДНК полимеразы Bst: 20 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 2 мМ MgS04, 10 мМ КС1, 10 мМ (NH4)2S04, 0.1% Triton Х-100), буфер для термостабильной РНКазы Н (50 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2), 0.07 ед. акт. термостабильной РНКазы Н, 1 ед. акт. соответствующих ДНК полимераз, 5 пмоль праймера HV313, по 2 пмоль каждого дНТФ, 2 пмоль рибобикона МВ2,1 мкл раствора кольцевой ДНК-матрицы. Процесс проводили следующим образом. При 5С в реакционную смесь вносили ферменты, далее задавали последовательность шагов, в каждом цикле снимая показания интенсивности свечения флуоресцентной метки: 1. 40С-30сек 63С-10сек 2. 40С-20сек 52С-10сек 64С-20сек 3 цикла - 50 циклов Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программ Primer Premier (Premier Biocom International), Lasergene фирмы «DNASTAR Inc.» (CUIA), Oligo 4.1 (National Biosciences Inc., CUIA), a также OligoAnalyzer3.0 (Integrated DNA Technologies, США) в режиме online fwww.idtdna.com).
Нуклеотидные последовательности для анализа были взяты из опубликованных статей либо подобраны самостоятельно. 2.13. Реактивы 1Н-тетразол (Glen Research, США) 3-аминопропилтриэтоксисилан (APTES) (Aldrich, ФРГ) N-Морфолиноэтансульфокислота (MES) (Serva, ФРГ) SYBR Green I (Molecular Probes, США) Агароза для электрофореза ДНК (Serva, ФРГ) Агароза легкоплавкая (Bio-Rad, США) Акриламид (Serva, ФРГ) АТФ (Serva, ФРГ) Ацетонитрил абсолютный (Merck, ФРГ) Бромфеноловый синий (Serva, ФРГ) Бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma, США) ДезоксиАТФ, дезоксиЦТФ, дезоксиГТФ, дезоксиТТФ (Pharmacia, Швеция) Дитиотрейтол (ДТТ) (Serva, ФРГ) Додецилсульфат натрия (ДДС) (Serva, ФРГ) Кальций хлористый (Merck, ФРГ) Магний хлористый (Serva, ФРГ) Метиленбисакриламид (Serva, ФРГ) Спермидин (ICN, США) Тетраэтилметилендиамин (TEMED) (Fluka, Швейцария) Трис(гидроксиэтиламинометан) «тризма» или «Sigma 7-9» (Sigma, США) Triton Х-100 Ферменты: Taq ДНК полимераза (Promega, США), phi29 и Bst ДНК полимеразы (New England BioLabs, Великобритания), Tth ДНК лигаза («MBI Fermentas», Литва ), протеиназа К (СибЭнзим, Новосибирск), РНКаза Н («MBI Fermentas», Литва), Т4 полинуклеотидкиназа («MBI Fermentas», Литва), термостабильная РНКаза Н (EpiCentre Biotechnology, США) Формамид (BDH, Великобритания) Фосфорамидиты: dA-CE Phosphoramidite, dC-CE Phosphoramidite, dG-CE Phosphoramidite, dT-CE Phosphoramidite, Chemical Phosphorylation Reagent II (Glen Research, США) Этидиумбромид (Fluka, Швейцария) Этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль (ЭДТА) (Serva, ФРГ) Остальные реактивы отечественного производства 2.14. Составы использованных стандартных растворов 1 х SSC 0.15 М NaCl, 0.015 М цитрат натрия 1 х ТАЕ 40 мМ Трис-ацетат (рН 7.6), 2 мМ ЭДТА 1 х ТВЕ 90 мМ Трис-основание, 9 мМ борной кислоты, 2 мМ ЭДТА Предложенное в нынешнем виде американцем Г.Лаурером штрих-кодирование товаров уже прочно вошло в нашу жизнь. Впервые оно было применено в 1974 г. в супермаркете американского города Трой из штата Огайо при продаже жевательной резинки фирмы Wrigley s и получило название Universal Product Code или UPC (известный в России как bar-code или штрих-код). Сейчас кроме товаров подобным образом стало кодироваться буквально все: заказные почтовые отправления, билеты, регистрационные документы, разовые пропуска и пр.
Помимо стремительного развития компьютерной и оргтехники причиной глубокого проникновения в нашу жизнь штрих-кодов служит их универсальность и огромное число комбинаций, скрытое за видимыми черными (компьютерное значение «1») и невидимыми белыми (компьютерное значение «О») линиями. Оно таково, что можно не опасаться совпадения разных штрих-кодов. Кроме того, распределение полос неслучайно, оно отображает сведения о типе товара, стране-производителе и прочую информацию, связанную с производством, продажей или регистрацией. Несмотря на визуальное сходство обычного UPC и предлагаемого нами генетического штрих-кода, принципы их формирования абсолютно различны. Генетический штрих-код основан на сведениях об отдельных особенностях полиморфизма молекул ДНК, и эта информация должна быть достаточной для однозначной идентификации любого человека независимо от места его рождения и последующего проживания. Абсолютная уникальность генетического штрих-кода должна обеспечиваться огромным числом комбинаций маркерных признаков, не допускающим их случайного совпадения. Предлагаемый генетический штрих-код есть графическое отображение компьютерной записи, состоящей из перемежающихся «нулей» и «единиц». Очевидно, что он должен формироваться на основе истинно цифровых данных, не допускающих каких-либо отклонений типа «±» и вообще любых неточностей. В связи с этим применение для оценки полиморфизма ДНК аналоговых данных по VNTR-локусам с их огромными размерами, которые невозможно точно определить и из-за этого уверенно сопоставить, никак не может подойти для цели создания генетического штрих-кода. В плане оцифровки не лучше обстоит дело с применением STR-локусов, включая miniSTR, размеры которых хотя и могут быть измерены с точностью до одного нуклеотида, но имеющих другие серьезные недостатки. Главным является отсутствие их универсальности в силу генетических особенностей людей разных рас и национальностей. В настоящее время применяется несколько разных систем, в которых оцениваются как одинаковые, так и совсем разные нуклеотидные последовательности. В США действует система CODIS, опирающаяся на данные по 13 STR-локусам, в Европе для оценки полиморфизма ДНК человека для криминалистических целей преимущественно применяется система с 10 STR-локусами, и только 7 из них совпадают с американскими. Таким образом, даже оцифрованные результаты генетических данных по STR-локусам не могут быть сравнены с аналогичными данными, полученными как в различных странах и регионах, так и внутри одной страны для людей разных рас.
ТЦП в чиповом варианте
ТЦП была осуществлена в ДНК-чиповом варианте на поверхности твердой подложки. В качестве подложки брали предметные стекла, проводили ковалентную иммобилизацию на их поверхности рибобикона МВ2, несущего по 5 -концу свободную аминогруппу. Первый этап заключался в химической модификации поверхности стекла. На основе описанных в литературе методик [Zammateo et al., 2000] была подобрана наиболее оптимальная методика обработки стекла, включающая следующие стадии: 1. очистка стекла щелочной (10%-ный водный КОН), затем кислотной (концентрированная серная кислота и 30%-ная перекись водорода в соотношении 1:1) смесями. На данной стадии происходит образование ровной поверхности со свободными ОН-группами, лишенной органических загрязнений и ионов тяжелых металлов; 2. силанизация путем выдерживания очищенного стекла в спиртовом растворе 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES): В ячейку 1 в качестве матрицы наносился олигонуклеотид AOt, в ячейку 2 - АОа, в контроле отсутствовал фермент. В первой ячейке наблюдается слабое свечение, в то время как в ячейке 2 и в контроле его нет. Таким образом, в случае полной комплементарности ДНК-матрицы и флуоресцентного зонда (рибобикона) протекает раскрытие, отжиг и расщепление последнего РНКазой Н. Эксперимент показывает, что иммобилизация зонда не приводит к потере его работоспособности и, следовательно, данный подход может быть с успехом применен в ДНК-чиповых технологиях. 3.2.4. Объединение циклической амплификации по типу катящегося кольца и технологии циклирующей пробы с рибобиконом Нашими экспериментами, описанными выше, показано, что в ходе лигазной цепной реакции возможна высокочувствительная детекция в режиме реального времени однонуклеотидных полиморфизмов. Для анализа снипов и ранее неоднократно использовалась классическая ЛЦР, но из-за затрудненной детекции продуктов реакции она не нашла широкого применения. Однако оказалось, что использование подходов, базирующихся на резонансном переносе энергии флуоресценции, позволяет решить эти трудности. А ввиду того, что лигаза более требовательна к полноценному спариванию лигируемых концов, ее часто применяют на предварительной стадии, предшествующей или ПЦР или другим методам амплификации нуклеиновых кислот, включая амплификацию по типу катящегося кольца, что нами было решено также использовать. Кроме того, показанное нами успешное расщепление рибонуклеотидных сигнальных огней РНКазой Н в ходе ТИП свидетельствует о том, что данный подход весьма эффективен для дискриминации аллельных вариантов.
Учитывая эти обстоятельства нами были проведены эксперименты по детекции однонуклеотидных замен, в которых были объединены сразу три метода: амплификации по типу катящегося кольца, технологии циклирующей пробы с рибоолигонуклеотидным сигнальным огнем, опробованным ранее в модельных системах. Схема эксперимента заключается в следующем. Олигонуклеотид-предшественник кольцевой структуры, названный Colzo, предварительно фосфорилируется с помощью Т4 полинуклеотидкиназы, причем размер такого олигонуклеотида должен быть не менее 80 нуклеотидов, поскольку известно, что по кольцам меньшего размера ДНК полимераза очень «неохотно» работает. Далее он отжигается на комплементарном участке матрицы EcorU так, что 3 - и 5 -концы гибридизуются встык. Тип такой пробы носит название «висячего замка» либо «С»-пробы. Добавление Т4 ДНК лигазы приводит к замыканию олигонуклеотида в кольцо. Причем лигирование происходит только в том случае, если оба конца (особенно 3 -конец) комплементарны матрице, а в случае анализа снипов тому или иному нуклеотиду в нем. Полученная таким образом кольцевая ДНК-матрица служит для амплификации с помощью ДНК полимераз рЫ29 или Bst, обладающих свойством вытеснять старую цепь (strand displacement) и строить на ее месте новую, нарабатывая в идеале бесконечно длинный одноцепочечный продукт с повторяющейся последовательностью. На основе этого подхода для анализа снипов фирмой Amersham был создан коммерческий набор SNiper. Отличительной особенностью этого набора служит то, что детекция линейного роста цепи ДНК регистрируется в режиме реального времени с помощью специального праймера Amplifluor, содержащего в своем составе флуорохром с гасителем. Нами было решено эксплуатировать другой принцип. Последовательность олигонуклеотида Colzo была нами подобрана так, что помимо участка, обеспечивающего гибридизацию с фрагментом ДНК, несущим снип, она содержала еще место для отжига праймера HV313 и участок, идентичный последовательности петли рибобикона МВ2.
При амплификации катящимся кольцом происходил синтез цепи, смещающий предыдущую на комплементарную исходному кольцу, на которой через равные промежутки образовывались участки для отжига рибобикона МВ2. По мере удлинения продукта амплификации мест отжига рибобикона становилось все больше, одновременно с этим процессом термостабильная РНКаза Н (при использовании Bst полимеразы) расщепляла рибобиконы на образующихся ДНК-РНК-участках, освобождая последние для связывания новых молекул МВ2 (рис. 3.23). Таким образом происходит постепенное накопление флуоресцентного сигнала (рис. 3.24 и 3.25). ДНК полимераза рЫ29, обладающая слабой 3 -экзонуклеазной активностью, даже в отсутствие праймера производит наработку продукта, используя, по всей видимости, в качестве затравки присутствующий в смеси олигонуклеотид EcorU, что для модельного эксперимента не имеет особого значения. В этом отношении Bst ДНК полимераза, не имеющая экзонуклеазной активности, нарабатывает продукт только в присутствии праймера. Использование непролигированного олигонуклеотида Colzo приводит к ожидаемому результату: отсутствию наработки продукта вследствие отсутствия кольцевой матрицы и невозможности для ДНК полимеразы смещать старую цепь. Таким образом, успешная детекция снипов определяется исключительно стадией лигирования. При гибридизации встык на позициях снипа лигирование должно протекать только в случае полной комплементарности. Некоторым недостатком этого подхода к анализу снипов является необходимость синтеза довольно длинного олигонуклеотида, точнее их комплекта, несущих на своих З -концах дискриминирующие нуклеотиды. С целью удешевления данного подхода при сохранении его высокой чувствительности и специфичности нами был разработан способ, как обойти данное затруднение. По существу термины «С»-проба или проба «висячего замка», где роль дужки выполняет анализируемый фрагмент ДНК, не совсем верно отражают реальную ситуацию с пространственным расположением концов фрагментов ДНК в данном методе. Очевидно, что при лигировании 5 - и 3 -концы олигонуклеотида-пробы смыкаются, образуя полное кольцо с «ником», а никак не «С»-структуру. Однако, если дискриминирующий нуклеотид расположить не на длинном олигонуклеотиде, а на относительно коротком дополнительном фрагменте, заполняющим «свободный» промежуток, то проба может действительно называться «С»-пробой и стать одинаковой для всех анализируемых вариантов нуклеотидов в том или ином снипе. Тем самым снизятся затраты на ее синтез для анализа разных нуклеотидов в снипе, тем более если работать с четырехаллельными. При этом число мест лигирования возрастет с одного до двух, что на самом деле не принципиально, и наши эксперименты это наглядно показали. Для проверки работоспособности предложенного метода детекции снипов нами были синтезированы дополнительные олигонуклеотиды HV12 и HV12g с дискриминирующими нуклеотидами С и G на З -концах соответственно, а также новая ДІЖ мишень EcHV. Она содержит последовательность, полностью комплементарную дополнительной вставке HV12.
![Вариантная анатомия подъязычной кости и возможности ее применения в идентификации личности [Электронный ресурс]](/i/i/4314/177175.png "Вариантная анатомия подъязычной кости и возможности ее применения в идентификации личности [Электронный ресурс] Мальцева Надежда Леонидовна")
